內質網應激相關凋亡信號在肥胖小鼠盆底肌損傷中的作用

陳 玨 洪 莉 李素廷 王 治 郝夢磊 陳 茂 肖 雅 黃筱雨

武漢大學人民醫院婦產科 湖北 武漢 430060

女性壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是常見于中老年婦女的慢性疾病，我國女性壓力性尿失禁總體發病率為18.9%［1］。研究表明體質量增加和肥胖是女性壓力性尿失禁發生的獨立危險因素［2，3］。多項流行病調查研究證實了肥胖與SUI 的 相 關 性［4-7］，體 質 量 指 數（BMI）每 增 加5 kg/m2，SUI 發生風險增加20%～70%［4，6］，且減重可有效改善SUI 癥狀［8，9］。肥胖加重女性SUI 發生發展的主要觀點之一是肥胖引起的慢性腹內壓增加會對盆底產生病理性壓力，研究表明女性BMI 每增加1 kg/m2或腹圍增加2 cm，將導致腹壓增加0.4 cmH2O 左右［10］，通過影響盆底肌的結構和力量削弱尿道周圍支持組織［11］。另有研究表明飽和脂肪酸對于肌肉細胞的直接損傷作用，如棕櫚酸酯導致神經酰胺和甘油二酯等有毒的脂質中間體在細胞中的聚集，通過抑制蛋白質合成及阻遏PKB/Akt等信號通路傳導，導致肌肉萎縮［12，13］。當盆底肌受損時，使尿道受壓的吊床結構層力量將不足以在腹壓增高時維持尿道閉合壓，從而發生漏尿。肥胖與SUI 固然相關，但肥胖患者的盆底肌中的病理生理學變化卻不明確，高游離脂肪酸對于盆底肌肉的直接損傷作用及作用機制有待進一步探究。

本研究通過對公共基因芯片數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中 基 因 表 達 數 據 集GSE6766 進行分析，篩選出棕櫚酸處理小鼠C2C12肌管后的差異基因和重要相關信號通路，并在小鼠體內和體外驗證相關基因和蛋白的表達。構建高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型及棕櫚酸（palmitic acid，PA）處理的小鼠成肌細胞C2C12 肌管，觀察盆底肌的橫截面積變化，檢測盆底肌及C2C12 肌管中內質網應激相關蛋白的表達，以期揭示肥胖狀態下盆底肌的變化及游離脂肪酸升高導致盆底肌損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞及動物 小鼠成肌細胞C2C12 購于南京科佰生物有限公司。7～8 周齡雌性處鼠購于武漢大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（鄂）2017-0012，體質量18～20 g，平均體質量（19.13±0.87）g。

1.1.2試劑 CHOP 抗體（66741-1-Ig，Proteintech）；Laminin 抗 體（23498 -1 -AP，Proteintech）；DDIT3（DNA Damage Inducible Transcript 3）、GRP78（Glucose regulatory protein 78）及β-actin 引物購于生工生物工程（上海）公司，DDIT3及GRP78引物序列見表1；棕櫚酸鈉（palmitic acid sodium）購于Sigma公司；牛血清白蛋白BSA-Ⅴ（不含脂肪酸）購于索萊寶生物技術公司；DMEM 培養基、胎牛血清、馬血清、青-鏈霉素及胰酶購自Gibco（美國）；TRIzol（code No.9108，寶日新生物公司）；HifairTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus，11123ES）、HieffTM qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox Plus，11202ES）及PAGE 凝膠快速制備試劑盒購自上海翊圣生物公司。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.1.3儀器 新正置熒光顯微鏡（Olympus Corp，日本東京），ChemiDoc 成像系統及熒光定量PCR 檢測系統（BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1生物信息學分析 在GEO 數據庫中下載GSE6766 高通量測序數據集，使用數據庫中的GEO2R 在線分析工具篩選出差異基因，篩選標準為P＜0.05 且倍數變化（fold change，FC）對數值的絕對值|log2FC|＞2。使用R 語言軟件分析差異表達基 因（Differentially Expressed Genes，DEGs），ggplot2 和pheatmap 程序可視化生成熱圖與火山圖，clusterprofiler 程序對DEGs 進行基因本體論（Gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路分析，得到DEGs 的細胞組分、生物過程和分子功能以及高脂誘導C2C12 細胞的關鍵通路。

1.2.2PA 的配制 于100 ℃金屬浴中將一定量PA 溶解于去離子水中，配置成0.2 mol/L 溶液。在60 ℃水浴中將BSA 溶解于DMEM 培養基配制2%的BSA 溶液。將上述PA 溶液與BSA 溶液按1∶99的體積比趁熱混勻，配成2 mmol/L 的PA 儲存液。

1.2.3實驗動物分組及處理 選取SPF 級健康7～8 周齡的C57BL/6 雌性處鼠10 只，將雌性處鼠隨機分為2 組，分別為普通飼養組和高脂飼養組，每組5 只，組間小鼠周齡、體質量差異均無統計學意義（P＜0.05）。使用普通飼料（12 kCal%脂肪，協同生物）和高脂飼料D12492（60 kcal%脂肪，華阜通）連續喂養20 周構建肥胖小鼠模型。以上小鼠飼養于武漢大學人民醫院實驗動物中心，本研究符合動物保護、動物福利和倫理原則以及國家實驗動物倫理福利的相關規定，并獲得武漢大學人民醫院倫理委員會批準。

采用頸椎脫位法處死小鼠之前取眼球放血，分離周圍組織暴露肛提肌，沿骨盆及脊柱周圍用手術刀小心剝離盆底肌組織，具體步驟參照本課題組之前的研究［14］。取一側盆底肌置于4%多聚甲醛中固定24 h，用石蠟包埋；另一側盆底肌保存于-80 ℃，后續提取組織蛋白進行檢測。

1.2.4細胞培養與研究設計 將C2C12 小鼠成肌細胞均勻鋪種至6 孔板中，在37 ℃、含5% CO2的培養箱中培養。使用含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素的高糖DMEM 培養基促進C2C12 小鼠成肌細胞增殖，當細胞密度達到80%～90%后更換含2%馬血清及1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM 培養基，誘導C2C12 細胞分化。待分化第4～5 天時細長多核肌管形成時，使用不同濃度PA（0、250、500、750 μmol/L）干預24 h 后，提取細胞蛋白及RNA 進行檢測。

1.2.5免疫熒光染色 石蠟包埋的盆底肌組織切片經60 ℃烘片2 h，二甲苯分別脫蠟30 min 和10 min，濃度梯度乙醇復水，枸櫞酸鈉抗原修復液及微波加熱進行抗原修復，3% 雙氧水避光封閉15 min；山羊血清37 ℃溫箱封閉30 min；然后用稀釋比為1∶200 的Laminin β1 一抗于4 抗濕盒內封閉過夜，1∶150 稀 釋 的FITC-羊 抗 兔 二 抗37 ℃孵 育30 min，DAPI 室溫復染核5 min，滴加抗熒光淬滅封片劑封片，最后于正置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6蛋白質提取及濃度測定 提取組織蛋白時，將盆底肌組織從-80 ℃取出，采用液氮研磨法將組織 磨 成 粉 末，加 入cocktail 與RIPA 比 例 為1∶100 的混合蛋白裂解液，裂解20 min。冰上超聲30 s，12 000 r/min 離心10 min，取上清。提取細胞蛋白時，將6 孔板內液體完全吸干，每孔加入50 μL 混合蛋白裂解液，然后用細胞刮匙將細胞輕柔刮下，冰上裂解超聲。采用BCA 法檢測各組樣品蛋白濃度，按比例加入5×蛋白上樣緩沖液，混勻后100 ℃金屬浴加熱8 min，制備好的蛋白樣品置于-4 ℃短暫保存。

1.2.7Western Blot (WB) 使用PAGE 凝膠快速制備試劑盒配置凝膠，上樣，電泳：在電壓80 V 恒壓條件下約20 min 跑完濃縮膠；120 V 約1 h 跑完分離膠。電轉：于電流200 mA 恒流冰水混合低溫條件下電轉80 min，將蛋白從凝膠轉印至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉常溫封閉30 min，稀釋比為1∶1 000 的一抗CHOP（Proteintech，66741-1-Ig）于4 ℃搖床上過夜孵育，二抗常溫孵育1 h，ECL 化學發光液顯像，最后于BioRad 化學發光儀上顯色。

1.2.8實時熒光定量PCR 使用TRIzol 提取細胞中的總RNA，測定RNA 濃度及純度，使用HifairTM1stStrand cDNA Synthesis SuperMix for RTqPCR 將樣品RNA 逆轉為cDNA，使用HieffTMqPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox Plus）進行實時熒光定量PCR 反應。每個實驗重復3 次，以β-actin 為參考基因，2-ΔΔCt法計算基因表達水平。

1.2.9統計學分析 用Image Lab 軟件獲取WB條帶灰度值，Image J 軟件統計肌纖維橫截面積，GraphPad Prism 7.0 軟件進行數據分析。t檢驗進行兩組間比較，單因素方差分析進行多組間樣本均數分析。檢驗標準為α=0.05，P＜0.05 視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 棕櫚酸處理C2C12 肌管后的DEGs 分析對數據集GSE6766 進行處理分析，鑒定出468 個DEGs，其中上調基因273 個（58.3%），下調基因195個（41.7%）（圖1A）。差異基因表達以熱圖形式可視 化，其 中 CRELD2、HSPA1B、HERPUD1、MANF、SDF2L1 在未折疊蛋白質反應中起作用（圖1B）。對DEGs 進行GO 富集分析發現，DEGs的細胞組成主要富集在細胞外基質、膠原和內質網腔（圖2A）；分子功能主要富集在細胞外基質結構成分、受體配體活性和細胞因子活性等（圖2B）；生物過程主要富集在對拓撲錯誤蛋白質的反應、對氧化應激的反應及對內質網應激的反應（圖2C）；KEGG信號通路主要富集于IL-7 信號通路、谷胱甘肽代謝和內質網中的蛋白質加工（圖2D）。

圖1 數據集GSE6766 中DEGs 的表達情況

圖2 數據集GSE6766 中DEGs 的富集分析

2.2 高脂飲食誘導小鼠盆底肌萎縮及CHOP 蛋白表達增加在相同環境下，分別用普通飼料和高脂飼料連續飼養小鼠20 周，誘導肥胖小鼠模型。取小鼠盆底肌進行石蠟包埋切片后，使用層黏連蛋白對肌肉切片染色，鏡下觀察肌肉形態并用Image J 軟件對肌纖維橫截面積（CSA）進行統計。結果發現與普通飼養組相比，高脂飼養組小鼠的盆底肌橫截面積減?。▓D3A），差異具有統計學意義（P＜0.000 1）（圖3B）。取小鼠盆底肌于液氮下研磨，提取組織蛋白進行免疫印跡分析，結果發現高脂組小鼠盆底肌中CHOP 蛋白表達增加（圖3C），差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖3D）。

圖3 小鼠盆底肌層黏連蛋白染色及CHOP 蛋白表達

2.3 PA 處理的C2C12 細胞中內質網應激相關基因及蛋白表達增加取小鼠C2C12 成肌細胞分化第4～5 天時形成成熟的肌管，用濃度分別為0、250、500 與750 μmol/L 的PA 處 理 肌 管24 h 后，提 取 細胞RNA 及蛋白質進行分析。主要測量指標為內質網應激相關的凋亡蛋白CHOP 以及編碼CHOP 蛋白的基因DDIT3 mRNA 表達水平。結果發現PA誘導肌管中CHOP 蛋白表達升高（圖4A），升高趨勢呈劑量依賴性，用藥劑量達到500 μmol/L 時蛋白表達具有差異性（圖4B）。PA 誘導肌管中CHOP 及GRP78 的基因表達升高，用藥劑量達到500 μmol/L時蛋白表達具有差異性（圖4C）。

圖4 濃度梯度的PA 處理后小鼠C2C12 肌管中CHOP 蛋白、CHOP 及GRP78 mRNA 表達

3 討論

近幾十年來，由于社會生活方式變化及生活壓力增加，導致食品供應結構及質量的改變如高能量食物攝入過多，以及生活方式改變如運動減少［15］，能量正平衡引起脂肪堆積，將導致腹型肥胖的形成［16，17］。 從1975 年 到2016 年，全 球 女 性 超 重（BMI≥25 kg/m2）的流行率由24%增至約40%，女性 肥 胖 患 病 率（BMI≥30 kg/m2）由7% 增 加 到16%［18］。肥胖是多種慢性疾病的危險因素，肥胖引起的壓力性尿失禁隨著肥胖人群的增多，日益成為社會不可忽視的健康問題。

盆底肌是維持盆底功能的強大支撐結構，若盆底肌肉薄弱或發生功能障礙，導致盆底支持結構缺陷時，將無法維持膀胱和尿道的正常解剖位置，從而導致壓力性尿失禁［19］。研究表明壓力性尿失禁患者的盆底肌形態學改變為肌纖維密度降低、排列紊亂、結締組織填充取代、炎性細胞浸潤等改變［20］。探究肥胖狀態下高游離脂肪酸對盆底肌產生的損傷及其機制，以期對其中的病理生理學過程進行干預，有助于改善患者的癥狀，提高患者的生活質量。

骨骼肌中具有復雜的內質網結構，是蛋白質合成、折疊與分泌的重要位點，可幫助骨骼肌應對日常的機械及代謝壓力。內源或外源刺激會導致內質網的蛋白錯誤折疊、未折疊蛋白在內質網腔內聚集以及Ca2+平衡紊亂，所引起的細胞應激狀態被稱為內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。細胞通過非折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）來清除內質網中錯誤折疊蛋白并維持內質網穩態，即從內質網向核內發出信號轉導的自身保護性機制，被稱為ERS 反應［21］。非應激狀態下，ERS 信號傳導的3 個內質網跨膜效應蛋白：肌醇需求酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α），ER駐 留 的PKR 類eIF2α 激 酶（ER-resident PKR-like eIF2α kinase，PERK）以及活化的轉錄因子（activated transcription factor，ATF6）與GRP78 結合，活性受到抑制；而當內質網應激狀態超過內質網處理能力時，GRP78 與IRE1α、PERK 及ATF6 分離，三個效應蛋白活化，進而觸發ERS 的信號傳導［22］，清除錯誤折疊蛋白。若內質網應激無法逆轉，內質網跨膜效應蛋白的持續表達將上調CHOP 等凋亡相關的基因的表達［23］。CHOP 信號可改變參與細胞凋亡和氧化應激的基因的轉錄，其次通過解除PERK介導的翻譯抑制來介導細胞死亡信號，從而增強促凋亡蛋白的翻譯［24］。

在本研究中，首先通過生物信息學分析發現PA 刺激小鼠C2C12 肌管可誘導內質網應激相關基因的表達及通路富集；然后構建高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型進行體內驗證，發現高脂喂養的肥胖小鼠盆底肌橫截面積減小，盆底肌中內質網應激相關凋亡蛋白CHOP 表達增加；最后采用PA 處理的小鼠C2C12 肌管的細胞模型，發現CHOP 蛋白、編碼CHOP 蛋白的DDIT3 基因以及GRP78 基因的mRNA 表達與PA 存在劑量反應效應。

既往研究表明肥胖狀態下脂質的過度負荷可破壞內質網的穩態，引起內質網功能紊亂［25］，生物信息學分析結果也將研究方向聚焦于內質網應激相關信號通路。PA 與GRP78 及DDIT3 基因表達的劑量反應效應，一方面表明游離脂肪酸會激活細胞的內質網應激，另一方面隨著游離脂肪酸的濃度增加，內質網應激狀態超過生理調控能力，將通過CHOP 凋亡信號介導細胞死亡，產生不利后果。肥胖小鼠盆底肌萎縮、橫截面積減小、CHOP 蛋白表達增加，表明高脂飲食誘導的肥胖對小鼠盆底肌的損傷作用可能是由于高游離脂肪酸誘導肌肉細胞產生無法逆轉的ERS，最終引發細胞死亡。綜上結果可說明ERS 相關凋亡參與了肥胖小鼠盆底肌的損傷過程，調控ERS 信號轉導相關通路對肥胖引起的壓力性尿失禁具有積極的防治意義。