REM 睡眠剝奪對帕金森病大鼠識別記憶損害的影響及與AQP4 蛋白表達的相關性

徐 敏 沈 磊 黃朝云 楊 英

1武漢大學中南醫院綜合醫療科 湖北 武漢 430071；2武漢大學第二臨床學院 湖北 武漢 430071；3暨南大學附屬第一醫院神經內科 廣東 廣州 510630

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是以黑質多巴胺能神經元變性為病理特征的神經退行性疾病。研究發現，α-突觸核蛋白的過度沉積和毒性是導致多巴胺能神經元變性的主要原因［1］。流行病學數據顯示，約25%的初診PD 患者存在輕度認知損害，80%的PD 患 者 最 終 發 展 為 癡 呆［2，3］。黑 質 內α-突觸核蛋白（α-synuclein）的沉積以運動障礙為主要表現，而黑質外α-突觸核蛋白的聚集和沉積與PD 的非運動癥狀相關［4］。因此，減少α-突觸核蛋白的聚集與沉積可能是延緩和預防PD 相關認知損害的重要靶點。

水通道蛋白-4（aquaporin-4，AQP4）是類淋巴通路清除中樞神經系統代謝廢物的重要通道蛋白［5-7］。睡眠對類淋巴通路清除神經毒性蛋白如淀粉樣蛋白-β 的影響已在阿爾茨海默病動物模型中得到證實，睡眠狀態下類淋巴通路的清除效率明顯高于覺醒狀態［5，8-10］。然而，睡眠與PD 相關認知損害的關系尚不明確。既往研究中，快速眼動（rapid eye movement，REM)睡眠剝奪（REM sleep deprivation，REMSD）對PD 患者認知功能的影響結論不一［11-14］。本研究建立PD 大鼠模型及應用REMSD干預，觀察REMSD 對PD 大鼠認知功能的影響；并進一步探討REMSD 與PD 大鼠海馬和皮層中α-突觸核蛋白及AQP4 蛋白表達的關系，旨在為PD 相關認知損害的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物體重200～230 g 雄性Sprague-Dawley 大鼠，在室溫22～25 ℃，光照條件為黑暗12∶12（即晚8 點關燈至早8 點開燈）的環境下飼養，大鼠籠內自由獲取水和食物。

1.2 實驗設計單側立體定向黑質內注射6-羥多巴 胺（6-OHDA）建 立PD 大 鼠 模 型［15］，假 手 術 組（sham）以同樣方法立體定向注射抗壞血酸鹽溶液。定向注射后4 周（第28 天），采用旋轉試驗評估PD模型是否成功。第29 天，以REMSD 干預1 周或維持正常睡眠并分為4 組：（1）假手術組（sham，n=6）；（2）REMSD+假手術組（sham+REMSD，n=6）；（3）正常睡眠的PD 大鼠組（PD，n=6）；（4）REMSD干預的PD 大鼠組（PD+REMSD，n=6）。第35 天，所有大鼠進行新物體識別（novel object recognition，NOR）實驗。實驗結束后取腦行蛋白質印跡和免疫熒光分析檢測大鼠海馬和皮層中α-突觸核蛋白及AQP4 蛋白的表達水平。

1.3PD 建模將大鼠以 10% 水合氯醛（350 mg/kg，i.p.）麻醉后固定于立體定位架，選擇左側黑質致密物（SNc）為靶部位行立體定位注射（圖1），坐標為前囟后（5.0±0.2）mm，矢狀線左側（1.7±0.1）mm，顱骨表面下（7.6±0.1）mm［16］。以1 μL/min 速 度 泵 控 注 射4 μL 6-OHDA 5 min（2 μg/μL，8 μg 6-OHDA 溶解于4 μL 0.02%抗壞血酸鹽溶液）（n=12），假手術以同樣方法注射4 μL 0.02%抗壞血酸鹽溶液（n=12）。

圖1 大鼠顱內定位注射6-OHDA 部位示意圖

1.4 PD 模型評價立體定向注射6-OHDA 后4 周（第28 天），皮下注射阿撲嗎啡（0.1 mg/kg）誘導大鼠的旋轉行為，10 min 后待大鼠旋轉穩定，記錄30 min 內大鼠向毀損對側連續旋轉的次數。每周測定1 次共4 周，以平均轉數大于7 r/min 的SD 大鼠視為建模成功，同時觀察其是否伴有震顫、活動遲緩、豎毛等異常行為。

1.5 REMSD采用改良多平臺法［17］進行：在裝有15 個直徑6.5 cm 圓柱形平臺的水槽（127 cm×44 cm×45 cm）中加水至平臺高出水面約1 cm，將大鼠隨機置于平臺上，水和食物置于水箱頂部的網格上。大鼠在平臺上站立可進入NREM 睡眠，當進入REM 睡眠時，全身骨骼肌張力顯著降低、頸部肌張力降低引起節律性低頭、觸水，從而無法進入REM 睡眠，上述過程訓練1 周。

1.6 NOR 實驗立體定向注射5 周后（第35 天），采用NOR 實驗評估大鼠的識別記憶，其特點是與熟悉的物體（樣本物體）相比，大鼠更傾向于與新物體互動［18］（如圖2A）。NOR 實驗在安靜的低亮度條件下進行，實驗裝置為白色敞口箱（50 cm×40 cm×40 cm），要辨別的物體是白色的斑點杯和彩色的玻璃瓶。正式測試前，讓所有大鼠熟悉裝置環境以減少它們對新環境（實驗箱裝置環境）的壓力。適應過程中，允許大鼠在裝置內無物體的情況下自由探索周圍環境，每次10 min，連續2 d。第2 天熟悉環境結束后，裝置內加入兩個相同的物體，再次將大鼠置于實驗裝置中，允許其對這兩個相同的物體進行10 min 探索。間隔1 h 后，將兩個樣本物體取出，將其中一個樣本物體清洗干凈后放回原處，另一相同位置處用一新物體替換。然后將大鼠放回裝置中進行5 min 探索。用秒表測量探索每個物體的時間和探索兩個物體的總時間。每次試驗后，這些物體都用70%的乙醇徹底清洗。安裝在測試箱上方天花板上的攝像機記錄大鼠的行為。大鼠在2 cm以內的距離將鼻子指向物體和/或用鼻子觸摸物體被視為探索，辨別率定義為TN/（TN+TF），其中TN 為探索新物體的時間，TF 為探索樣本物體的時間。

1.7 組織準備NOR 實驗后，所有大鼠用10%水合氯醛溶液腹腔注射進行麻醉（350 mg/kg，i.p.）。斷頭取腦，分離出皮層和海馬組織并置于液氮中冷凍，并在-80 ℃保存用于免疫印跡分析。免疫組化分析時，大鼠麻醉后經心臟快速灌注生理鹽水將血液從心臟血管中清除，然后用4%多聚甲醛（稀釋于0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7.4）繼續灌注對腦組織進行內固定，取出腦組織并立即在4%多聚甲醛中固定至少24 h。然后將樣品脫水并包埋于石蠟中，最后進行石蠟切片（從前到后冠狀面切片），切片厚度5 μm。

1.8 蛋白質免疫印跡按蛋白提取試劑盒說明書操作，從海馬和皮層組織中提取蛋白質。取蛋白質樣品（約20 μg）用12%SDS-PAGE 凝膠電泳分離，在200 mA 下轉印到0.45 μm PVDF 膜上1 h，用麗春紅染色以確定轉膜效果。室溫下，將轉印后的PVDF 膜浸置于濃度為5% 的脫脂牛奶［用含0.1%Tween20 的Tris 緩沖鹽水（TBST）稀釋］中封閉1 h。隨后將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜。一抗為 抗α-synuclein 抗 體（Abcam，Cambridge，MA，USA；1∶1 000 稀釋）和抗β-actin 抗體（Santa Cruz，Dallas，USA，TX，1∶2 000 稀釋）。之后在過氧化物酶偶聯的二抗（抗小鼠抗體1∶10 000 TBST 稀釋，KPL，Gaithersburg，MD，USA）中孵育30 min 后，應用化學發光法觀察印跡，通過光學密度儀對膠片上的免疫反應條帶進行半定量分析。

1.9 免疫熒光石蠟切片經3%H2O2室溫淬滅后，在45 ℃1 mol/L HCl 中 孵 育30 min 使DNA 變 性，置于10 mmol/L 檸檬酸鈉緩沖液（pH=6）中，92～98 ℃保存20 min，用于抗原提取。加入一抗（抗AQP4，Abcam，1∶200；或 抗α-synuclein，Abcam，1∶200）在4 ℃下孵育過夜，然后用過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗（1∶200）在37 ℃下孵育30 min。切片暴露于DAB 和蘇木精染色，同時制備陰性和陽性對照品，用光學和熒光顯微鏡觀察切片。采用Image J 圖像分析軟件獲得AQP4 或α-突觸核蛋白免疫染色陽性細胞的平均光密度（IOD）值。

1.10 統計學分析所有數據以均數±標準誤表示，應用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計分析，P＜0.05 為有統計學差異。采用雙因素方差分析評價NOR 實驗中各組大鼠對樣本物體或新物體探索時間的差異，然后采用Bonferroni 法進行多組比較。采用單樣本t檢驗來確定辨別率是否與概率（50%）有顯著差異。所有其他數據均采用單向方差分析后再應用Bonferroni 檢驗。

2 結果

2.1 REMSD 對4 組大鼠識別記憶的影響4 組大鼠在訓練結束1 h 內探索新物體的時間均長于探索樣本物體的時間，只有假手術組（sham）大鼠探索新物體和樣本物體時間的差異有統計學意義（sham組，P＜0.01；PD+REMSD 組，P=0.076）（如圖2B）。4 組大鼠對新物體辨別率的差異如圖2C 所示，sham 組和PD+REMSD 組大鼠對新物體的辨別率顯著高于50%（sham 組和PD+REMSD 組，P＜0.05；sham+REMSD 組，P=0.07）。

圖2 REMSD 對各組大鼠識別記憶的影響

2.2 REMSD 對4 組大鼠皮層與海馬中α-突觸核蛋白表達的影響蛋白質免疫印跡（圖3）和免疫熒光分析（圖4）結果顯示，PD 組大鼠皮層（cortex，圖3B 和4B）與海馬（hippocampus，圖3C&4C）中α-突觸核蛋白的表達水平均顯著高于sham 組（P＜0.01）。PD+REMSD 組大鼠皮層（cortex，圖3B，P＜0.01；圖4B，P＜0.05）和 海 馬（hippocampus，圖3C，P＜0.05；圖4C，P=0.052 3）中α-突觸核蛋白的表達水平明顯低于PD 大鼠；而sham 組與sham+REMSD 組大鼠皮層和海馬中α-突觸核蛋白的表達水平無統計學差異（P＞0.05）。

圖3 REMSD 對各組大鼠皮層與海馬中α-突觸核蛋白表達的影響

圖4 免疫熒光分析REMSD 對各組大鼠皮層與海馬中α-突觸核蛋白表達的影響

2.3 REMSD 對4 組大鼠皮層與海馬中AQP4 表達的影響如圖5 所示，REMSD 干預后的PD 大鼠皮層（cortex）和海馬（hippocampus）中AQP4 蛋白的表達水平明顯高于正常睡眠的PD 大鼠（圖5B 和5C，P＜0.05）；而sham 組 與sham+REMSD 組 大 鼠 的皮層和海馬中AQP4 蛋白的表達水平無統計學差異（P＞0.05）。

圖5 REMSD 對各組大鼠皮層與海馬中AQP4 蛋白表達的影響

3 討論

本研究發現，REMSD 干預后的PD 大鼠其識別記憶優于正常睡眠的PD 大鼠；REMSD 干預后的PD 大鼠皮層和海馬中α-突觸核蛋白的沉積明顯少于正常睡眠的PD 大鼠。同時，REMSD 干預后的PD 大鼠皮層和海馬中AQP4 蛋白的表達水平明顯高于正常睡眠的PD 大鼠。

α-突觸核蛋白是分子質量約14～20 kU 的內源性蛋白，定位于突觸前多巴胺能神經元內［1］。研究顯示，α-突觸核蛋白的聚集與沉積可致多巴胺能神經變性［1］，PD 相關的認知損害與黑質外α-突觸核蛋白的聚集與沉積有關［4］。本研究中，6-OHDA 處理后的大鼠皮層與海馬中α-突觸核蛋白的表達水平明顯高于假手術組，提示PD 大鼠建模成功。同時，PD 大鼠的識別記憶明顯差于假手術組，與既往研究的結果一致［19］，表明α-突觸核蛋白的過度聚集與沉積與PD 相關的認知損害有關。

睡眠可調節海馬區神經元的可塑性與神經發生，與記憶的編碼和鞏固密切相關［20，21］。本研究中，REMSD 干預后的健康大鼠的識別記憶較正常睡眠的健康大鼠差，但該差異無統計學意義；而REMSD干預后的PD 大鼠的識別記憶優于正常睡眠的PD大鼠。睡眠對認知的影響在阿爾茨海默病動物模型中已得到證實，但REM 睡眠與PD 相關認知損害的關系仍存在爭議。有研究［11］報道，REMSD 和多巴胺D2 受體可調節和改善PD 大鼠的識別記憶；也有研究報道，REMSD 通過阻斷多巴胺D2 受體導致PD 動物模型產生認知損害［12，14］。本研究的結果提示，REMSD 對PD 和健康腦認知功能的影響可能存在差異，REMSD 對PD 認知功能的影響程度可能與不同的認知任務有關。

本研究中REMSD 干預后的PD 大鼠的識別記憶損害程度輕于正常睡眠的PD 大鼠，與皮層和海馬中α-突觸核蛋白的沉積減少、AQP4 蛋白的表達增加有關。如前所述，α-突觸核蛋白的過度聚集與沉積與PD 相關的認知損害有關。研究證實，睡眠可影響類淋巴通路對神經系統毒性代謝產物的清除［5-10］。睡眠對類淋巴系統清除神經毒性蛋白聚集（如淀粉樣蛋白-β）的影響，在阿爾茨海默病動物模型中已得到證實。AQP4 表達于星形膠質細胞終足，是類淋巴通路中清除神經系統毒性產物（如淀粉 樣 蛋 白-β，tau 蛋 白）的 重 要 通 道 蛋 白［5-7，9，10］。REMSD 是否通過AQP4 啟動類淋巴通路清除α-突觸核蛋白改善PD 相關的認知損害尚需進一步研究。

綜上所述，REMSD 可降低PD 相關認知損害，與皮層和海馬中α-突觸核蛋白表達減少及AQP4 蛋白表達增加相關。REM 睡眠及AQP4 蛋白表達的調控對改善PD 相關認知損害的作用與機制有待進一步研究闡明，可能為延緩PD 相關認知損害的進展提供新的治療靶點。