同種屬來源一抗在乳腺癌量子點多標記熒光染色中的應用

徐 千 陳媛媛 王林偉 熊 斌

1腫瘤生物學行為湖北省重點實驗室/湖北省腫瘤醫學臨床研究中心 湖北 武漢 430071；武漢大學中南醫院 2胃腸外科，3腫瘤放化療科 湖北 武漢 430071

多標記熒光染色技術是利用不同發射波長的熒光染料，通過抗原抗體反應或生物親和反應等方法，同時標記多個靶標分子，實現多靶標的實時成像和分析的染色技術，是基礎研究和臨床診斷中實現多分子成像和分析的重要工具［1，2］。目前，熒光染色中廣泛使用的熒光染料包括熒光蛋白和小分子有機熒光染料，上述傳統的熒光染料存在光化學穩定性差、激發光譜窄、發射光譜寬等缺點，且需要不同波長的激發光進行激發，存在發射光譜交疊和紅色拖尾等現象，難以進行實時的多分子成像［3，4］。與之相比，量子點（quantum dots，QDs）作為一種具有優良光學性能的半導體納米晶體，具有一元激發多元發射、抗光漂白和化學降解強、熒光強度高、發射光譜窄且對稱、不易出現光譜重疊等優勢，常用于多靶標分子的研究［5-7］。然而，當靶標一抗種屬來源相同時，多標記熒光染色會出現交叉反應，限制了其在多分子成像中的應用。

本研究擬使用多色QDs 對浸潤性乳腺癌組織中細胞角蛋白（cytokeratin，CK）、人類表皮生長因子受 體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）、雌激素受體（estrogen receptor，ER）進行實時成像，探討QDs 多標記染色的優勢，并對如何避免同種屬來源一抗的交叉反應等問題進行分析討論，從而建立同種屬來源一抗間接法三標記QDs 熒光染色方案。

1 材料與方法

1.1 主要試劑一抗：小鼠抗人CK 單克隆抗體、兔抗人ER 單克隆抗體購自Dako 公司，兔抗人HER-2 單克隆抗體購自Cell Marque 公司。QDs 試劑：QDs-565 標記的山羊抗小鼠二抗、QDs-605 標記的山羊抗兔二抗、QDs-655 標記的山羊抗兔二抗購自Thermo Fisher 公司?？乖迯途彌_液（EDTA法）、EliVisionTMplus Polyer HRP 二抗試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。QDs 和常用熒光染料的激發與發射光譜見圖1。

圖1 QDs 和常用熒光染料的激發與發射光譜

1.2 組織切片28 例浸潤性乳腺癌（非特殊類型）患者的乳腺癌組織標本收集于武漢大學人民醫院，組織標本經4%中性甲醛液固定，常規石蠟包埋，4 μm 厚連續切片。28 例乳腺癌組織標本主要包括：CK（+），HER-2（陽性），ER（+）10 例；CK（+），HER-2（陽性），ER（-）7 例；CK（+），HER-2（-）8 例，ER（+）；CK（+），HER-2（陰性），ER（-）3 例。

1.3 免疫組織化學EliVision 二步法免疫組織化學染色采用EliVision 二步法進行。其中CK 的工作濃度為1∶200，HER-2 的工作濃度為1∶100，ER 的工作濃度為1∶100。CK（+）定義為低倍鏡下可見的胞質著色、ER（+）定義為＞1%的腫瘤細胞核染色、HER-2 陽性定義為＞10%的腫瘤細胞呈現細胞膜染色。

1.4 間接法單標記熒光染色間接法單標記熒光染色主要流程為：石蠟切片60 ℃烤片2 h，置入二甲苯中脫蠟3 次，每次5 min，梯度乙醇入水后，PBS 洗3 次，每次3 min。在高壓鍋內加入稀釋好的EDTA修復液（pH 8.0）進行加熱，煮沸后放入切片，繼續加熱至壓力閥開始噴氣，關閉壓力閥，4 min 后打開壓力閥停止加熱，切片冷卻至室溫。5%BSA 37 ℃封閉半小時，甩去BSA 后，每張切片上滴加50 μL一抗稀釋液，4 ℃過夜；PBS 洗3 次，每張切片上滴加50 μL QDs 標記二抗稀釋液，37 ℃下孵育1 h；PBS洗3 次，50%甘油封片后于CRi Nuance 多光譜成像系統下觀察拍照。其中一抗CK、HER-2、ER 工作濃度同1.3，二抗QDs-565、QDs-605、QDs-655 工作濃度1∶200。

1.5 間接法三標記熒光染色間接法三標記熒光染色過程如圖2A 所示。主要流程為：石蠟切片60 ℃烤片2 h，置入二甲苯中脫蠟3 次，每次5 min，梯度乙醇入水后，PBS 洗3 次，每次3 min，對抗原進行高壓熱修復（見1.4），5%BSA 37 ℃封閉半小時，甩去BSA 后，每張切片上滴加50 μL 小鼠抗人CK單克隆抗體和兔抗人HER-2 單克隆抗體的一抗混合液，CK 工作濃度1∶200，HER-2 工作濃度1∶100，4 ℃過 夜；PBS 洗3 次，每 張 切 片 上 滴 加50 μL QDs-565 標記的山羊抗小鼠二抗和QDs-655 標記的山羊抗兔二抗的二抗混合液，QDs-565 工作濃度1∶200、QDs-655 工作濃度1∶100，37 ℃下孵育1 h；PBS 洗3 次，每張切片上滴加50 μL 兔抗人ER 單克隆抗體的一抗稀釋液，ER 工作濃度1∶100，常溫下孵 育2 h；PBS 洗3 次，每 張 切 片 上 再 滴 加50 μL QDs-605 標記的山羊抗兔二抗的稀釋液，QDs-605工作濃度1∶200，常溫下孵育2 h，PBS 洗3 次；50%甘油封片后于CRi Nuance 多光譜成像系統下觀察拍照。

圖2 QDs 熒光染色和圖像采集分析

1.6 圖像采集和分析圖像采集和分析過程如圖2B→2D，在200 倍鏡下，使用裝備有CRi Nuance 多光譜成像系統（劍橋研究和儀器股份有限公司，美國）的Olympus BX51 熒光顯微鏡（奧林巴斯光學有限公司，日本），同時采集CK、HER-2、ER 的熒光光譜信息，采集參數為：采集光譜區間420 至720 nm，采集光譜間隔10 nm，曝光時間800 ms，采集的圖像保存為cube 格式。圖像采集完成后，使用CRi Nuance 多光譜成像系統內的軟件包進行CK、HER-2、ER 光譜信息的分離和分析。該過程包括以下3 個關鍵步驟。

（1）不同光譜值靶標的選擇：在CRi Nuance 多光譜軟件操作面板上，準確選擇CK（565 nm）、HER-2（655 nm）、ER（605 nm）三個靶標的區域和組織自發熒光（由軟件自動化設置）區域，分別將其定義為綠色、紅色、品紅色和藍色。

（2）靶標圖像的分離和組織自發熒光的消除：基于上述選擇的三個靶標的特定光譜，應用CRi Nuance 多光譜軟件將含有光譜信息的cube 圖像分離為4 個圖像，即綠色熒光信號的CK 圖、紅色熒光信號的HER-2 圖、品紅色熒光信號的ER 圖和藍色熒光信號的背景圖，通過該步驟，從靶標信號中消除組織自發熒光。

（3）靶標光譜信號的分析：應用CRi Nuance 多光譜系統自動化分析CK、HER-2、ER 光譜信號。

1.7 不同靶標分子的亞細胞定位分析從采集的熒光圖像中選取了具有代表性的單個乳腺癌細胞，對其軸徑進行劃線（黃色虛線），使用CRi Nuance 多光譜軟件的共定位分析（Co-localization）功能對軸徑上3 種靶標的熒光灰度值分布進行分析。以CK、HER-2、ER 3 種靶標的熒光信號的灰度值作為縱坐標，距黃色虛線起點距離作為橫坐標作散點圖，分析3 種靶標的亞細胞定位和在熒光圖像上的重疊情況。

2 結果

2.1 免疫組化染色和QDs 熒光染色免疫組化染色和QDs 熒光染色的結果如圖3 所示。免疫組化染色顯示CK、HER-2 和ER 分別表達于胞質、胞膜和胞核中，QDs 熒光染色經過Nuance 多光譜軟件分離后，其中的CK、HER-2、ER 三種靶標分別呈現綠色、紅色和品紅色熒光，而組織自發熒光呈現藍色，與靶標熒光分離清楚。免疫組化染色和QDs 熒光染色都能較清楚地顯示靶標的亞細胞定位和表達情況，QDs 熒光染色可以對背景熒光進行去除，顯示出靶標單獨的熒光信號。

圖3 免疫組化染色和QDs 熒光染色

2.2 不同CK、HER-2、ER 表達水平乳腺癌組織的熒光染色不同CK、HER-2、ER 表達水平乳腺癌組織的熒光染色如圖4 所示，“Multi”為CRi Nuance多光譜軟件采集的三靶標熒光圖像，“CK”、“HER-2”、“ER”分別為分離后的CK、HER-2、ER 熒光 圖 像。 圖4A1、4A2、4A3 和4A4 分 別 對 應CK（+）、HER-2（陽性）、ER（+），CK（+）、HER-2（陰性）、ER（+），CK（+）、HER-2（陽性）、ER（-）和CK（+）、HER-2（陰性）、ER（-）等4 種不同CK、HER-2、ER 表達水平的多標熒光圖像。經過Nuance 多光譜軟件分離后的圖像，可以清楚顯示CK、HER-2 和ER 的表達。CK 主要表達于胞質中，呈QDs-565 標記的綠色。HER-2 主要表達于胞膜上，呈QDs-655 標記的紅色。ER 主要表達于胞核中，呈QDs-605 標記的品紅色。藍色熒光圖像呈現組織的輪廓，代表組織自發成像。不同CK、HER-2 和ER 表達水平乳腺癌組織的熒光染色與患者原始的免疫組化結果一致。

圖4 不同CK、HER-2 和ER 表達水平的熒光染色

2.3 乳腺癌細胞中HER-2、ER、CK 的亞細胞定位為了研究三種靶標的亞細胞定位和在熒光圖像上的重疊情況，本研究從采集的熒光圖像中選取了單個乳腺癌細胞，對其軸徑進行劃線并使用CRi Nuance 多光譜軟件進行了亞細胞定位分析（圖5）。結果顯示，胞核中ER 的品紅色信號與胞膜上HER-2 的紅色信號、胞質中CK 的綠色信號在空間上分離清楚，相互交疊的部分較少。而胞膜上HER-2 的紅色信號與胞質中CK 的綠色信號在空間上存在小部分交疊，但可經CRi Nuance 多光譜軟件進行完全分離，顯示各自的亞細胞定位。

圖5 單個乳腺癌細胞中CK、ER 和HER-2 的亞細胞定位

3 討論

多標記熒光染色方法主要分為直接法和間接法兩種方法，直接法利用熒光染料直接標記多種抗體，對目標組織中的靶標分子進行顯色［8］。間接法則先通過不同一抗孵育靶標分子，再使用多種熒光染料標記的二抗與對應的一抗結合，對靶標分子進行顯色。與直接法多標染色相比，間接法多標染色具有特異性佳、敏感性好、操作簡單、性價比高等優勢，是目前多標記熒光染色的最常使用方法［9］。間接法多標染色中二抗與一抗Fc 段的結合是非特異性的，要求標記目標分子的一抗種屬來源不同，以避免二抗非特異性連接多個靶標一抗，造成交叉染色［10］。但在實際研究過程中，經常遇到一抗種屬來源相同的情況，限制了間接法多標記熒光染色的應用［11］。開發新型多標記染色技術，降低同種屬來源一抗交叉染色的影響，對基礎研究和臨床診斷具有重要意義。如圖1 所示，傳統熒光染料存在光化學穩定性差、激發光譜窄、發射光譜寬等缺點，需要不同波長的激發光進行激發，發射光存在光譜重疊和紅色拖尾等現象。因此，使用傳統熒光染料克服一抗種屬來源限制，進行間接法多標記熒光染色較為困難。而QDs 作為新型熒光材料，具有抗光漂白和化學降解強、熒光強度高等優勢，且QDs 的激發光譜寬、發射光譜窄，發射光譜不易重疊，可在一元激發下進行多色成像。同時使用多種QDs 標記靶標分子，發出的熒光信號較易進行分離［12，13］。因此，本研究利用多色QDs 對乳腺癌中CK、ER、HER-2 多個靶標進行了間接法熒光染色，證實了同種屬來源一抗多標記染色的可能性和應用效果。

本課題組之前的研究表明，對于單個靶標，QDs熒光染色和免疫組化染色均能顯示靶標的亞細胞定位和表達情況，染色結果有較好的相關性和一致性，這與本次研究的結果一致（圖3）［14，15］。隨后本研 究 利 用QDs-565、QDs-655 和QDs-605 三 種 顏 色的量子點對浸潤性乳腺癌組織中CK、HER-2 和ER三個靶標分子進行熒光染色，其中CK 一抗種屬為小鼠抗人，而HER-2 和ER 一抗種屬均為兔抗人，通過順序法先利用QDs-565、QDs-655 對CK、HER-2進行雙標記染色，再利用QDs-605 對同種屬的ER進行染色，并使用CRi Nuance 多光譜軟件采集熒光圖像。Nuance 多光譜軟件光譜分離后三靶標熒光染色結果顯示，綠色QDs-565 標記了主要表達于腫瘤細胞質的CK，呈現出癌巢的輪廓。而紅色QDs-655 和品紅色QDs-605 分別標記了表達于腫瘤細胞膜的HER-2 和細胞核的ER。兩種同種屬來源的一抗HER-2 和ER 未發生明顯的交叉反應，針對不同CK、HER-2 和ER 表達水平乳腺癌組織的熒光染色效果滿意（圖4）。對三種靶標的亞細胞定位分析顯示，胞核中ER 的品紅色信號與胞膜上HER-2的紅色信號和胞質中CK 的綠色信號在空間上分離清楚，未發生明顯光譜重疊現象。而胞膜上HER-2的紅色信號與胞質中CK 的綠色信號在空間上存在小部分交疊，但可經CRi Nuance 多光譜軟件進行完全分離，顯示各自的亞細胞定位（圖5）。

同種屬來源一抗發生交叉反應可由多種原因導致。第一，若第一輪二抗（二抗A）不足以封閉一抗（一抗A）所有的結合位點，第二輪二抗（二抗B）將與一抗A 余留的位點結合。針對這種情況，在第一輪染色過程中我們使用了濃度1∶100 的QDs-655，高于推薦濃度，同時在37 ℃下進行孵育，使一抗A 與二抗A 充分結合。第二，若第一輪染色結束后漂洗不充分，殘余的二抗A 將與第二輪一抗（一抗B）結合。針對這種情況，使用PBS 徹底漂洗可避免。第三，在第二輪染色過程中，已結合的一抗A 和二抗A 由于溫度、漂洗等因素再次分離，引起二抗A 和二抗B 的交叉染色。針對這種情況，在第二輪染色過程中，我們在常溫下進行孵育，同時降低了漂洗的力度，防止二抗A 從一抗A 上脫離。除了對抗體濃度、孵育時間、封閉條件、清洗程度進行優化外，也有研究報道了其他預防同源一抗交叉染色的方法。Xing 等［16］認為在順序法熒光染色中，在孵育第二輪一抗前，用無標記的二抗孵育組織，使第一輪一抗的結合位點飽和，能降低QDs 二抗的交叉染色。Liu 等［17］報道通過甲醛、戊二醛或碳二亞胺交聯QDs-抗體-抗原復合物，可避免QDs-二抗從一抗結合位點分離，結合到其他同源一抗上引起交叉染色。此外，多項研究［18-20］應用了一種酪酰胺信號放大技術，利用酪酰胺的過氧化物酶反應產生大量的酶促產物，與周圍的蛋白殘基結合，在抗原-抗體結合部位形成大量的生物素沉積，生物素與隨后加入的鏈霉素-熒光基團結合，每一輪染色后非共價結合的抗體被洗脫，而共價結合的熒光基團留存在組織上，進而克服抗體交叉反應和一抗二抗種屬匹配問題，基于此的Opal/TSA 多標記病理切片染色方案，可用于多達7～10 種標記的同步染色和共定位及定量分析［21，22］。

除了克服了一抗種屬來源限制外，QDs 的優良光學特性還保證了多重染色的成像效果。QDs 的發射光譜呈現窄且對稱的特點，結合CRi Nuance 多光譜成像系統，無論是三種以上色調的多重染色，還是位于同一區域多種抗原的染色，都可以對相應靶標進行單獨分離和分析，而不會發生光譜交疊，造成目標信號間的干擾。

綜上，本研究中建立的基于多色QDs 的間接法多標記熒光染色方案，通過調整抗體濃度、優化孵育時間、徹底清洗等手段，可較好地避免一抗種屬來源相同時的交叉染色，達到了同時檢測多個生物靶標的目的。利用CRi Nuance 多光譜成像系統進行后續熒光圖像采集，有利于對單個靶標分子進行分離和亞細胞定位，實現更準確的光譜定量分析。兩者結合建立的新型多分子成像技術，有助于將來進行深度的多分子成像和研究。