斑馬魚SDC4基因的克隆與遺傳進化分析

崔 佳 溫 炟 陳廣信 吳長新

Syndecans(SDCs)是細胞表面的一類硫酸乙酰肝素跨膜糖蛋白(Heparan sulfate proteoglycan, HSPG)，該家族蛋白有4個結構相似成員(Syndecan-1-4)[1]，廣泛參與骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、原發性肝癌等人類腫瘤的發生和發展[2]。SDC4作為SDCs家族中的重要蛋白，主要由胞外區、跨膜區和胞質內區域構成[3]。不同于SDC1-3在上皮細胞、神經元細胞、平滑肌細胞等特異性的細胞表達[4-5]，SDC4在多種細胞中廣泛表達，主要調節細胞骨架重塑、細胞增殖、細胞黏附和遷移的過程[6-7]。此外，SDC4參與多種病毒和細菌病原體的感染過程，被發現在調控炎癥相關的細胞生物學過程中發揮重要作用并且與許多炎癥性疾病發生有關[8-10]。但這些僅僅局限于哺乳動物的研究中，對于非哺乳動物如斑馬魚中SDC4介導的生物學功能則鮮有研究。HOFMEISTER等[11]揭示了SDC1-4四種家族蛋白在斑馬魚胚胎期腦部發育的表達模式相異，推測SDC1-4可能在斑馬魚體內有不同的生物學功能。LUO等[12]通過原位雜交研究發現SDC4在斑馬魚胚胎期廣泛表達，并且影響斑馬魚胚胎神經發生過程中神經細胞的增殖。本文對斑馬魚SDC4 基因進行克隆并測序驗證，分析其在斑馬魚胚胎發育前10 d的表達量差異，并且對斑馬魚SDC4、人SDC4和鼠SDC4的染色體基因連鎖性與氨基酸同源性做出分析，同時構建系統發生樹，為后續斑馬魚中SDC4基因功能分析奠定分子生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒

pCS2+質粒(山西大學生物醫學研究院保藏)。

1.2 動物

野生型斑馬魚AB、TU品系購自于國家斑馬魚資源中心(CZRC)。

1.3 主要試劑與儀器

NEBuilder HiFi Assembly Mix購自于New England Biolabs(北京)有限公司，Prime STAR Max、PrimeScript RT Master Mix反轉錄試劑盒購自于TaKaRa大連寶生物公司，2хRealtime PCR super SYBRgreen mix 購自于北京聚合美生物科技有限公司。

1.4 AB、TU野生型斑馬魚品系基因組全長cDNA的制備

選取發育良好的斑馬魚卵或胚體各約50個，分別置于1.5 mL的離心管(RNase free)中, 先用RNase free ddH2O 清洗3遍，再加入Trizol 溶液后組織破碎混勻，然后用三氯甲烷、異丙醇提取RNA，最后根據反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA后待用。

1.5 斑馬魚SDC4 基因的克隆

根據ensemble斑馬魚SDC4 CDS信息設計引物，上游引物為：5′-ttt gca gga tcc agc cac cAT GTT GAA AGT TTA CCT CAT G-3′，下游引物為：tgc tca cag atc cac ctc cac cTG CGT AGA TTT CTG TGG TTG GAG-3′(引物中小寫字母為載體同源臂序列，大寫字母為SDC4 CDS 序列)，之后以受精后3 d 的TU斑馬魚基因組全長cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產物用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并回收。利用Gibson酶(NEBuilder HiFi Assembly Mix)將克隆的斑馬魚SDC4 CDS區與pCS2+質粒進行組裝，轉化入大腸桿菌DH5α中，得到的菌落陽性克隆子送往上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.6 斑馬魚SDC4基因在AB、TU野生型品系中的mRNA表達量分析

設計用于qPCR的斑馬魚SDC4基因引物，上游引物為：5′-GCT CTG ATT GTG GGT GGC A-3′，下游引物為：5′-TTG GTG GGG GCT TTC TTG T-3′。內參基因選用β-actin，上游引物為：5′-CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT-3′；下游引物為：5′-CAC CGA TCC AGA CGG AGT AT-3′。根據Realtime PCR super SYBRgreen mix試劑盒說明書配制反應體系并設置反應條件，數據處理采用與內參基因歸化后用2-ΔΔCt計算。

1.7 斑馬魚SDC4基因的生物信息學分析

在ensemble和NCBI網站得到各物種SDC4 的染色體連鎖基因信息和蛋白氨基酸序列，利用MegAlign軟件中Clustal W方法進行氨基酸多重序列比對，并且用MEGAX軟件中N-J鄰接計算方法構建系統發生樹。

1.8 統計學方法

運用Graphpad Prism 7.0軟件對組間數據進行Student’s unpairedt-test 檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義，“NS”為差異無統計學意義。

2 結果

2.1 斑馬魚SDC4基因克隆測序結果分析

通過PCR克隆技術獲得斑馬魚SDC4基因的全長cDNA序列，根據測序結果顯示，斑馬魚SDC4 CDS區已經成功重組入 pCS2+ 載體(見圖1)。圖1是載體與目的基因的5′ 與3′ 端接合位點部分測序峰圖，加下劃線堿基表示 pCS2+ 載體序列，未加下劃線堿基表示SDC4基因序列。為了確保插入的SDC4基因能夠準確表達，Kozak序列(gccacc)被選擇插入目的基因起始密碼子前(見圖1)，同時鑒于pCS2+載體中存在綠色熒光蛋白(GFP)基因，SDC4基因終止密碼子在插入載體時被剔除(見圖2)。

圖1 pCS2+-SDC4重組載體中SDC4 CDS區5’端部分測序峰圖Fig.1 Sequencing peaks figure of the 5' end of the SDC4 CDS region in the pCS2+- SDC4 recombinant vector

圖2 pCS2+-SDC4重組載體中SDC4 CDS區3′端部分測序峰圖Fig.2 Sequencing peaks figure of the 3' end of the SDC4 CDS region in the pCS2+- SDC4 recombinant vector

2.2 SDC4基因在AB、TU野生型斑馬魚中的表達

檢測受精后1 d(1 day post-fertilization, 1 dpf)即體節發育完成期與受精后3 d(3 dpf)即幼體形成期的野生型AB、TU斑馬魚中SDC4mRNA表達情況，qRT-PCR數據結果顯示：SDC4基因在野生型斑馬魚受精后前3 d無明顯的差異表達[n=3,P(1 dpf)=0.808,P(3 dpf)=0.550,見圖3]。

注：NS表示與AB組比較P>0.05圖3 斑馬魚SDC4基因在AB與TU品系中的相對表達量Fig.3 The relative expression of zebrafish SDC4 gene in AB and TU strains

2.3 SDC4基因在TU野生型斑馬魚中的時間表達分析

通過qRT-PCR檢測斑馬魚胚胎發育的前10 d內SDC4 mRNA隨時間變化的趨勢，SDC4 mRNA 在1 dpf 較2 dpf、3 dpf、4 dpf有相對高的表達量，差異有統計學意義[n=3,P(2 dpf)=0.015,P(3 dpf)=0.001,P(4 dpf)=0.012]。見圖4。推測斑馬魚SDC4表達可能存在一定程度的母系遺傳控制，但是隨后SDC4 mRNA的表達量在5 dpf、6 dpf、8 dpf、10 dpf較1 dpf差異無統計學意義[n=3,P(5 dpf)=0.139,P(6 dpf)=0.998,P(8 dpf)=0.117,P(10 dpf)=0.929]。

注：*表示與1 dpf組比較P<0.05,NS表示與1 dpf組比較P>0.05圖4 SDC4基因在斑馬魚胚胎發育前10 d的mRNA表達量Fig.4 Temporal expression pattern of zebrafish SDC4 gene during the first ten days embryonic development

2.4 斑馬魚SDC4、人SDC4、小鼠SDC4基因染色體連鎖性分析

通過ensemble和NCBI網站可知：斑馬魚SDC4、人SDC4和小鼠SDC4基因分別位于3號、20號和2號染色體，染色體連鎖基因座位示意圖分析顯示：人SDC4和小鼠SDC4基因位置附近的連鎖基因保持了較高的相似性，但斑馬魚SDC4基因較人SDC4和小鼠SDC4的連鎖基因僅MATN4與RBPJL相似(見圖5)。

圖5 人SDC4、小鼠SDC4和斑馬魚SDC4基因的染色體連鎖基因座位圖Fig.5 The chromosomally syntenic analysis diagram of human SDC4, murine SDC4 and zebrafish SDC4 genes

2.5 斑馬魚、人、小鼠SDC4氨基酸序列比對

將斑馬魚SDC4、人SDC4、小鼠SDC4氨基酸序列進行同源性比對(見圖6)，結果顯示：斑馬魚SDC4 與人SDC4、小鼠SDC4的同源性分別為38.3%、44.2%，而人SDC4與小鼠SDC4 的同源性高達82.4%。圖6顯示各物種中的SDC4 蛋白在C末端即胞質內區域(Cytoplasmic domain，CD)有高的同源性：人與小鼠SDC4蛋白CD區(residues 171-198)完全一致，與斑馬魚SDC4 蛋白CD區(residues 200-207)同源性為85.70%。

圖6 斑馬魚SDC4 與人、小鼠SDC4的氨基酸序列比對Fig.6 Multiple sequence alignment of zebrafish SDC4 with human and murine SDC4

2.6 SDC4蛋白的進化樹分析

為了詮釋SDC4蛋白在物種中的進化地位，選取了15種典型生物構建系統發生樹，其中包括5種魚類動物(Astyanaxmexicanus、Astatotilapiacalliptera、Amphiprionocellaris、Amphiprionpercula、Daniorerio)、1種爬行類動物(Aquilachrysaetoschrysaetos)與9種哺乳類動物(Bosgrunniens、Bostaurus、Canislupusfamiliarisgreatdane、Balaenopteramusculus、Canislupusfamiliarisgreatdane、Aotusnancymaae、Homosapiens、Musmusculus、Aquilachrysaetoschrysaetos)。圖7所示的系統發生樹基本上能夠反映出物種的進化關系，相較于哺乳動物和爬行動物，斑馬魚SDC4與其他4種魚類動物被分在了同一簇。此外，通過系統發生樹揭示的物種親緣關系可知，斑馬魚SDC4 蛋白在進化中是保守的，且是人類和其他物種SDC4的直系同源基因(見圖7)。

注 部分物種SDC4 UniPro蛋白數據庫：Bos taurus (E1BKS1)、Camelus dromedarius(A0A4U5S0B1)、Midas cichlid (A0A3Q0S4P1)、Astyanax mexicanus(A0A3B1K6Y0)、Canis lupus familiarisgreatdane(J9NZ79)、Aotus nancymaae (A4K2X3)、Homo sapiens (P31431-1)、Mus musculus (Q35988)、Anolis carolinensis (A0A3Q1APH0)、Astatotilapia calliptera (A0A3P8PRI7)、Amphiprion percula (A0A3P8UAL5)圖7 SDC4蛋白系統進化樹分析Fig.7 A phylogenetic tree of SDC4 was constructed based on 15 organisms

3 討論

SDC4是SDCs家族中重要的跨膜糖蛋白，哺乳動物SDC4蛋白研究較多地集中于細胞骨架與細胞增殖等方面，并且與某些腫瘤的形成發生相關，但是關于斑馬魚SDC4 研究則較少。目前，斑馬魚作為一種新興的模式動物，在動物發育、疾病發生、免疫調節與藥物篩選等研究方向得到了廣泛的應用，加之近年來CRISPR基因編輯等反式遺傳學手段的興起，使越來越多的人類基因功能在斑馬魚中得到了驗證[13-15]。本研究首先從TU野生型斑馬魚基因組cDNA中擴增了SDC4基因，測序結果顯示與ensemble 網站中公布的TU斑馬魚SDC4基因序列(ENSDART00 000 083 830.5)完全一致(部分序列見圖1)，這為后續從反式遺傳學角度在斑馬魚體內開展SDC4基因過表達、敲除或回補等實驗提供了基礎的分子生物學信息與材料。根據qRT-PCR結果顯示，SDC4基因在1 dpf、3 dpf兩個時間的斑馬魚AB和TU之間mRNA表達量基本一致，提示SDC4在實驗室常用AB、TU野生型斑馬魚品系的早期胚胎發育關鍵階段有相似的表達量，為后續在此兩種品系中開展斑馬魚SDC4功能研究提供了基本分子生物學信息。分析斑馬魚胚胎發育期前10 d的SDC4 mRNA表達模式發現，SDC4的表達量受到一定程度的母系遺傳控制，但是關于SDC4在成魚中的表達模式及其功能需要在后續研究中進一步挖掘解釋?；蛉旧w連鎖性分析發現，人SDC4和小鼠SDC4基因有高度保守的染色體連鎖性，但是斑馬魚SDC4的連鎖基因已經表現出與人和小鼠的差異性。SDC4蛋白氨基酸序列比對顯示：SDC4蛋白在不同物種之間有一定的保守性，但是相較于人和小鼠SDC4之間的高同源性，斑馬魚SDC4與人、小鼠SDC4的同源性則較低。因此，通過基因染色體連鎖性和蛋白氨基酸序列比對發現，斑馬魚SDC4與哺乳動物SDC4雖然存在分子進化保守性，但也表現出一定程度的分子遺傳差異性，進而思考斑馬魚SDC4與哺乳動物SDC4蛋白功能之間是否存在異同點。其次，根據蛋白序列中CD區的保守性，是否可以推測斑馬魚SDC4在胞內接頭蛋白與信號通路激活等方面與哺乳動物細胞內相似，這些假設我們將在后期研究中展開調查。此外，本研究得到的SDC4 系統發生樹有一定合理性，為推演斑馬魚SDC4的功能和進化機制提供了信息基礎，但由于系統發生樹中氨基酸序列數目不多、代表物種數量較少，因此得到的SDC4系統發生樹只能在大體上反應近緣物種遺傳物質的相似性，更多深層次的遺傳進化關系需要我們進一步探究。

綜上所述，本研究克隆了斑馬魚SDC4基因，并對其mRNA在不同野生型斑馬魚中的差異表達量和在胚胎發育早期隨時間表達量進行了分析，之后對斑馬魚SDC4進行了基因連鎖性、蛋白同源性和進化樹分析，本研究為后續研究斑馬魚SDC4功能提供了基礎生物材料并奠定了分子遺傳學理論基礎。