成纖維細胞生長因子受體2在腎透明細胞癌中的表達及意義

蔡天玉，朱振鵬，徐純如，吉 星，呂同德，郭振可，林 健

(北京大學第一醫院泌尿外科，北京大學泌尿外科研究所，國家泌尿男生殖系腫瘤研究中心， 北京 100034)

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是一類起源于腎小管上皮細胞的惡性腫瘤[1]，在泌尿系統中常見，約占男性所有癌癥發病病例的5%，占女性新診斷癌癥病例的3%[2]。腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC; or kidney renal clear cell carcinoma, KIRC)作為RCC最常見的組織學亞型，大約占所有RCC的70%～80%[3-4]。大部分ccRCC病例對放療或者化療不敏感[5]，部分或根治性腎切除術是ccRCC的主要治療方法，但術后仍有20%以上患者可出現復發，并且這部分患者預后較差[6-7]。然而，ccRCC致癌的具體分子機制尚不清楚，探索其相關生物標志物可能有助于改善ccRCC患者的預后。

成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor，FGFR)家族包含四種高度保守的跨膜酪氨酸激酶受體(FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4)，它們通過與成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)配體結合來發揮作用[8]。既往研究顯示成纖維細胞生長因子受體2 (fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2；Ensembl ID:ENSG000000-66468.20)與多種腫瘤相關，例如，在結直腸癌中，FGFR2可通過JAK / STAT3途徑上調細胞程序死亡-配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)表達，調節腫瘤免疫逃避，且FGFR2表達水平與預后密切相關[9]。此外，研究者發現FGFR2改變在低黏附性胃癌(poorly cohesive gastric carcinoma，PCGC)中比其他類型中更常見，TACC2-FGFR2融合可以增加FGFR2的mRNA和蛋白質水平表達，并且具有TACC2-FGFR2融合的胃癌細胞系對FGFR2抑制劑更敏感，FGFR2可能是PCGC的潛在治療靶點[10]，但FGFR2對ccRCC的具體作用仍尚未闡明。

為了研究ccRCC患者中FGFR2的表達與其預后價值，探索其潛在的生物學功能，本研究先在腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫及基因表達綜合(Gene Expression Omnibus，GEO)數據庫中比較了FGFR2在ccRCC組織以及正常組織中的表達情況，并且對FGFR2的表達情況與患者臨床病理特征及預后的關系進行分析，進一步在臨床樣本ccRCC組織及癌旁正常組織、ccRCC細胞系及正常腎上皮細胞系中比較FGFR2表達水平，并研究FGFR2的表達與免疫浸潤的關系以及構建其蛋白互相作用網絡，探討其在ccRCC發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 數據庫中基因表達資料及臨床信息的獲取

TCGA (https://genome-cancer.ucsc.edu/)是一個具有里程碑意義的癌癥基因組學項目，TCGA產生的基因組學、表觀基因組學、轉錄組學和蛋白質組學數據可公開供研究人員使用。通過TCGA數據庫可以獲得具有RNA-Seq表達和與之匹配的ccRCC患者臨床病理信息的數據，該數據庫是公開開放的，因此無需獲得倫理委員會的批準。

GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的功能基因組學數據庫，可查詢和下載基因表達譜信息。本研究從該數據庫中下載了數據集GSE15641、GSE53757、GSE71963的基因表達信息以及臨床預后資料。

1.2 患者和樣本

收集104例在北京大學第一醫院泌尿外科住院的ccRCC患者的腫瘤標本，這些患者接受了根治性或部分腎切除術治療?；仡櫺詫彶榱吮本┐髮W第一醫院數據庫中臨床病理數據的醫療記錄，包括年齡、性別、T期、N期、M期和Fuhrman等級等。所有癌癥組織樣本均已被病理診斷為ccRCC。

1.3 免疫組織化學染色(immunohistochemistry, IHC)

從石蠟包埋組織樣品中制備組織切片。使用二步法檢測試劑盒(Zsbio公司，中國)進行免疫組織化學染色。先烤片1 h，然后將切片在二甲苯中脫蠟，在梯度乙醇中再水化，用檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)高壓修復。滴加3%(體積分數)過氧化氫反應30 min從而消耗內源性過氧化物酶，將切片在PBS緩沖液中洗滌，用10%(體積分數)山羊血清封閉(Zsbio公司，中國)進行封閉。將切片與兔抗FGFR2抗體(Proteintech，1 ∶2 000)一起孵育，4 ℃過夜。第二天將切片在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)中洗滌三次，并與反應增強劑試劑盒在室溫下孵育20 min。隨后在PBS緩沖液中洗滌，并與辣根過氧化物酶偶聯的二抗一起室溫孵育。用二氨基聯苯胺溶液和20%(體積分數)蘇木精復染，并脫水，最后用中性樹脂封片。

由兩名經驗豐富的研究者對所有腫瘤樣本切片進行觀察，每張切片選取五個視野進行評估。細胞染色強度評分標準為：0(無染色)，1(弱)， 2(中)， 3(強)；陽性細胞率評分標準為：0 (0%～5%)，1 (6%～25%)， 2 (26%～50%)， 3 (51%～75%)， 4 (76%～100%)；兩個變量乘積作為最終分數。

1.4 細胞培養

細胞系293、786-O、769-P、Caki-1、ACHN、A498和OSCR-2購買自美國保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，在含10%(體積分數)胎牛血清的1640培養基 (Sigma公司，美國)或達爾伯克氏改良伊戈爾氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM, Corning公司, 美國)中進行培養。每2～3天換液一次，細胞密度達到90%時進行傳代。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應 (quantify real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)

使用Trizol試劑(Invitrogen公司，USA)從每組細胞中提取總RNA,然后使用cDNA第一鏈合成SuperMix試劑盒(TransGen公司，中國)進行cDNA反轉錄。使用Top Green 熒光定量PCR 試劑盒(TransGen公司，中國)在AriaMx Real-Time PCR系統(Agilent Technologies公司，美國)上進行qRT-PCR，β-tubulin作為內參照。使用的引物對如下：FGFR2正向引物： 5′- CCAACTGCACCAACGA-ACTG-3′，FGFR2反向引物：5′-CCAGTTTCTCAATGAAGCCATAA-3′；β-tubulin正向引物：5′-GATTCCTTCAACACCTTCTTCAG-3′，β-tubulin反向引物：5′-GTGCGAACTTCATCAATGAC-3′，每次反應重復3次,采用2-ΔΔCT法計算相對基因表達值。

1.6 蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡的構建

生物相互作用數據集通用存儲庫(Biological General Repository for Interaction Datasets, BioGRID，www.thebiogrid.org)是一個開放的數據庫，包含多個物種(如酵母、小鼠和人類等)的蛋白質的相互作用。所有BioGRID內容均來自生物醫學文獻中的主要實驗證據，其中包括了重點低通量研究和大型高通量數據集。BioGRID還可捕獲蛋白質翻譯后修飾以及蛋白質或基因與生物活性小分子(包括許多已知藥物)的相互作用，可以通過網絡界面、標準化文件下載或通過模型生物數據庫和合作伙伴數據庫自由訪問所有BioGRID數據[11]。

1.7 統計學分析

使用軟件SPSS 26.0和R (3.6.3版本)進行統計分析， Wilcoxon秩和檢驗(rank sum test)用于分析GEO中基因的表達差異，t檢驗用于比較ccRCC和正常細胞系中FGFR2表達水平，使用Kaplan-Meier方法分析FGFR2表達對總生存期的影響。使用R (3.6.3版本) 的GSVA包進行FGFR2與免疫細胞浸潤分析的可視化，多重假設檢驗(Dunn’s test)分析FGFR2與臨床變量之間的關系，用ggplot2包進行可視化。使用Cox回歸分析計算HR值，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 公共數據庫中FGFR2在 ccRCC 中表達下調

我們在TCGA數據庫中分析了ccRCC 腫瘤樣本及正常組織中的FGFR2mRNA表達水平，結果表明與正常組織相比，ccRCC腫瘤樣本中的FGFR2的mRNA表達水平顯著下調，差異具有統計學意義(P<0.001, 圖1)。此外，在GEO數據庫中,對數據集GSE15641、GSE53757、GSE71963進行比較分析，也能得到相一致的結果(圖2)， 這些結果表明與正常腎組織相比，ccRCC組織中FGFR2的mRNA表達水平下調。

2.2 FGFR2在ccRCC臨床標本和細胞系中表達下調

對104例臨床樣本進行IHC染色，IHC評分結果顯示，與癌旁正常組織相比，ccRCC組織中FGFR2的表達水平下調,代表性結果如圖3。此外，采用qRT-PCR比較了正常細胞系和RCC細胞系中FGFR2的mRNA表達水平，結果表明RCC細胞系中FGFR2的mRNA表達水平下調(圖4)。

2.3 FGFR2與 ccRCC患者的結局相關

為了探索FGFR2表達與ccRCC患者預后之間的關系，我們分析了TCGA的樣本，ccRCC患者的基線信息如表1所示。Kaplan-Meier分析顯示，FGFR2表達較低的ccRCC患者總生存率較低(圖5)。我們分析了TCGA數據庫中ccRCC患者FGFR2表達與腫瘤TNM分期、病理分級以及總生存率(overall survival, OS)的關系(圖5)?？偠灾?，這些結果表明FGFR2高表達與較早期的、更低級別的ccRCC有關，FGFR2高表達與ccRCC患者較好的預后相關。

2.4 FGFR2與ccRCC患者免疫浸潤的關系

為了解FGFR2與ccRCC患者免疫浸潤的關系，我們分析了ccRCC患者中FGFR2表達與B細胞、T細胞、NK細胞及中性粒細胞浸潤的關系(圖6)， 結果表明FGFR2表達與B細胞、T細胞、NK細胞及中性粒細胞浸潤無明顯相關關系。

△P<0.001;TCGA, The Cancer Genome Atlas; ccRCC, clear cell renal cell carcinoma; FGFR2, fibroblast growth factor receptor 2; TPM, transcripts per kilobase of exonmodel per million mapped reads.圖1 TCGA數據庫中ccRCC 腫瘤樣本及正常組織中的FGFR2 mRNA表達水平Figure 1 FGFR2 mRNA expression levels in ccRCC tumor samples and normal tissues in the TCGA database

# P<0.01; △ P<0.001; ccRCC, clear cell renal cell carcinoma; FGFR2, fibroblast growth factor receptor 2; GEO, Gene Expression Omnibus database.圖2 GEO數據庫中ccRCC 腫瘤樣本及正常組織中的FGFR2 mRNA表達水平Figure 2 FGFR2 mRNA expression levels in ccRCC tumor samples and normal tissues in the GEO database

A, normal tissues; B, ccRCC tissues. ccRCC, clear cell renal cell carcinoma; FGFR2, fibroblast growth factor receptor 2; IHC, immunohistochemistry.圖3 正常組織及ccRCC組織中FGFR2的免疫組織化學染色情況(IHC ×40)Figure 3 Immunohistochemical staining of FGFR2 in normal tissues and ccRCC tissues (IHC ×40)

*P<0.05；# P<0.01; △ P<0.001; RCC, renal cell carcinoma; FGFR2, fibroblast growth factor receptor 2.圖4 正常細胞系(293)及RCC細胞系中FGFR2相對mRNA表達量Figure 4 Relative mRNA expression of FGFR2 in normal cell lines (293)and RCC cell line

2.5 FGFR2蛋白相互作用網絡的構建

為了探究FGFR2的功能，我們在BioGRID數據庫中尋找與FGFR2相互作用的分子，并構建了PPI網絡(圖7)。由圖中的邊緣和節點信息可得，FGFR2與FGFR1、SRC、SHC1、CBL等具有潛在的作用關系，并可能與腫瘤發生發展相關，而其在ccRCC中與各分子的具體關系有待進一步闡明。

表1 TCGA數據庫中ccRCC患者的基線資料Table 1 Baseline data of patients with ccRCC in the TCGA database

*P<0.05；# P<0.01; △ P<0.001; ccRCC, clear cell renal cell carcinoma；FGFR2, fibroblast growth factor receptor 2; OS, overall survival; TPM, transcripts per kilobase of exonmodel per million mapped reads.圖5 TCGA數據庫中ccRCC患者FGFR2表達生存分析曲線及與腫瘤TNM分期、病理分級和OS的關系Figure 5 Relationship of FGFR2 expression in patients with ccRCC in the TCGA database with tumor TNM staging, pathological grading, and OS

A, T cells; B, neutrophils; C, B cells; D, NK cells. FGFR2, fibroblast growth factor receptor 2；TPM, transcripts per kilobase of exonmodel per million mapped reads； NK, natural killer; ccRCC, clear cell renal cell carcinoma.圖6 ccRCC患者中FGFR2表達與B細胞、T細胞、NK細胞及中性粒細胞浸潤情況Figure 6 FGFR2 expression and B cells, T cells, NK cells and neutrophils infiltration in patients with ccRCC

3 討論

ccRCC是常見的惡性腫瘤類型之一[12]，其對常規放、化療抵抗，術后易復發，因此治療仍然是一個巨大的挑戰[7]。FGF/FGFR信號轉導軸在正常器官、血管和骨骼發育中起重要作用，而 FGF / FGFR信號異常參與了腫瘤的發生和進展[8, 13]。既往研究中發現，FGFR2在多種腫瘤中起作用，如胃癌中顯示出FGFR2過表達和基因擴增[14]，且FGFR2通過PI3K-Akt-mTOR途徑抑制血栓蛋白4的表達來促進胃癌進展[15]；FGFR2還可促進PD-L1在結腸癌異種移植小鼠模型中的表達[9]；此外，FGFR2可通過ERK-YY1軸抑制乳腺癌1號易感基因(breast cancer susceptibility gene，BRCA1)的表達并促進乳腺腫瘤進展[16]，而三磷酸腺苷競爭性FGFR激酶抑制劑在具有FGFR2融合基因的肝內膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)患者中顯示出抗腫瘤活性[17]。相反地，在前列腺癌中，FGFR2通過控制缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor, HIF-1α)及HIF-2α介導的缺氧反應，可作為轉移抑制因子[18]，因此，FGFR2可以作為抗癌新分子療法的一個有希望的靶點。然而，目前為止，對FGFR2在ccRCC中的作用研究較少，既往的研究尚未將其具體作用機制闡明。

以往研究中，有研究者通過IHC染色方法，分析了FGF及其受體家族在RCC中的表達，結果表明 FGF2及其受體在RCC原發腫瘤細胞和細胞質中均有表達，且與FGFR1相比，FGFR2表達的頻率和強度更高。FGFR2過表達在單變量分析中顯示出對癌癥特異性生存的負面影響，然而，在多變量分析中失去了其預測價值，需要進一步研究[19]，而且，研究者發現，在近90%的ccRCC中，FGFR2基因轉錄本從正常的Ⅲb亞型(“上皮”)切換到Ⅲc亞型(“間充質”)。臨床上，FGFR2-Ⅲb型 ccRCC的體積更小，腫瘤等級較低，并且與更長的患者生存期相關[20]。

本研究中，根據TCGA及GEO數據以及我們的數據庫，發現FGFR2mRNA和蛋白質水平的表達在ccRCC細胞系及組織中被下調，并且隨著惡性腫瘤的進展有進一步下調趨勢。FGFR2可能是ccRCC患者的潛在預后標志物，可能作為ccRCC患者的潛在治療靶點。

FGFR1, fibroblast growth factor receptor 1; FGFR2, fibroblast growth factor receptor 2.圖7 FGFR2的蛋白相互作用網絡Figure 7 Protein interaction network of FGFR2

上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是一種細胞生物學程序，自然發生在廣泛的組織類型和發育階段中，是發育、傷口愈合和干細胞行為中不可或缺的一部分，并在病理學上促進纖維化和癌癥進展。顧名思義，EMT過程是將上皮細胞轉換為間質細胞。根據組織內細胞接收的信號，該過程先生成一系列中間表型狀態的細胞，當被驅使到極端時，將完全上皮細胞轉化為完全間質細胞。上皮細胞表現出上皮細胞間連接和頂端-基底極性，而間質細胞表現出運動性和侵襲性增強，形態呈現紡錘形，缺乏頂端-基底極性。在腫瘤中，目前主流觀點認為EMT 過程可能參與轉移級聯的初始步驟，包括腫瘤侵襲、血管內浸潤和微轉移形成，這得到了多種體外和體內功能數據以及人體樣本相關數據的支持。腫瘤細胞中EMT樣變化已被廣泛研究，并且意味著侵襲性增加、DNA損傷增加和對化療誘導的細胞凋亡的抵抗力增加，同時免疫受到抑制以及獲得干細胞樣特征。既往研究表明FGFR2與EMT之間存在相關關系，因此，我們推測FGFR2可能通過影響EMT通路，從而影響癌癥的惡性行為[21]。

總而言之，本研究表明FGFR2表達與ccRCC發生發展及患者預后相關，這些結果有助于為ccRCC提供新的治療靶點和預后標志物。