4′-甲基醚金連木黃酮對棕櫚酸誘導的大鼠陰莖海綿體內皮細胞功能障礙的影響

顧陽陽，譚曉輝，宋文鵬，方 冬，宋衛東，袁亦銘，馮寧翰，關瑞禮△

(1. 北京大學第一醫院泌尿外科，北京大學泌尿外科研究所， 北京 100034； 2. 南京醫科大學附屬無錫第二醫院泌尿外科， 江蘇無錫 214002)

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)指的是男性無法獲得或維持勃起以獲得滿意的性交[1]。近年來，眾多研究人員一直致力于研究ED的發病機制，并認為ED主要是一種血管起源的疾病。在患有糖尿病、高膽固醇血癥和心血管疾病的男性中，ED的發病率顯著增加。內皮功能完整性的喪失和內皮功能障礙在此類ED的發生、發展中起著不可或缺的作用。心血管疾病和內皮功能障礙通過減少血液流入、動脈功能不全或動脈狹窄導致ED[2]。事實上，ED和心血管疾病密切相關，有相關癥狀的男性可能需要進行系統性的心臟評估。外部刺激可以改變正常的內皮功能并導致ED發作，例如氧化應激和炎癥[3]。內皮功能障礙是ED的關鍵病理特征之一。勃起過程中血管舒張受損主要是由于內皮細胞最重要的血管舒張劑一氧化氮(nitric oxide，NO)釋放減少所致。NO主要由海綿體內皮細胞的內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)產生釋放，因此eNOS的活化調控對恢復內皮細胞損傷及修復勃起功能不可缺少且極其重要[4]。

游離脂肪酸是常見的心血管疾病危險因素，且與肥胖和2型糖尿病等代謝性疾病密切相關[5-6]。最近的研究表明，游離脂肪酸不僅是導致胰島素抵抗的主要原因，而且還會在內皮、肝和骨骼肌等組織中靶向胰島素誘導炎癥[5,7]。因此，目前認為血液中升高的游離脂肪酸和胰島素抵抗、炎癥、肥胖、2型糖尿病、高血壓之間存在重要聯系。此外，越來越多的證據表明，游離脂肪酸在內皮功能障礙中也具有重要作用。具體來說，胰島素抵抗、氧化應激和炎癥是游離脂肪酸誘導的內皮功能障礙的主要原因[8]。糖尿病和其他代謝狀態會導致游離脂肪酸升高，進而引發內皮組織炎癥和產生氧化應激的轉錄因子。此外，游離脂肪酸，尤其是棕櫚酸(palmitic acid，PA)，還會促進內皮細胞的凋亡并對內皮祖細胞產生諸多負面影響[9-10]。

本課題組先前的研究結果證實，單黃酮類藥物淫羊藿次苷Ⅱ(icariside Ⅱ，ICA Ⅱ)在多種ED模型中能顯著促進內皮細胞增殖，恢復內皮功能障礙[11-12]，然而ICA Ⅱ面臨著生物利用度低、溶解度低等臨床轉化困境。當前關于雙黃酮類藥物在ED中的研究甚少。本研究使用雙黃酮類化合物4′-甲基醚金連木黃酮(4′-O-methylochnaflavone，MF)，以PA高脂模型為切入點，比較MF和ICA Ⅱ對此條件下大鼠陰莖海綿體內皮細胞(rat cavernous endothelial cells，RCECs)增殖和內皮功能的影響，并探索蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)及eNOS信號通路的作用機制。

1 資料與方法

1.1 試劑與材料

RCECs購自武漢普諾賽生命科技有限公司，PA粉末、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自北京索萊寶科技有限公司，MF和ICA Ⅱ購自北京倍特仁康生物醫藥科技有限公司，MF和ICA Ⅱ的化學結構示意圖見圖1。內皮細胞專用培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液、內皮細胞生長補充劑均購自美國ScienCell公司，胰蛋白酶購自美國Gibco公司，總蛋白提取試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購自愛必信生物技術有限公司，PAGE凝膠快速制備試劑盒購自大連美侖生物技術有限公司，Western blot所涉及的一抗和二抗分別購自美國Cell Signaling Technology公司和北京中山金橋生物技術有限公司，NO熒光探針購自碧云天生物技術有限公司，CCK-8試劑盒購自凱基生物技術股份有限公司。

1.2 PA溶液的配置

配置10%(質量分數)的無脂肪酸BSA溶液，用渦旋法將512.8 mg粉末狀PA完全溶解在10 mL無水乙醇中，55 ℃條件下將PA溶液和10%的BSA按1 ∶19的比例混合，制得10 mmol/L的PA工作液，分別用0.45 μm、0.22 μm微孔濾膜無菌過濾，分裝儲存于-20 ℃。

圖1 4′-甲基醚金連木黃酮和淫羊藿次苷Ⅱ的化學結構示意圖Figure 1 Chemical structure of 4′-O-methylochnaflavone and icariside Ⅱ

1.3 RCECs的體外培養和模型構建

RCECs的培養環境為37 ℃、5%(體積分數)CO2的常規濕度無菌環境。每2天更換培養液1次，當細胞生長至融合度80%～90%時，按1 ∶3比例傳代。細胞干預前將一定數量的細胞接種至10 cm培養皿內，24 h后(融合度約為70%～80%)實驗組更換為含有不同濃度藥物的完全培養基，然后加入適量PA工作液(終濃度150 μmol/L)模擬高脂環境。具體分組如下：第一組用MF(終濃度0.1 μmol/L)預處理0.5～1.0 h，然后以PA刺激細胞；第二組用ICA Ⅱ(終濃度0.1 μmol/L)預處理0.5～1.0 h，然后以PA刺激細胞；對照組則換為含等量二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)預處理0.5～1.0 h，然后加入等量BSA。繼續培養24 h后，收獲細胞進行后續實驗。

1.4 Western blot

蛋白的提取和濃度測定均按照試劑盒說明書進行。配制10%(質量分數)SDS-PAGE分離膠，制備步驟參照PAGE凝膠快速制備試劑盒說明書。電泳條件：80 V恒壓電泳30 min后，改為120 V恒壓分離60～90 min。電轉條件：300 mA恒流轉膜0.5～1.5 h。用TBST配置5%(質量分數)脫脂牛奶，室溫封閉1 h。按1 ∶1 000～1 ∶3 000比例(參考抗體說明書)，使用TBST稀釋目的蛋白一抗工作液，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗3遍，配置對應種屬的二抗工作液，放置搖床室溫1 h，TBST緩沖液洗3遍。經增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)后由Syngene G:BOX系列智能成像系統采集圖像。采用ImageJ軟件測定膠片電泳條帶灰度值，分析蛋白水平變化。

1.5 細胞增殖檢測

使用CCK-8試劑盒檢測MF和ICA Ⅱ對RCECs的增殖作用，參考試劑盒說明書進行實驗操作：將RCECs細胞懸液以每孔3×103/mL密度接種于96孔板(100 μL/孔)。根據組別設置，不同孔內分別加入含不同濃度藥物的培養基，處理24 h。暗光條件下每個孔內加入10 μL CCK-8原液，37 ℃條件下孵育1 h；使用酶標儀在450 nm波長下測量各孔光密度值(D450 nm值)，計算細胞存活率，細胞活力=[(實驗組D值-空白組D值)/(對照組D值-空白組D值)]×100%。

1.6 NO熒光探針檢測

按試劑盒說明書貼壁培養細胞，按照1 ∶1 000比例，用DAF-FM DA稀釋液稀釋DAF-FM DA原液制備工作液，終濃度為5 μmol/L。去除細胞培養液，加入適當體積稀釋好的DAF-FM DA工作液以充分蓋住細胞為宜，37 ℃細胞培養箱內孵育20 min，用無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌3次，以充分去除未進入細胞內的DAF-FM DA。

1.7 統計學分析

實驗數據采用均數±標準差表示。統計分析及作圖采用GraphPad Prism 8.0軟件，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Tukey’s多重檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MF和ICA Ⅱ對細胞內NO含量的影響

與NC組相比，0.1 μmol/L的MF和0.1 μmol/L的ICA Ⅱ干預后能夠顯著增加細胞內NO的含量(P<0.05)，且MF刺激NO生成的效果優于ICA Ⅱ (P<0.05，圖2)。

2.2 PA刺激對eNOS和AKT蛋白表達的影響

使用PA刺激RCECs構建體外內皮細胞功能障礙模型，與NC組相比，PA組的eNOS和AKT蛋白水平明顯降低，呈劑量依賴關系(P<0.05，圖3)，說明經PA處理過的RCECs發生AKT/eNOS信號通路的下調，RCECs出現了一定程度的細胞功能障礙，提示利用PA成功構建出內皮細胞功能障礙模型。

NC, normal control; MF, 4′-O-methylochnaflavone; ICA Ⅱ, icariside Ⅱ; NO, nitric oxide; a.u., arbitrary unit. *P<0.05; ***P<0.001.圖2 MF和ICA Ⅱ處理后細胞內NO含量的變化Figure 2 The evaluation of intracellular NO following the treatment of MF and ICA Ⅱ

PA, palmitic acid; AKT, protein kinase B; eNOS, endothelial nitric oxide synthase. *P<0.05.圖3 PA處理后內皮細胞內eNOS和AKT蛋白的變化Figure 3 The protein level of eNOS and AKT following the treatment of PA

2.3 PA刺激下MF和ICA Ⅱ對eNOS和AKT蛋白表達的影響

利用PA誘導內皮細胞功能障礙，在PA刺激后給予MF(終濃度為0.1 μmol/L)治療能夠有效提高eNOS和AKT的蛋白表達水平(圖4)，提示MF可促進內皮細胞損傷的恢復(P<0.05)；給予同等濃度的ICA Ⅱ未表現出顯著的治療效果(P>0.05)，可見MF的內皮細胞保護作用優于ICA Ⅱ。

NC, normal control; PA, palmitic acid; MF, 4′-O-methylochnaflavone; ICA Ⅱ, icariside Ⅱ; AKT, protein kinase B; eNOS, endothelial nitric oxide synthase. *P<0.05.圖4 MF和ICA Ⅱ治療后PA刺激下內皮細胞內eNOS和AKT蛋白的變化Figure 4 The protein level of eNOS and AKT in the PA-stimulated cells following the treatment of MF and ICA Ⅱ

2.4 MF、ICA Ⅱ對PA刺激的RCECs增殖的影響

CCK-8增殖實驗發現，MF和ICA Ⅱ濃度為0.1 μmol/L和1.0 μmol/L時沒有顯著的細胞毒性(P>0.05，圖5A)。PA會顯著降低RCECs的細胞增殖能力(P<0.05)，但使用0.1 μmol/L的MF和ICA Ⅱ治療后細胞增殖能力得到顯著恢復(P<0.05，圖5B)。

A, the RCECs were treated with different concentrations of MF and ICA Ⅱ for 24 h with cell viability measured via the CCK-8 assay; B, the RCECs were treated with 150 μmol/L PA in the presence or absence of MF and ICA Ⅱ for 24 h with cell viability measured via the CCK-8 assay. CCK, cell counting kit; NC, normal control; PA, palmitic acid; MF, 4′-O-methylochnaflavone; ICA Ⅱ, icariside Ⅱ; RCECs, rat cavernous endothelial cells; NS, no significant; μM, μmol/L; ***P<0.001.圖5 MF和ICA Ⅱ治療后PA刺激下RCECs增殖能力的變化Figure 5 The RCECs proliferation ability of the PA-stimulated cells following the treatment of MF and ICA Ⅱ

3 討論

作為血管內膜的重要組成部分，血管中的內皮組織由單層內皮細胞組成，排列在流動的血液和血管平滑肌細胞之間的血管腔內表面。內皮細胞具有廣泛的重要功能，包括維持血管張力、血液流動性和通透性[3]。內皮細胞還負責調節炎癥反應，對凝血級聯激活、血栓形成、纖維蛋白溶解和血管生成有一定影響[13-14]。

內皮功能障礙是血管中內皮來源的NO的產生或生物利用度發生了失衡，損害了血管擴張等正常生理過程。正常情況下，NO作用于陰莖海綿體的血管平滑肌細胞，使血管均處于舒張狀態。舒張的動脈平滑肌提高了海綿體的血流量，又促進內皮細胞合成釋放NO，陰莖海綿體竇狀間隙因血流量快速增加而脹大，最終啟動勃起過程[4]。

目前認為，AKT/eNOS/NO信號通路對血管中NO的調控起著主要作用[15]。采用不同治療手段激活該信號通路對恢復內皮功能障礙有促進作用，例如他汀類藥物、輔酶Q10、n-3多不飽和脂肪酸等[16]。此外，很多中藥單體也表現出對內皮功能障礙的改善作用，大部分為黃酮類藥物，包括姜黃素、槲皮素、熊果酸[17-18]。本研究檢測了雙黃酮類藥物MF對PA誘導的RCECs障礙后AKT/eNOS蛋白表達的影響，并與ICA Ⅱ進行比較。

內皮功能障礙可由多種危險因素誘發，如飲食、藥物和衰老。高脂飲食會誘導內皮細胞中AKT/eNOS信號通路下調，進而導致ED。AKT/eNOS信號通路的下調與血漿游離脂肪酸和甘油三酯水平升高以及葡萄糖利用受損相關[19]。脂肪酸是具有長脂肪鏈的羧酸，其一端含有甲基，而另一端含有羧基。根據是否含有雙鍵，它們分為沒有雙鍵的飽和脂肪酸、只有一個雙鍵的單不飽和脂肪酸以及至少有兩個雙鍵的多不飽和脂肪酸[20]。PA是血液中含量最多的飽和游離脂肪酸，會在多種細胞類型中誘導細胞功能障礙和細胞死亡。PA的脂毒性作用主要體現在非脂肪組織的細胞暴露于高水平的飽和脂肪酸中時，會導致脂質超載，這與肥胖和2型糖尿病的病理學相關[21]。導致ED的典型危險因素包括糖尿病、心血管疾病、衰老、肥胖，這些都與脂肪代謝異常相關。我們發現PA會下調AKT/eNOS信號通路，且依賴于濃度梯度。Khan等[9]的研究發現，人臍靜脈內皮細胞中PA過載會導致Ca2+依賴性自噬的發展，最終導致程序性細胞死亡。因此，PA對內皮細胞造成的損傷會導致內皮功能障礙，而其中AKT/eNOS信號通路起到重要作用。

我國具有豐富的中草藥資源，提取純化的天然小分子藥物多達幾十萬，為人類提供了寶貴的財富。ICA Ⅱ是一種從傳統中草藥淫羊藿中提取的活性黃酮類化合物，具有多種生物學和藥理學特性，包括抗癌、抗氧化、抗骨質疏松、抗炎、抗衰老等[22]。近些年的研究發現，ICA Ⅱ在修復內皮損傷中具有重要作用，為其在ED、心血管疾病等治療領域的應用提供了機會。ICA Ⅱ在RCECs中能通過AKT/eNOS信號通路恢復高糖誘導和神經損傷的人海綿狀血管內皮功能障礙[12,23]。但是，許多黃酮類藥物(包括ICA Ⅱ)的天然結構決定了其可溶性差、生物利用度低，臨床轉化前景困難重重，因此，尋找效價更好的小分子藥物勢在必行。

雙黃酮類化合物具有許多不同的單體結構和連接方式，具有廣泛的開發前景，而且當前關于雙黃酮類藥物在ED中的研究尚屬罕見。MF是一種從金銀花中分離得到的雙黃酮類化合物，可抑制小鼠淋巴細胞增殖[24]。此外，雙黃酮還可能用于開發針對新型冠狀病毒木瓜樣蛋白酶的抗病毒藥物[25]。本研究發現，MF能夠通過AKT/eNOS信號通路恢復PA刺激導致的內皮細胞功能障礙，且所需劑量比ICA Ⅱ少，顯示出較高的治療效價，此外，MF還能增加NO的產量，促進RCECs的增殖能力，顯示了其對內皮細胞生物學功能的修復作用。未來還可進一步明確MF在內皮細胞中的作用位點，并明確其中參與的其他細胞內信號通路的傳導機制。

綜上所述，AKT/eNOS信號通路的變化可能是PA造成RCECs內皮功能障礙的損傷機制，而MF能夠有效逆轉上述變化；與ICA Ⅱ相比，MF可更有效地產生NO。由于本研究僅在細胞水平研究了MF的作用機制，具有一定局限性，未來需要進一步探索雙黃酮類藥物MF在治療ED相關內皮功能障礙中的作用，包括使用ED動物模型，以期闡明其分子機制，為改善ED治療現狀和開發臨床上有效的治療手段提供全新思路。