基于16S rDNA基因測序探討咳嗽變異性哮喘與腸道菌群的關系

沈靈，曾琳琳，駱巧媚，范依霖，賀倩，段小云

（1.西南交通大學生命科學與工程學院，四川成都 610031；2.四川省骨科醫院，四川成都 610041）

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是一種以氣道炎癥、氣道高反應性、氣道重塑為主要特征的呼吸系統疾?。?］。其臨床主要癥狀為慢性咳嗽，而無明顯氣促，喘息等癥狀，發病前期易被忽略，最終部分患者發展為典型哮喘，嚴重影響生活質量［2］。根據CVA 的發病特點，將其歸于中醫“風咳”，“頑咳”等范疇，病位主肺［3］。中醫理論記載有“肺與大腸相表里”，認為肺和大腸在氣機、經絡、微生態三個層面相互作用，相輔相成，漸發展為現代醫學的“肺-腸軸”。研究顯示，腸道菌群紊亂與哮喘、氣道炎癥、慢性阻塞性肺炎、肺功能損傷等肺部疾病密切相關［4-5］。故本研究基于“肺與大腸相表里”中醫理論，探討腸道菌群與CVA 的相關性，以期從腸道微生物角度深入了解CVA 發病機制，為CVA 臨床治療提供實驗依據，進一步表征中醫內涵。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級BALB∕c 小鼠20 只，體質量18～22 g，6～8周齡，雌性。由成都達碩實驗動物有限公司供應，動物許可證號：SCXK（川）2020-030。飼養于溫度（20～25）℃，相對濕度30%～70%，光照時間12 h 的西南交通大學實驗動物中心，飲食飲水自由。所有程序均按照衛生部頒布的《醫學實驗動物管理實施細則》（1988 年）進行。所有動物實驗均經西南交通大學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 實驗儀器與試劑

十二水硫酸鋁鉀（明礬，批號：2018010101，成都市科隆化學品有限公司），卵清蛋白（OVA，貨號：A5503，Sigma公司），DNA Microprep Kit（批號：D4301，ZYMO RESEARCH 公司），Hiseq Rapid SBS Kit v2（批號：FC-402-4023，Illumina 公司），高通量測序儀（型號：HiSeq 2500 型，Illumina 公司），PCR擴增儀（型號：9700型，Applied Biosystems公司），超聲霧化器（型號：402AI，江蘇魚躍醫療設備股份有限公司）。

1.3 CVA小鼠模型的復制

20只BALB∕c雌性小鼠按隨機原則分為對照組和模型組，每組10 只，適應性喂養1 周后，開始造模。對照組0、7、14 d 腹腔注射0.2 mL 明礬溶液（1 mg 明礬溶于PBS），模型組給予等量OVA 混懸液（50μg OVA+1 mg 明礬溶于PBS）；21 d 起將小鼠放入密閉透明霧化箱，對照組每天用生理鹽水，模型組用1%OVA，霧化30 min，持續3 周。在此期間觀察小鼠一般體征并定時記錄體質量。

1.4 咳嗽反應測試

造模最后1 天，將對照組和模型組小鼠依次放入透明密封箱內，霧化吸入氨水1 min，關閉霧化器后，讓小鼠于密封箱內停留1 min 后開始記錄小鼠在4 min內的咳嗽次數及咳嗽潛伏期。

1.5 小鼠糞便收集

末次造模24 h 后，收集小鼠糞便3～4 顆于滅菌凍存管內，后轉置于液氮中保存，全部收集完成后迅速轉移至-80 ℃存儲。

1.6 16S rDNA高通量測序分析

采用瓊脂糖電泳法提取總DNA，用PicoGreen染料法進行樣本DNA 濃度檢測，使用特異引物515F 和806R 對樣本的16S 核糖體DNA（16S ribosomal DNA，16S rDNA）V4 區域進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，2%瓊脂糖凝膠進行目的片段電泳檢測，將合格的目的片段回收后純化、定量，使用NEBNext Ultra ⅡDNA Library Prep Kit for Illumina建庫，在HiSeq 2500 平臺上進行高通量測序?；赨search 軟件，在97%的一致性水平上對代表性序列進行分類操作單元（OUT）聚類，進行Alpha 多樣性、Beta多樣性、菌群組成及菌群差異分析。

1.7 小鼠肺組織病理染色

收集完糞便后，立即處死小鼠，取出其肺組織固定于40 g∕L 多聚甲醛中、脫水、包埋、切片、HE 染色、顯微鏡觀察肺組織病理情況。

1.8 相關性分析與統計學處理

使用Spearman 系數分析CVA 小鼠的咳嗽次數、咳嗽潛伏期、體質量與腸道菌群的相關性。應用SPSS 23.0 軟件進行分析，均數±標準差（）或中位數M（P25～P75）表示實驗結果。如果各組數據之間都呈正態分布且方差齊性用t檢驗，如果不滿足方差齊性，采用校正t檢驗或秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CVA小鼠一般體征及體質量變化

造模前，對照組與模型組小鼠精神狀態佳，毛發光亮順滑，飲食及排便正常，活動度高，反應敏捷，體質量無明顯差異；在OVA 致敏階段，兩組小鼠表現正常，體質量無明顯差異；在OVA 霧化激發階段，CVA 模型小鼠出現腹式呼吸，搔抓面部，咳嗽，煩躁不安，排便次數明顯增加、毛發枯黃，掉毛，活動減少，喜扎堆等現象，整體狀態較對照組差，體質量增長減慢，隨著造模時間延長體質量明顯下降（P＜0.01；表1）。

表1 造模期間各組小鼠體質量變化Table 1 Changes of body weight during modeling in each group（，n=10）

表1 造模期間各組小鼠體質量變化Table 1 Changes of body weight during modeling in each group（，n=10）

P values were compared by T test or Mann-Whitney U test（14 d）as appropriate.1）compared with control，P ＜0.01.

2.2 CVA小鼠咳嗽反應測試

與對照組相比，CVA 模型組小鼠4 min 內咳嗽次數顯著增加，咳嗽潛伏期顯著縮短，差異均有統計學意義（P＜0.01；表2）。

表2 各組小鼠咳嗽次數及咳嗽潛伏期Table 2 Number of cough and cough latency of mice in each group ［M（P25～P75），n=10］

2.3 CVA小鼠肺組織病理檢查

小鼠肺組織HE 染色結果如圖1 所示。對照組：支氣管結構完整，上皮細胞形態正常，無脫落、壞死，未見明顯炎性細胞浸潤；模型組：肺組織結構紊亂，以中性粒細胞和淋巴細胞為主的炎性浸潤明顯，氣道平滑肌增厚，肺泡壁破壞，偶見上皮細胞壞死。

圖1 小鼠肺組織病理檢查Fig.1 Pathological examination of lung tissue in mice

2.4 CVA小鼠腸道菌群的變化

2.4.1 OUT分析 末次造模24 h后，每組隨機選取6 只小鼠進行16S rDNA 測序分析。12 個樣本通過高通量測序共得254 856 條Raw tags，過濾低質量、短長度、嵌合體后，得到242 833 條有效序列。在97%的相似性水平下對有效序列進行OTU（Operational Taxonomic Units）聚類，結果顯示，模型組和對照組共有OTU 數目為1 371 個，特有OTU 是1 909 個和1 870 個，CVA 模型小鼠菌群OUT 相較于對照組發生顯著變化（圖2）。

圖2 基于OUT分布的Veen圖Fig.2 Veen graph based on OUT distribution（n=6）

2.4.2 Alpha 多樣性分析 Alpha 多樣性指數是反映樣本微生物群落復雜程度的重要依據，包括群落的豐富度及多樣性。群落豐富度可以用Chao 1 指數表示，其值越高，表明OTU 數目越多，群落物種總數越多；群落多樣性可以用Simpson指數表示，其值越大，群落多樣性越大。與對照組相比，模型組小鼠的Chao1 指數增高，差異不具有統計學意義；Simpson指數顯著升高（P＜0.01），表明CVA模型小鼠腸道菌群豐富度有增加趨勢且物種多樣性高于對照組（表3）。

表3 Alpha多樣性分析結果Table 3 Alpha diversity analysis results（，n=6）

表3 Alpha多樣性分析結果Table 3 Alpha diversity analysis results（，n=6）

P values were compared by T test as appropriate.1）compared with control，P ＜0.01.

2.4.3 Beta 多樣性分析 Beta 多樣性分析能反映多個樣本間是否有顯著微生物群落差異，為了將樣本間的差異整體反映在二維坐標上，選用最常用的Weighted Unifrac 距離計算方式進行非度量多維尺度分析（Non-metric Multi-Dimensional Scaling，NMDS）。如圖3 所示，結果的應力值（Stress）小于0.2，表明NMDS 分析結果可靠。圖中不同的點代表不同樣本，點之間距離越大，樣本組成差異越大。模型組與對照組組內樣本距離接近，菌群組成無顯著差異，組間樣本點完全分開，表明CVA 模型小鼠相較于對照組小鼠腸道菌群組成發生明顯變化。

圖3 NMDS分析結果Fig.3 NMDS analysis results

2.4.4 物種組成分析 為了進一步研究CVA 小鼠中腸道菌群組成的變化，對門和屬水平微生物相對豐度分析。門水平上，各組小鼠腸道菌群分屬26個菌門，對相對豐度前十的主要菌門分析發現，模型組和對照組小鼠中的優勢菌門為Firmicutes、Bacteroidetes、Euryarchaeota、Proteobacteria、Spirochaetes和Actinobacteria，總占比分別為98.96%和99.07%。與對照組相比，模型組Firmicutes相對豐度下降，Bacteroidetes、Euryarchaeota、Proteobacteria相對豐度增加。其余優勢菌和非優勢菌在模型組和對照組間組成差異結果（圖4）。

圖4 門水平物種豐度累積柱狀圖Fig.4 Barplot of relative abundance at the phylum level

在屬水平上共檢測到376 個菌屬，對相對豐度前十的菌屬進行分析。其中Lactobacillus、Lachnospiraceae NK4A136 group、Ruminococcaceae UCG-014為模型組和對照組共有優勢菌屬。與對照組相比，CVA 模型小鼠Lactobacillus、Ruminococcaceae UCG-014、Treponema 2相對豐度下降；Lachnospiraceae NK4A136 group、Methanobrevibacter的相對豐度增加。剩余五種菌屬的相對豐度在模型組樣本中增加（圖5）。

圖5 屬水平物種豐度累積柱狀圖Fig.5 Barplot of relative abundance at the genus level

2.4.5 差異物種分析 為確定模型組與對照組間重要差異菌群，利用線性判別分析（Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）進行比較。由圖6可知，對照組在Bacteria、Firmicutes、Bacilli、Lactobacillus、Lactobacillaceae、Lactobacillales豐度較高，模型組在Archaea、Bacteroidetes、Euryarchaeota、Clostridia、Bacteroidia、Methanobacteria、Bacteroidales、Clostridiales、Methanobacteriales、Ruminococcaceae、Methanobacteriaceae、Prevotellaceae、Rikenellaceae、Methanobrevibacter、Prevotellaceae UCG-003豐度較高。

圖6 差異物種分析Fig.6 Difference of species analysis

2.5 相關性分析

為進一步研究CVA 與腸道菌群的關系，利用Spearman 系數對CVA 特征（咳嗽次數、咳嗽潛伏期、體質量）與腸道菌群進行相關性分析。如表4所示，Methanobrevibacter、Ruminiclostridium 9、Bacte-roides、Escherichia-Shigella、RikenellaceaeRC9gut group、Catenibacterium、PrevotellaceaeUCG-003與CVA小鼠咳嗽次數呈負相關，與咳嗽潛伏期及體質量（42 d）呈正相關（P＜0.01 或P＜0.05）。RuminococcaceaeNK4A214 group、Alloprevotella、Ruminococcaceae UCG-013、Ruminococcus 1、coprostanoligenes group與咳嗽潛伏期呈正相關（P＜0.01 或P＜0.05）；Lactobacillus和Treponema 2與咳嗽潛伏期呈負相關（P＜0.01 或P＜0.05）。Prevotellaceae NK3B31 group與小鼠體質量呈正相關（P＜0.01）；Lactobacillus與體質量呈負相關（P＜0.01）。Lachnospiraceae NK4A136 group與咳嗽次數呈負相關（P＜0.05）；Lactobacillus與咳嗽次數呈正相關（P＜0.01）。上述結果表明小鼠腸道菌群的組成與CVA特征顯著相關。

表4 CVA特征與小鼠腸道菌群Spearman相關性分析Table 4 Spearman's rank correlation analysis between CVA characteristics and intestinal microflora of mice（n=6）

3 討論

3.1 CVA小鼠模型的驗證

CVA 是一種以頑固性慢性咳嗽為臨床唯一或主要癥狀的慢性炎癥性疾病，參考文獻［6］，選擇常用的OVA 致敏并霧化激發復制小鼠CVA 模型。該研究可見模型組小鼠在霧化激發階段體質量減輕，排便增加，腹式呼吸，煩躁、咳嗽等典型癥狀；咳嗽反應提示模型組小鼠咳嗽次數顯著增加，咳嗽潛伏期縮短；肺組織HE 染色顯示CVA 模型小鼠肺部炎性浸潤明顯，支氣管結構紊亂，氣道壁增厚等病理表現；上述癥狀與文獻記載CVA 小鼠癥狀相符［7-8］，提示OVA誘導的CVA小鼠模型復制成功。

3.2 結果分析及同類研究比較

臨床上，呼吸道疾病往往伴隨著胃腸道病變，如流感病人常常伴隨有惡心、腹瀉、腹痛等胃腸道相關疾病癥狀，此種現象在幼年患者身上尤為突出［9］。

“肺與大腸相表里”始載于《黃帝內經》，認為肺和大腸通過經絡、氣機構成表里關系，在生理和病理上相互調節。隨著對微生物的深入研究，發現定植于兩個器官中的呼吸道菌群和腸道菌群雙向相關、互相影響，成為連接肺和大腸的樞紐［10］。既往研究證實支氣管哮喘、慢性阻塞性肺炎等肺部疾病往往伴隨腸道菌群紊亂，且肺與大腸胚胎早期具有同源性，即前腸經過發展變化而形成了肺和器官，并且從功能成像角度進行了證實，研究結果為從組織胚胎學方面解釋肺腸相關提供了科學論據［11］，也為“肺與大腸相表里”的菌群變化規律性提供了依據。吳佳佳實驗研究結果表明，“從腸治肺”防治過敏性哮喘機制可能與調節腸道微生態平衡、促使腸道Treg 細胞、抑制Th17 細胞的分化，進而緩解肺部炎癥有關［12］。

本實驗發現，模型組小鼠腸道菌群OTU 數目、Chao1 指數和Simpson 指數高于對照組，該實驗結果與王永安等［13］研究結果一致，其研究表明哮喘小鼠腸道大腸桿菌及腸球菌等致病菌增加，乳酸菌減少；崔芳等［14］實驗結果同樣發現哮喘模型小鼠物種豐富度高于對照組；Kho 等［15］研究表明，患病人群腸道益生菌數量和種類顯著減少，而致病菌增多；NMDS 分析結果也提示相較于對照組，模型組小鼠腸道菌群組成發生了一定變化。因此，我們初步推測模型組小鼠物種豐富度和多樣性高可能是因為其處于應激狀態，腸道環境變化，腸道屏障能力下降，無法給益生菌提供適合的生長環境，從而使有害菌有機會大量繁殖［16-17］。

結合腸道菌群在門和屬水平的物種組成及差異物種分析發現，在門水平上，模型組的厚壁菌門（Firmicutes）豐度顯著下降，擬桿菌門（Bacteroidetes）和廣古菌門（Euryarchaeota）數量明顯增加。研究發現呼吸道病毒感染小鼠腸道擬桿菌門（Bacteroidetes）數量增加［18］；厚壁菌門（Firmicutes）能維持機體免疫系統穩定，其豐度下降與炎癥反應相關［15］；Zhang 等［19］研究認為廣古菌門（Euryarchaeota）可能與肺癌的發生發展相關。在屬水平上，結合LEfSe 分析及Spearman 系數分析發現，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和普雷沃氏菌科UCG-003 屬（Prevotellaceae UCG-003）與CVA 關系最為密切。模型組乳酸桿菌屬（Lactobacillus）豐度下降，甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和普雷沃氏菌科UCG-003 屬（Prevotellaceae UCG-003）相對豐度顯著增加，其中乳桿菌屬為腸道有益菌，增強腸道屏障功能，維持腸道內環境穩定［20］，普雷沃氏菌屬在宿主內比例上升易引起胃腸道不良反應，造成腸道環境紊亂；非小細胞肺癌患者糞便樣本中富含甲烷短桿菌屬［21］。上述結果表明，CVA 小鼠存在腸道菌群紊亂，腸道菌群物種豐富度和多樣性增加，可能與致病菌（如甲烷短桿菌屬和普雷沃氏菌科UCG-003 屬）的增多和益生菌（如乳酸桿菌屬）的顯著減少密切相關，提示小鼠CVA 的發病可能有腸道菌群的參與。這與臨床上CVA 患者腸桿菌、酵母菌的數量多于健康人，而雙歧桿菌、乳桿菌數量少于健康人結果一致［22］。

鑒于此，我們在CVA 小鼠模型復制成功的基礎上，進一步對CVA 小鼠的腸道菌群進行高通量測序分析。實驗結果發現模型組小鼠腸道菌群OTU 數目、Alpha 多樣性、Beta 多樣性、不同水平上的群落組成、差異物種組成等與對照組小鼠均有較大差異，表明CVA 小鼠伴有腸道菌群紊亂現象，因此，腸道菌群的調節可能在CVA 的治療中發揮不可替代的作用。

3.3 研究意義與不足

本文以“肺與大腸相表里”中醫理論為切入點，來探究腸道菌群與CVA 的關系，研究表明腸道菌群與CVA 的發病密切相關，為從腸道菌群治療CVA 提供實驗基礎。臨床上治療哮喘常選用氨茶堿、β1 受體阻斷劑、糖皮質激素類等藥物，長期使用會對機體產生一定的副作用。補充乳酸桿菌、降低有害菌（腸桿菌、腸球菌）數量，調節腸道微生態平衡可為臨床治療CVA 提供一條新的思路。但基于腸道菌群組成結構復雜及功能多樣的特點，有關腸道菌群對CVA 的具體作用機制仍需進一步深入研究。