北方漢族31個X染色體短串聯重復片段突變及遺傳多態性研究

徐妍，劉巖，郝世誠，張金佩，劉革新，陶玉婷，王顯眾，袁麗

（中國政法大學證據科學教育部重點實驗室，北京 100088）

女性含有兩條X 染色體，除連鎖基因外，在減數分裂時可以發生同源重組，隨機遺傳給子代一條X 染色體，與常染色體類似。男性體內只有一條X染色體，且除擬常染色區外，X 染色體與Y 染色體缺乏同源重組［1］，因此減數分裂時男性個體的XSTR 以一種類似于Y-STR 的單倍型方式傳遞給其女兒。這種獨特的遺傳方式使X-STR 在含有女性的親緣關系鑒定案件，如全同胞姐妹、同父異母半同胞姐妹、祖母和孫女、父女、母子或母女、三聯體鑒定中［2-3］能夠發揮獨特的應用價值，并且可以利用X-STR 的基因頻率或單倍型頻率計算親緣關系的似然率。當然，當聯合應用多個X-STR 檢驗時需關注基因座之間是否存在連鎖不平衡，以及突變等問題［4］。在一些家系重建案件中，檢驗更多的X-STR 來獲得更多的遺傳信息［5］，以推導出重建人員更多確切的基因分型，往往能獲得非常好的效果。既往報道的X-STR 基因座數量有限，而在復雜親緣關系鑒定時往往需要檢測更多的XSTR，這些基礎群體數據缺乏，亟需有群體遺傳信息來支撐案件的分析?；谝陨媳尘?，本文對北方漢族群體和家系樣本檢測31 個X-STR 基因座，開展了X-STR 遺傳多態性、連鎖不平衡檢驗和突變情況的研究。

1 材料與方法

1.1 樣本

在獲取知情同意條件下采集209 個中國北方漢族家系樣本，具體為：205 個母親-女兒-父親三聯體，2 個母親-女兒二聯體，2 個父親-女兒二聯體。所有家系樣本已經常染色體STR檢驗，親權指數均超過10 000，支持有親子關系。家系樣本用于觀察31 個X-STR 基因座在414 次減數分裂過程中的突變率。選擇所有家系中母親∕父親樣本，分別組成207個女性∕男性無關個體群體，總共無關個體為414 人。本研究所設計樣本實驗均經中國政法大學證據科學研究院倫理委員會批準［批準號No.2020003］，所有研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 X-STR分型檢測

用Chelex-100 法提取基因組DNA。分別按照AGCU X19 STR 試劑盒和MicroreaderTM19X Direct ID System試劑盒說明書擴增各樣本DNA。擴增產物經Applied Biosystems 3130 遺傳分析儀檢測、Gene-Mapper?ID-X v1.4軟件分析，獲得31個X-STR基因座的基因型，分別為DXS101、DXS981、DXS6789、DXS6795、DXS6800、DXS6803、DXS6807、DXS6809、DXS6810、DXS7132、DXS7133、DXS7423、DXS7424、DXS8378、DXS9902、DXS9907、DXS10074、DXS10075、DXS10079、DXS10101、DXS10103、DXS10134、DXS10135、DXS10148、DXS10159、DXS10162、DXS10164、GATA165B12、GATA172D05、GATA31E08和HPRTB。

1.3 統計學分析

對于209 個家系的X-STR 分型結果，依據遺傳規律觀察是否存在突變的基因座，并計算發生突變的基因座突變率。僅針對207 例女性X-STR基因座結果，使用Arlequin v3.5 軟件進行31 個XSTR 遺傳標記的Hardy-Weinberg 平衡檢驗及連鎖不平衡檢驗。使用Arlequin v3.5 軟件對男、女群體等位基因頻率分布進行顯著性差異分析。使用StatsX v2.0 軟件統計各基因座的等位基因頻率、觀察雜合度（heterozygosity observed，Hobs）、期望雜合度（expected heterozygosity，Hexp）、基因差異度（gene diversity，GD）、女性個人識別率（discrimination power of female，DPF）、男性個人識別率（discrimination power of male，DPM）、多態性信息量（polymorphism information content，PIC）、平均父權排除概率（mean exclusion chance，MEC）：父女或母子二聯體X 染色體標記的平均父權排除概率（MEC_Desmarais_duo）、涉及女兒的三聯體X 染色體標記的平均父權排除概率（MEC_Desmarais）。此外，將本研究的北方漢族群體分別與德國、日本、廣東漢族、四川藏族群體［6-9］進行顯著性差異分析。

2 結果

2.1 31個X-STR基因座的突變情況

根據遺傳規律觀察209個家系的X-STR 分型，經分析在19個基因座（DXS981、DXS10148、DXS7132、HPRTB、DXS9907、DXS10162、DXS7424、DXS10159、DXS10075、GATA172D05、DXS10135、DXS9902、DXS6810、DXS10164、DXS10101、DXS10079、DXS10103、DXS6789、GATA165B12）上發現29 個新發突變?？偧蚁灯骄蛔兟蕿?.002 3。在這19 個X-STR 基因座上突變率最高的基因座 是DXS10135，為0.012 1；其次是HPRTB，為0.007 2；DXS7132、DXS10159、DXS981、DXS10162基因座突變率均為0.004 8（表1）。

2.2 31個X-STR基因座的遺傳多態性

207 例女性樣本的31 個X-STR 基因座基因型分布P 值均大于0.05，均符合Hardy-Weinberg 平衡。414 例無關個體的31 個X-STR 基因座共檢測出了344 個不同的等位基因。對男、女群體等位基因分布頻率進行顯著性差異分析后的P值均大于0.05，表明31 個X-STR 等位基因頻率分布在男、女兩個群體中不存在顯著差異，同時女性群體符合Hardy-Weinberg 平衡，故將女性、男性樣本合并計算每個基因座的等位基因頻率。表2 列出了合并后的基因座等位基因頻率。等位基因的頻率分布在0.001 6-0.810 0 之間，其中DXS6800 的等位基因16頻率最高，為0.810 0。

表2 31個X-STR基因座在中國北方漢族群體中的等位基因頻率Table 2 Allele frequencies of 31 X-STR loci in Northern Han of Chinese（n=414）

續表

續表

中國北方漢族群體31個X-STR基因座的法醫學參數見表3。31 個X-STR 基因座的PIC 在0.312 7-0.912 4之間，DPM在0.330 5-0.918 1之間，DPF在0.534 0-0.987 6之間，MEC_Desmarais 在0.312 7-0.912 4，MEC_Desmarais_duo 在0.193 5-0.844 6之間。根據ChrX-STR.org 2.0數據庫（http：∕∕www.chrx-str.org∕）中的公式，31個X-STR的女性群體累積個人識別概率為1-1.578 4×10-31，男性群體累積個人識別概率為1-4.566 4×10-19。累積的平均父權排除概率，三聯體為1-2.281 9×10-17，二聯體為1-2.509 0×10-12。

表3 31個X-STR基因座在中國北方漢族群體中的法醫學參數Table 3 Forensic parameters of 31 X-STR loci in Northern Han of Chinese

2.3 31個X-STR基因座的連鎖不平衡分析結果

在31 個X-STR 基因座配對組成的465 個配對基因座中，一共30 對基因座連鎖不平衡檢驗P＜0.05，見表4。經Bonferroni校正（0.05∕465=0.000107 526 9），仍有1對基因座（DXS10103-DXS10101）具有統計學意義，存在連鎖不平衡。DXS10103-DXS10101 單倍型共有60 種，單倍型頻率在0.004 8-0.087 0 之間（表5），其中單倍型16-31的頻率最高，為0.087 0。

表4 連鎖不平衡檢驗中P值小于0.05的基因座對Table 4 Locus pairs with P value less than 0.05 in linkage disequilibrium test

表5 DXS10103-DXS10101單倍型頻率Table 5 Haplotype frequency of DXS10103-DXS10101

2.4 北方漢族群體與其他四個群體之間X-STR基因座等位基因頻率分布的比較

本研究的北方漢族群體分別與德國、日本、廣東漢族、四川藏族群體比較P值見表6。北方漢族群體與德國群體在可比較的13 個基因座上均存在明顯差異，與日本群體在可提供數據比較的14 個基因座中有8 個基因座存在差異，與廣東漢族群體在11個基因座中的3個基因座上存在差異、與四川藏族群體在可比較的19 個基因座中的6 個基因座上存在差異。

表6 北方漢族群體與其他四個群體之間X-STR基因座等位基因頻率分布的差異檢驗結果Table 6 Difference test results of allele frequency distribution of X-STR loci between northern Han population and other four populations

3 討論

經家系分析，31個X-STR在414次減數分裂中發生了29 個突變，且均為一步突變，未觀察到有一個家系出現2 個突變。除4 個突變來源不明外，有22 個突變來源于父親，有3 個突變來源于母親，父源性突變與母源性突變的觀察值比例約為7.3：1，表明了父源性突變相比較于母源性突變來說更容易發生。這種突變機率的差異可能來源于生殖細胞分化形成卵子和精子過程中細胞分裂次數的差異［10］。對于女性來說，分裂形成卵子的卵原細胞在胚胎發育結束時幾乎已經確定，而對于男性來說，精原細胞能不斷地進行有絲分裂，增加細胞數量并分化為精母細胞。因此，相比于卵子，精子的形成經歷了更多的細胞分裂，這有可能是父源性突變率更高的原因之一。除突變來源外，突變率的大小還可能與遺傳標記重復序列的結構特征、種群、樣本量大小等因素有關［11-12］。本次研究的北方漢族人群中，31個X-STR 基因座平均突變率為0.002 3，與常染色體STR 和Y-STR 的平均突變率相近［13-16］。在北方漢族群體，DXS7132、HPRTB、DXS10159、DXS981、DXS10162 和DXS10135 基因座的突變率明顯高于平均突變率。對31個X-STR 突變情況的研究，提示我們在檢測X-STR 時，特別是DXS7132、HPRTB、DXS10159、DXS981、DXS10162 和DXS10135 這幾個突變率較高的基因座，需要保持謹慎，不要因為個別基因座不符合遺傳規律而排除具有某種親緣關系，尤其是矛盾等位基因來自于父源。

在31 個X-STR 基因座中，共28 個基因座表現出了高度的多態性［17］，即PIC＞0.5，多態性較差的基因座有DXS7423、DXS7133、DXS6800。31 個XSTR 的女性群體累積個人識別概率為1-1.578 4×10-31，男性群體累積個人識別概率為1-4.566 4×10-19，可以作為常染色體STR 的有力補充來滿足個人識別的需求。31 個X-STR 三聯體累積的平均父權排除概率為1-2.281 9×10-17，二聯體累積的平均父權排除概率為1-2.509 0×10-12，可以有效地輔助常染色體STR進行復雜親緣關系的鑒定。

本次研究的北方漢族女性群體31個X-STR 基因座的基因型結果經連鎖不平衡檢驗，在Bonferroni 校正（P＜0.05∕465=0.000 107 526 9）后，仍有1 對基因座（DXS10103-DXS10101）具有顯著性差異，存在連鎖不平衡現象。因此，在案件涉及北方漢族的，統計分析中DXS10103-DXS10101按照單倍型頻率來計算。同時，本次連鎖不平衡檢驗也反映出，雖然在X 染色體上報道了4 個連鎖群，但是實際檢驗出來的X-STR連鎖不平衡并沒有理論上的多，即使是位于同一個連鎖群內，也有可能不存在連鎖不平衡的情況，這在其他研究中也有類似的報道［18］。

不同群體之間的顯著性差異研究可以發現，北方漢族群體與德國群體存在明顯差異，與日本群體、四川藏族群體、廣東漢族群體均存在一定程度上的差異。人種差異越大、地域分布越廣泛，群體之間的差異也越大。這可能源于更為相近的地理距離或更為接近的種群在遺傳上更具有同源性。因此在實踐中應用X-STR時選擇相對應的群體是至關重要的。