miR-130b-5p下調胰島素樣生長因子-1抑制人絨毛膜滋養層細胞遷移及侵襲的作用及機制

相萌，張旭東

（1.西安醫學院臨床醫學院婦產科教研室，陜西西安 710021；2.西安醫學院臨床醫學院拉吉姆實驗室，陜西西安 710021）

胎兒生長受限（fetal growth restriction，FGR）是最常見的產前疾病之一，可造成早產及成年期神經障礙及慢性疾病發生率增加，懷孕初期子宮螺旋動脈重構不足是造成其發生的主要原因，而人絨毛膜滋養層細胞侵襲功能異?？蓪е伦訉m螺旋動脈重構障礙的發生，因此了解人絨毛膜滋養層細胞的侵襲、遷移機制，對胎兒的生長發育及健康十分重要［1-3］。微小RNA（miRNA）作為轉錄后調節劑，可與其靶基因mRNA 3'-非翻譯區（3'-UTR）特異性結合，以此抑制其翻譯，從而參與FGR、先兆子癇、流產、妊娠期糖尿病等妊娠疾病的發生［4］。妊娠期糖尿病可導致FGR 的發生，而在妊娠期糖尿病患者胎盤滋養細胞系中miR-130b 表達水平異常增加，除此之外miR-130b-5p 與多種細胞的侵襲、遷移能力有關［5-6］。胰島素樣生長因子-1（insulinlike growth factor-1，IGF-1）主要分泌于胎盤中，其作為子宮內生長調節劑，在FGR 發生時其循環濃度異常降低［7］。研究發現在膠質母細胞瘤中miR-130b 與IGF-1表達水平呈負相關關系［8］。目前，關于miR-130b-5p 是否可通過調控IGF-1來影響人絨毛膜滋養層細胞（HTR-8∕SVneo）遷移及侵襲還未可知，因此本研究通過對其探究，以期為FGR 的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

HTR8∕SVneo 細胞（南京賽泓瑞生物科技有限公司，貨號：SHC1187）；Lipofectamine?2000 Transfection Reagent 轉染試劑盒（杭州沃森生物技術有限公司，貨號：11668019）；青鏈霉素、DMEM 基礎培養基、胎牛血清、胰酶溶液（上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號：0503、ZQ-100、0025、0103）；蛋白提取試劑盒（武漢純度生物科技有限公司，貨號：CD-13559-ML）；HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗抗體（艾美捷科技有限公司，貨號：AAT-16793）；BCA蛋白檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：PC0020）；兔抗β-actin、波形蛋白（Vimentin）、c-Myc、神經型鈣粘附蛋白（N-cadherin）抗體（Cell Signaling Technology，貨號：4967、5741、5605、13116）；細胞周期蛋白D1（CyclinD1）（Biorbyt，貨號：orb77046）；兔抗基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、鈣粘附蛋白E（E-cadherin）抗體（Proteintech，貨號：20874-1-AP、10375-2-AP、10373-2-AP）；pcDNA3.1、pcDNA3.1-IGF-1、miR-130b-5pmimics、miR-NC 由賽默飛世爾科技合成；CCK-8 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（貝博-Bestbio，貨號：BB-4202）。

CFX384?Touch 熒光定量PCR 系統購自伯樂（Bio-Rad）公司；M4激光全息細胞成像及分析系統購自瑞典Phiab 公司；Invitrogen 凝膠成像系統購自賽默飛。

1.2 實驗方法

1.2.1 HTR8∕SVneo 細胞培養 將已復蘇的HTR8∕SVneo 細胞接種于含1%青鏈霉素及10 g∕L 胎牛血清的DMEM 培養基后，在體積分數5%CO2、37 ℃培養箱中培養到細胞融合至約80%時經2.5 g∕L 胰酶消化、傳代培養。

1.2.2 雙熒光素酶報告基因檢測miR-130b-5p 和IGF-1 的靶向關系 TargetScan 網址確定miR-130b-5p和IGF-1的結合位點并對二者間的靶向關系進行驗證。將與miR-130b-5p 靶向序列相結合的IGF-1 3＇-UTR 片段經擴增、酶切后進行連接，構建野生型pmirGLO-IGF-1-wt，再通過基因突變技術對結合位點進行突變，構建突變型pmirGLOIGF-1-mut 載體；根據轉染試劑盒說明書將pmir-GLO-IGF-1-wt 及pmirGLO-IGF-1-mut 分別與miR-130b-5p mimics 和miR-NC 進行共轉染，分為pmirGLO-IGF-1-wt+miR-130b-5p mimics 組、pmirGLO-IGF-1-wt+miR-NC 組、pmirGLO-IGF-1-mut+miR-130b-5p mimics 組、pmirGLO-IGF-1-mut+miR-NC 組，于48 h 后添加報告基因細胞裂解液（200μL）及熒光素酶反應液（50μL）檢測熒光強度A，之后添加反應終止液檢測熒光強度B，A∕B 即為熒光素酶相對活性。

1.2.3 分組及HTR8∕SVneo 細胞轉染 設置對照組、miR-NC 組、miR-130b-5pmimics 組、miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1 組和miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1-IGF-1 組；將HTR8∕SVneo細胞（1mL）以2×106個∕孔的密度接種到6孔板中（設置5個復孔）培養至貼壁后，按照Lipofectamine?2000說明書進行操作，以5 nmol∕L 為終濃度分別將miR-NC、miR-130b-5pmimics、pcDNA3.1、pcDNA3.1-IGF-1 轉至相應的HTR8∕SVneo 細胞中后培養48 h，檢測miR-130b-5p表達水平。

1.2.4 qRT-PCR檢測HTR8∕SVneo細胞樣本中miR-130b-5p 及IGF-1 表達水平 將各組轉染后的HTR8∕SVneo 細胞根據Trizol 法提取細胞中總RNA并檢測其濃度，取所得RNA反轉錄為cDNA后進行qRT-PCR擴增（5個復孔）；引物由Oligo 7軟件設計（表1），上海生工合成，以U6和GAPDH為內參分別對miR-130b-5p 及IGF-1進行標準化，2-ΔΔCt計算基因表達水平。

表1 qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers

1.2.5 CCK-8法檢測HTR8∕SVneo細胞增殖情況將轉染后的HTR8∕SVneo 細胞以1×104個∕孔的密度接種于96 孔板中（重復5 孔），培養24 h 后添加CCK-8（10μL∕孔）培養2 h后在酶標儀450 nm 處測定OD 值，計算HTR8∕SVneo 細胞增殖抑制率(%)=[(對照組OD值-實驗組OD值)∕(對照組OD值-空白組OD值)]× 100%。

1.2.6 全息細胞儀分析HTR8∕SVneo 細胞遷移能力 將轉染后的HTR8∕SVneo 細胞以2×105個∕孔的密度接種于6 孔板中培養24 h 后，通過激光全息細胞分析及成像系統監測細胞在24 h 內的遷移情況。

1.2.7 Transwell 法檢測HTR8∕SVneo細胞侵襲能力用無血清培養基以1：8 的比例稀釋Matrigel后加入到Transwell 小室上室4 h 孵育，將各組200μL HTR8∕SVneo 細胞懸液以1×105個∕mL 接種到上室后在下室加入600 μL DMEM 培養基培養12 h，PBS 清洗后用棉簽擦拭上室HTR8∕SVneo 細胞，10 min 甲醇固定后30 min 結晶紫染色，選取5 個視野進行觀察，對穿膜細胞進行計數。

1.2.8 Western blot 檢測HTR8∕SVneo細胞中的蛋白表達情況添加400μL RIPA 蛋白裂解液裂解HTR8∕SVneo 細胞后12 000 r∕min（r=10 cm）10 min離心取上清，BCA 法定量分析總蛋白；將40 μg 蛋白樣品通過SDS-PAGE 凝膠電泳（40 μg∕孔）進行分離后在低溫條件下將蛋白轉移至PVDF膜上，1 h脫脂奶粉封閉后加入兔抗MMP9、MMP2、c-Myc、CyclinD1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-actin、IGF-1 抗體（1：1 000）一抗孵育（4 ℃）過夜，用Tris-HCl 緩沖鹽溶液加Tween（Tris Buffered saline Tween，TBST）進行洗膜后添加HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗（1：10 000）進行孵育2 h，TBST 洗膜、化學發光試劑（ECL Reagent）顯色，蛋白凝膠成像儀顯影觀察后Image J 軟件檢測條帶灰度值，β-actin為內參，計算蛋白含量（重復5孔）。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 miR-130b-5p 和IGF-1 在HTR8/SVneo 細胞中的靶向關系驗證

TargetScan 在線網址預測結果顯示：miR-130b-5p 和IGF-1二者間具有靶向結合位點（圖1）；如圖2 所示，熒光素酶報告基因實驗結果顯示：與pmirGLO-IGF-1-wt+miR-NC 組相比，pmirGLOIGF-1-wt+miR-130b-5p mimics組熒光素酶活性顯著降低（t=6.040，P＜0.001）；其余兩組熒光素酶活性無顯著變化（t=0.243，P＞0.05）。

圖1 miR-130b-5p和IGF-1間的具有靶向結合位點Fig.1 Targeted binding site between miR-130b-5p and IGF-1

圖2 熒光素酶活性檢測Fig.2 Luciferase activity assay

2.2 miR-130b-5p及IGF-1表達水平檢測

如表2 所示，相較于對照組，HTR8∕SVneo 細胞中miR-130b-5p、IGF-1 蛋白及mRNA 表達水平在miR-NC 組中的差異無統計學意義（P＞0.05）；相較于miR-NC 組，miR-130b-5pmimics組中miR-130b-5p 表達水平顯著增加，IGF-1 蛋白及mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05；表2，圖3）。

圖3 HTR8/SVneo細胞中IGF-1蛋白表達情況Fig.3 Expression of IGF-1 protein in HTR8/SVneo cells

表2 miR-130b-5p及IGF-1表達水平檢測Table 2 Detection of expression levels of miR-130b-5p and IGF-1（n=5，）

表2 miR-130b-5p及IGF-1表達水平檢測Table 2 Detection of expression levels of miR-130b-5p and IGF-1（n=5，）

Compared with the miR-NC group，1）P＜0.05.IGF-1：insulin-like growth factor-1.

2.3 miR-130b-5p 對HTR8/SVneo細胞增殖的影響

相較于對照組，HTR8∕SVneo 細胞增殖抑制率、c-Myc 和CyclinD1 表達水平在miR-NC 組中的差異無統計學意義（P＞0.05）；相較于miR-NC組，miR-130b-5p mimics 組中細胞增殖抑制率顯著增加，c-Myc 和CyclinD1 表達水平顯著降低（P＜0.05）；相較于miR-130b-5p mimics 組，HTR8∕SVneo 細胞增殖抑制率、c-Myc 和CyclinD1表達水平在miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1 組中的差異無統計學意義（P＞0.05）；相較于miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1 組，miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1-IGF-1 組中細胞增殖抑制率顯著降低，c-Myc 和CyclinD1 表達水平顯著增加（P＜0.05；表3，圖4）。

表3 miR-130b-5p對HTR8/SVneo細胞增殖的影響Table 3 The effect of miR-130b-5p on the proliferation of HTR8/SVneo cells（n=5，）

表3 miR-130b-5p對HTR8/SVneo細胞增殖的影響Table 3 The effect of miR-130b-5p on the proliferation of HTR8/SVneo cells（n=5，）

Compared with the miR-NC group，1）P＜0.05；Compared with the miR-130b-5p mimics+pcDNA3.1 group，2）P＜0.05.

圖4 miR-130b-5p對HTR8/SVneo細胞增殖相關蛋白的影響Fig.4 The effect of miR-130b-5p on the proliferation-related proteins of HTR8/SVneo cells

2.4 miR-130b-5p 對HTR8/SVneo細胞遷移的影響

相較于對照組，HTR8∕SVneo 細胞遷移距離在miR-NC 組的差異無統計學意義（P＞0.05）；相較于miR-NC 組，miR-130b-5p mimics 組中細胞遷移距離顯著降低（P＜0.05）；相較于miR-130b-5p mimics 組，miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1 組中HTR8∕SVneo 細胞遷移距離的差異無統計學意義（P＞0.05）；相較于miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1 組，miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1-IGF-1 組中細胞遷移距離顯著增加（P＜0.05；圖5）。

圖5 miR-130b-5p對HTR8/SVneo細胞遷移的影響Fig.5 The effect of miR-130b-5p on the migration of HTR8/SVneo cells

2.5 miR-130b-5p 對HTR8/SVneo細胞侵襲的影響

如表4 所示，相較于對照組，HTR8∕SVneo 細胞侵襲細胞數、MMP9 和MMP2 表達水平在miR-NC組的差異無統計學意義（P＞0.05）；相較于miR-NC組，miR-130b-5p mimics 組中細胞侵襲細胞數、MMP9和MMP2表達水平顯著降低（P＜0.05）；相較于miR-130b-5p mimics 組，miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1組中HTR8∕SVneo細胞侵襲細胞數、MMP9 和MMP2 表達水平的差異無統計學意義（P＞0.05）；相較于miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1組，miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1-IGF-1 組中細胞侵襲細胞數、MMP9 和MMP2 表達水平顯著增加（P＜0.05；圖6，圖7）。

圖6 miR-130b-5p對HTR8/SVneo細胞侵襲的影響Fig.6 The effect of miR-130b-5p on the invasion of HTR8/SVneo cells

圖7 miR-130b-5p對HTR8/SVneo細胞侵襲相關蛋白的影響Fig.7 Effects of miR-130b-5p on invasion-related proteins of HTR8/SVneo cells

表4 miR-130b-5p對HTR8/SVneo細胞侵襲的影響Table 4 The effect of miR-130b-5p on the invasion of HTR8/SVneo cells（n=5，）

表4 miR-130b-5p對HTR8/SVneo細胞侵襲的影響Table 4 The effect of miR-130b-5p on the invasion of HTR8/SVneo cells（n=5，）

Compared with the miR-NC group，1）P＜0.05；Compared with the miR-130b-5p mimics+pcDNA3.1 group，2）P＜0.05.MMP9：matrix metalloproteinase 9；MMP2：matrix metalloproteinase 2.

2.6 miR-130b-5p 對HTR8/SVneo細胞Ecadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白表達的影響

如表5 所示，相較于對照組，HTR8∕SVneo 細胞中E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 表達水平在miR-NC 組的差異無統計學意義（P＞0.05）；相較于miR-NC 組，miR-130b-5p mimics組中E-cadherin表達水平顯著增加，Vimentin 和N-cadherin 表達水平顯著降低（P＜0.05）；相較于miR-130b-5p mimics 組，miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1 組中E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 表達水平的差異無統計學意義（P＞0.05）；相較于miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1 組，miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1-IGF-1 組中E-cadherin 表達水平顯著降低，Vimentin 和N-cadherin表達水平顯著增加（P＜0.05；圖8）。

表5 miR-130b-5p對HTR8/SVneo細胞E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白表達的影響Table5 EffectsofmiR-130b-5pontheexpressionofE-cadherin，VimentinandN-cadherinproteinsinHTR8/SVneocells（n=5，）

表5 miR-130b-5p對HTR8/SVneo細胞E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白表達的影響Table5 EffectsofmiR-130b-5pontheexpressionofE-cadherin，VimentinandN-cadherinproteinsinHTR8/SVneocells（n=5，）

Compared with the miR-NC group，1）P＜0.05；Compared with the miR-130b-5p mimics+pcDNA3.1 group，2）P＜0.05.

圖8 miR-130b-5p對HTR8/SVneo細胞EMT相關蛋白的影響Fig.8 Effects of miR-130b-5p on EMT-related proteins in HTR8/SVneo cells

3 討論

FGR 是一種產科疾病，可導致胎兒生長受損，增加圍產期死亡率［9-11］。絨毛膜滋養層細胞是胎盤的主要組成細胞之一，侵襲功能受到抑制會造成子宮螺旋動脈重塑障礙、胎盤缺氧缺血的發生，從而導致FGR、先兆子癇和胎盤增生等妊娠并發癥的發生［3，12］。因此詳細了解絨毛膜滋養層細胞在FGR中的侵襲機制對疾病治療極其重要。

miRNA 作為高度保守的非編碼RNA，近幾年有研究發現其參與調控絨毛膜滋養層細胞的侵襲和遷移［13］。miR-130b-5p 參與多種癌癥的侵襲遷移過程，其在宮頸癌組織中表達異常降低，通過促進ELK1表達來促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移［14］。而最近有研究表明miR-130b-3p 在妊娠期糖尿病胎盤滋養層細胞中表達異常增加，沉默其表達可保護細胞免受氧化應激損傷［5］。MMP9、MMP2 由于可降解子宮內膜主要成分Ⅳ型膠原而在HTR8∕SVneo 細胞侵襲子宮內膜過程中具有重要作用［3］。人絨毛膜滋養層細胞經過上皮間充質轉化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）滲入母體蛻膜間質和血管中，因此EMT 過程對絨毛膜滋養層細胞的侵襲功能十分重要［15］。本研究發現miR-130b-5p 過表達可顯著促進HTR8∕SVneo 細胞增殖抑制率和E-cadherin 表達水平，降低c-Myc、CyclinD1表達水平、遷移距離、侵襲細胞數、MMP9、MMP2、Ncadherin、Vimentin 表達水平，該結果表明miR-130b-5p 過表達可顯著抑制HTR8∕SVneo 的增殖和遷移、侵襲能力。

研究發現在發育70 d 的豬仔肝臟中miR-130b-3p靶向促進IGF-1表達［16］。本研究雙熒光素酶報告基因結果顯示，IGF-1是miR-130b-5p 的潛在靶基因；miR-130b-5p 過表達可顯著降低IGF-1表達水平，與前人研究結果相似。IGF-1 已被證明是滋養層細胞增殖和侵襲的重要調節劑，IGF-1 表達上調可促進MMP-2 表達，以此促進HTR-8∕SVneo 細胞的侵襲能力［17-18］。胎盤功能不全造成的宮內生長受限患者胎盤中由于胰島素樣生長因子結合蛋白1（insulin-like growth factor-binding protein-1，IGFBP-1）過度磷酸化，導致IGF-1 表達水平顯著降低［19］。本研究發現miR-130b-5pmimics+pcDNA3.1-IGF-1 組對miR-130b-5p 所造成的細胞增殖、侵襲和遷移的抑制起到逆轉作用。提示，miR-130b-5p 過表達對HTR8∕SVneo 細胞的增殖、侵襲和遷移的抑制可能與其抑制IGF-1表達有關。

綜上所述，miR-130b-5p 過表達可能通過抑制IGF-1表達來抑制HTR8∕SVneo 細胞的增殖、侵襲和遷移。本研究不僅為FGR 的發生機制研究提供進一步參考，還為其治療提供了新的潛在治療靶點。但在未來的研究中還需對miR-130b-5p 在FGR 中的下游調控機制進行深入探究。