兩個大豆ERD15基因的克隆、生物信息學分析及功能初步鑒定

曹沙沙，吳楠，汪麗萍，劉曉宇，汪煒奇，張貴峰，王法微，李曉薇

（吉林農業大學生命科學學院，生物反應器與藥物開發教育部工程研究中心，吉林 長春，130118）

大豆（Glycine max）是世界重要的糧油兼用作物，含有豐富的蛋白質和油脂，是人類優質蛋白及畜牧業飼料蛋白的主要來源之一[1～3]。此外，大豆富含異黃酮和酚類化合物[4]等植物化學物質，有助于降低心臟病或心血管疾病、骨質疏松癥和癌癥[5]等風險，與人的健康息息相關。自然界中干旱脅迫是影響全球大豆生長、發育和產量的主要因素，通常使大豆產量減少約40%，根據干旱程度和生長階段的不同甚至減少高達80%[6～8]。要解決這個問題，需要培育出耐旱大豆新品種[9]。植物在受到干旱脅迫時，自身本能地會從生理、細胞和分子水平上做出反應，誘導多個脅迫相關基因的表達，促進一些參與抗旱防御代謝產物的合成，從而調節植物對干旱脅迫的耐受性[10，11]。

ERD（early responsive to dehydration）作為早期干旱響應基因，在植物逆境脅迫和生長發育中具有功能性作用[12]。在擬南芥中已鑒定出16 個ERD基因的cDNA，它們屬于不同的基因家族，編碼不同的蛋白質[13]。ERD1編碼葉綠體ATP依賴蛋白酶，受干旱和高鹽脅迫誘導表達[14，15]；ERD13編碼植物特異性硫代谷胱甘肽轉移酶；ERD14編碼脫水素蛋白，該蛋白的累積和環境的干旱脅迫密切相關[12]；ERD16編碼一種泛素化延伸蛋白[16]；ERD15基因受各種生物因子和非生物因子的誘導表達，是ABA（脫落酸）反應和依賴SA（水楊酸）防御途徑的重要調節器[17]。目前對ERD15的研究表明其主要與脅迫響應有關：在擬南芥干旱脅迫處理1 h 后檢測到ERD15基因在葉片強烈表達，也被證明是ABA 信號的負調節因子[18]；葡萄ERD15基因經一系列反應后增強其耐寒性[19]；番茄在受到干旱脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫時體內的ERD15基因表達量增加[20]。所以，不同植物中ERD15基因可能具有不同的功能。

大豆ERD15基因家族共有6 個成員，前期從抗逆基因表達文庫中篩選獲得GmERD15a、GmERD15b、GmERD15c三個基因。本文主要對GmERD15a和GmERD15b進 行 研 究，GmERD15c基因另文研究發表。本研究初步探究兩個大豆ERD15基因的功能，以Williams 82 大豆為實驗材料，克隆獲得GmERD15a和GmERD15b基因全長后，進行生物信息學分析，并研究其組織表達特性和抗逆性，為深入研究該基因的功能和作用機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

Williams 82 大豆材料，pMD18-T 載體，pCAMBIA3301 植物表達載體，pYES2 酵母表達載體，大腸桿菌DH5α，釀酒酵母INVSc1。

1.2 方法

1.2.1 RNA 的提取和cDNA 的制備 使用RNAiso Plus（TaKaRa 公司）試劑提取大豆不同組織部位的RNA，并使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser-Perfect Real Time 試劑盒將其反轉錄成cDNA。

1.2.2 兩個大豆ERD15基因的克隆 通過NCBI查找GmERD15a和GmERD15b的基因序列，使用Primer 5 軟件設計基因全長引物（表1）。以反轉錄的大豆根cDNA 為模板，進行PCR 擴增獲得目的基因片段，獲得的PCR 產物經凝膠電泳后使用DNA凝膠回收試劑盒進行膠回收，膠回收產物連接至表達載體并轉入大腸桿菌DH5α 中，測序成功，保存于-80℃冰箱備用。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers of the test

1.2.3 兩個大豆ERD15 蛋白的生物信息學分析通過DNAMAN 軟件對多個植物的ERD15 家族成員進行多重序列比對；利用MEGA X 軟件構建ERD15系統進化樹，通過iTOL（https://itol.embl.de/）對該系統進化樹進行美化；使用ProtParam（https://web. expasy. org/protparam/）對GmERD15a 和GmERD15b 進行蛋白理化性質分析；使用ProtScale（https：//web.expasy. org/protscale/）對兩個蛋白進行親疏水性分析；通過SOPM（https://npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa automat. pl?page=npsa_sopma. Html）對兩個蛋白質的二級結構進行預測，并通過SWISS-MODEL（http://swissmodel. expasy. org/）構建兩個蛋白質的三級結構模型；使用MEME（https://meme-suite. org/meme/）分析兩個蛋白質的motif；通過在線網站plantCARE（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）[21]和TBtools 對ERD15 的啟動子元件進行分析；利用PSORT（https://www. genscript.com/psort. html）在線網站進行亞細胞定位預測分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR 根據基因全長設計基因GmERD15a和GmERD15b的實時熒光定量PCR引物[22]（表1），使用購于Monad 公司的MonAmp TM ChemoHS qPCR Mix試劑進行實時熒光定量PCR。

1.2.5 酵母體系中兩個大豆ERD15基因的抗逆性鑒 定 構 建 pYES2-GmERD15a 和 pYES2-GmERD15b 表達載體，轉入釀酒酵母INVSc1 細胞中。將轉化后的酵母細胞使用YPD 液體培養基培養后，調節OD600為0.5，用0.9%的NaCl依次稀釋濃度至10-1、10-2、10-3、10-4。配置YPD 固體培養基，分別加入1 mol/L 甘露醇、700 mmol/L NaCl、20 mmol/L NaHCO3進行脅迫處理，將不同濃度梯度的酵母細胞在YPD 空白培養基和脅迫培養基上培養3～7 d，以YPD 空白培養基為對照觀察并記錄不同脅迫條件下對照酵母細胞與重組酵母細胞的生長狀態[23]。

2 結果與分析

2.1 GmERD15a和GmERD15b基因的克隆

以大豆根組織cDNA 為模板，進行PCR 擴增，獲得GmERD15a、GmERD15b基因全長；電泳結果顯示：GmERD15a基因全長378 bp，GmERD15b基因全長318 bp（圖1）。GmERD15a和GmERD15b分別編碼125和105個氨基酸。

圖1 GmERD15基因片段擴增檢測Fig.1 Amplification of GmERD15 gene fragment

2.2 大豆ERD15基因家族的生物信息學分析

2.2.1 ERD15 的多重序列比對以及進化樹分析通過NCBI 篩選獲得11 個物種的17 個ERD15 家族成員；ERD15 蛋白家族成員都在120～170 氨基酸之間，基因組學研究證實，它們都包含一個與PABP（poly（A）binding protein）相互作用的高度保守功能結構域PAM2。通過DNAMAN 將ERD15 的家族成員進行多重序列比對（圖2），結果表明GmERD15 蛋白與其它物種的蛋白序列之間的序列相似度比較高，說明該蛋白在進化上比較保守。

圖2 GmERD15與近緣植物ERD15蛋白序列的多重比對Fig.2 Alignment analysis between GmERD15 and ERD15 proteins sequences in kindred plant species

為進一步探究GmERD15 與不同物種的進化關系，利用MEGA7.0 軟件通過鄰接法得到11 個物種基因家族的系統進化樹（圖3）。該系統進化樹結果顯示，GmERD15a與GmERD15c相似性最高，其次是JrERD15；GmERD15b 與GmERD15f 相似性最高，其次是VaERD15。

圖3 GmERD15與其他植物ERD15蛋白的系統進化分析Fig.3 Phylogenic analysis of GmERD15 and ERD15 proteins in kindred plant species

2.2.2 GmERD15a 和GmERD15b 蛋白的理化性質分析 通過ProtParam 在線網站分析（表2），GmERD15a 的分子式為C667H984N178O192S4，分子量為14 696.47 Da，理論等電點為5.0，21 個帶負電荷殘基總數（Asp+Glu）、16 個帶正電荷殘基總數（Arg +Lys），因此該蛋白帶負電，預測該蛋白為酸性蛋白，不穩定系數為45.97，脂肪系數為60.8，親疏水性平均系數為-0.728。

表2 GmERD15蛋白的理化性質Table 2 Physicochemical properties of GmERD15 proteins

GmERD15b 的分子式分別為C536H769N131O176S1，分子量為11 895.83 Da，理論等電點3.82，22 個帶負電荷殘基總數（Asp + Glu）、4 個帶正電荷殘基總數（Arg+Lys），因此該蛋白帶負電，預測該蛋白為酸性蛋白，不穩定系數為52.91，脂肪系數為67.81，親疏水性平均系數為-0.521。

通過ProtScale 在線網站分析，結果顯示：GmERD15a 和GmERD15b 蛋白均為親水性蛋白質（圖4）。

圖4 GmERD15a(A)和GmERD15b(B)蛋白的親疏水性分析Fig.4 Analysis of hydrophilic and hydrophobic of GmERD15a(A)and GmERD15b(B)

2.2.3 GmERD15a 和GmERD15b 蛋白結構預測及啟動子元件分析 根據NCBI 數據庫獲得兩個大豆ERD15基因序列信息，預測蛋白質的二級和三級結構并對其啟動子元件進行分析。預測蛋白質結構如圖5A、5B 所示，GmERD15a 和GmERD15b 蛋白質的二級結構由α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲和片層結構組成；GmERD15a 蛋白中無規則卷曲所占組分最高，為40. 80%；其次為α-螺旋，占29.60%；β-轉角所占組分為8.00%，片層結構占21.60%；GmERD15b 蛋白中無規則卷曲所占組分最高，為41. 90%；其次為α-螺旋，占33.33%；片層結構占15.24%；β-轉角所占組分為9.52%。兩個蛋白質的三級結構如圖5C、5D所示。

圖5 GmERD15a和GmERD15b蛋白的結構預測Fig.5 Structural prediction of GmERD15a and GmERD15b proteins

通過NCBI 數據庫下載得到兩個大豆ERD15基因起始密碼子ATG 上游2000 bp 序列，利用Plant-CARE 網站分析啟動子順式作用元件。結果顯示（圖6），ERD15起始密碼子上游存在激素響應應答元件（TATC-box、P-box、ABRE, TCA-element）以及逆境脅迫響應順式元件（ARE, TC-rich repeats,LTR,MBS）。

圖6 GmERD15a和GmERD15b的啟動子元件分析Fig.6 Promoter element analysis of GmERD15a and GmERD15b

2.2.4 GmERD15a 和GmERD15b 蛋白的亞細胞定位預測分析 通過PSORT 進行亞細胞定位預測分析，結果表明（表3），GmERD15a 與GmERD15b 蛋白存在于細胞質中的可能性最大，其次是細胞核。前人研究結果表明，GmERD15a 蛋白定位于細胞核[24]。

表3 GmERD15的亞細胞定位預測Table 3 Subcellular localization prediction of GmERD15

2.3 GmERD15a 和GmERD15b 基因的組織特異性表達分析

為了研究GmERD15基因的組織表達模式，對大豆的根、莖、葉、花、20 d 的胚（指開花后20 d 的胚）、30 d、40 d、50 d及68 d的胚、種子進行了實時熒光定量PCR。 結果顯示，GmERD15a與GmERD15b在不同組織中均有表達（圖7）。GmERD15a在20 d的胚中表達量最高，其次依次是根、種子、花、葉、莖；GmERD15b在根中的表達量最高，其次依次是花、20 d的胚、葉、莖、種子。

圖7 GmERD15a和GmERD15b組織表達情況Fig.7 Tissue expression analysis of GmERD15a and GmERD15b

2.4 GmERD15a 和GmERD15b 基因在酵母體系中的抗逆性鑒定

將構建完成的酵母表達載體轉入釀酒酵母細胞中，在酵母體系中進行驗證。分別在干旱脅迫、鹽脅迫和堿脅迫培養基上培養不同濃度梯度的酵母細胞，實驗結果顯示（圖8），正常條件下，重組酵母與對照酵母的生長無明顯差異；由10-2、10-3濃度下可以明顯看出，在YPD 培養基上培養的酵母細胞與在脅迫培養基上培養的酵母細胞相比長勢較好，說明脅迫條件影響了對照酵母和重組酵母的生長；同樣在10-2、10-3濃度下可以明顯看出，在干旱脅迫和鹽脅迫條件下，對照酵母與重組酵母相比長勢較好，說明重組酵母對干旱脅迫和鹽脅迫更加敏感，在堿脅迫條件下對照酵母和重組酵母的生長無明顯差異。由此可見，GmERD15a、GmERD15b基因可能為干旱脅迫和鹽脅迫的負調節因子。

圖8 GmERD15a和GmERD15b在酵母體系中的抗逆性鑒定Fig.8 Identification of stress resistance of GmERD15a and GmERD15b in yeast system

3 討論與結論

早期干旱響應基因ERD15最早在擬南芥中被發現，編碼一個小的酸性蛋白質[25]。本研究以大豆根cDNA 為模板克隆出GmERD15a和GmERD15b基因的全長，GmERD15a基因全長378 bp，編碼125 個氨基酸，GmERD15b基因全長318 bp，編碼105 個氨基酸，通過生物信息學分析，結果顯示，GmERD15a和GmERD15b 均為酸性、親水性蛋白。Ziaf[20]對番茄ERD15基因進行組織表達分析，結果表明SpERD15在不同組織中均有表達。本實驗結果顯示GmERD15a和GmERD15b基因在大豆不同組織中也均有表達。

擬南芥ERD15參與多種生物脅迫和非生物脅迫反應[26]。前人在擬南芥中研究發現，AtERD15在干旱誘導后表達，在干旱脅迫條件下擬南芥AtERD15敲除株系比野生型和超表達株系長勢好，因此AtERD15為干旱負調控因子[17,18]；本研究通過酵母表達體系驗證GmERD15a基因和GmERD15b基因的抗逆性，實驗結果表明，GmERD15a基因和GmERD15b基因為干旱脅迫和鹽脅迫的負調控因子。先前學者通過與NRP-B 啟動子的酵母雜交篩選鑒定出GmERD15a在內質網和滲透脅迫誘導下激活NRP 基因的表達；GmERD15a在體內外結合并激活NRP-B 啟動子，表現出轉錄活性[27]；不僅在大豆中驗證ERD15具有轉錄激活活性，桑樹ERD15也被Saeed[28]證明具有轉錄激活活性。

本研究初步探究GmERD15a和GmERD15b基因的功能，為深入研究該基因的作用機理提供理論依據，有助于篩選或培育耐旱、耐鹽大豆新品種。