花生AhMYB113異位表達促進煙草花青素積累

李明，曹慧，許瑞瑞

（濰坊學院生物與農業工程學院/山東省高等學校生物化學與分子生物學重點實驗室，山東濰坊，261061）

花生（Arachis hypogaeaL.）是我國重要的油料作物，是食用植物油脂和蛋白質的重要來源之一。我國花生種植面積約7000 萬畝（約467 萬公頃），總產約1600萬噸，位居世界第一?；ㄉ土恳话阍?0%左右，單位面積產油量分別是大豆的4 倍和油菜的2倍，相對于其它油料作物，花生具有種植規模大、產油效率高、油脂品質好、市場競爭力強等優勢。因此，花生產業對我國國民經濟的發展和糧油安全具有重要的戰略意義。

花青素是一類重要的天然植物色素，廣泛存在于植物的花、果實、莖和葉片中，在植物的生長發育過程中具有重要作用，如：吸引昆蟲、鳥類等，為其傳播花粉散播種子?；ㄇ嗨厥且环N酚類色素，其基本結構單元是3,5,7-三羥基-2-苯基苯并呋喃，作為一種非常重要的抗氧化劑，可通過抽氫反應將活躍的自由基轉變成穩定的自由基，從而中斷鏈式反應，保護生物體免受自由基侵害[1]。植物體內花青素種類繁多，黑枸杞中檢測到37 種花青素[1]。根據R1和R2取代基的不同，可以形成多種花青素，植物中常見有天竺葵色素（pelargonidin）、矢車菊色素（cyanidin）、飛燕草色素（delphindin）、芍藥色素（peonidin）、牽?；ㄉ兀╬etunidin）和錦葵色素（malvidin），自然界中絕大多數花青素種類都是由這6 種花青素衍生而來[2,3]?；ㄇ嗨匕踩珶o毒，水溶性較好，是一種理想的食品添加劑，但花青素穩定性不高，溫度、光照、pH值、金屬離子、糖等因素均會影響其穩定性[4]。研究表明，低溫、干旱等逆境脅迫能夠促進植物體內花青素積累，從而緩解氧自由基的毒害，提高植物逆境適應能力[5～9]。

花青素生物合成主要受兩類基因控制：一類是結構基因，編碼花青素生物合成途徑中的關鍵酶，如查爾酮合成酶（CHS）、查爾酮異構酶（CHI）、黃烷酮3-羥化酶（F3H）、二羥基黃酮醇還原酶（DFR）以及花色素苷合成酶（ANS）等，它們共同催化苯丙氨酸和丙二酰經苯丙烷類途徑合成各種花青素[10]；另一類是調控基因，編碼蛋白在轉錄水平上調控結構基因的表達模式和表達強度，如MYB、bHLH 和WD40轉錄因子基因[11,12]。

研究表明，MYB 轉錄因子家族是一個成員數量異常龐大的轉錄因子家族，廣泛存在于真核生物中。植物體內一般含有大約200 個MYB 轉錄因子基因，如：擬南芥中已經發現了198 個，水稻中發現了185 個，金魚草、玉米、棉花、番茄、蘋果等植物中也發現了大量的MYB基因[13]。MYB 轉錄因子都含有一個高度保守的DNA 結合區域，即MYB 結構域，該結構域是一個大約50個氨基酸組成的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列。根據MYB 結構域的數量，可以將植物中MYB 轉錄因子分 成4 個 亞 類：1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB 和4R-MYB，其中R2R3-MYB 轉錄因子是植物中數量較多一類蛋白，其N 端含有兩個保守的R 結構-R2R3，C 端為不保守的轉錄激活或轉錄抑制結構域[14,15]。

花青素生物代謝途徑是一個非常復雜的調控網絡，正調控和負調控調節是目前該領域的研究熱點[16～18]?；ㄉ?，MYB 轉錄因子如何影響花青素合成和積累的研究報道還較少。本研究以綠色的魯花11 和紫色種質056 雜交群體為材料，克隆花青素生物合成調控基因AhMYB113，分析保守結構域、系統進化樹、表達模式以及煙草遺傳轉化等，探討Ah-MYB113在花生花青素合成代謝過程中的調控作用，為今后花生品種改良提供相關的理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

從魯花11（葉色為綠色）和花生種質056（葉色為紫色）的雜交后代中，隨機選擇2 個綠色株系（分別命名為Green High，GH 和Green Short，GS）和2 個紫色株系（分別命名為Purple High，PH 和Purple Short，PS）作為試驗材料。

將花生種子播種在花盆中，置于光照培養箱中進行培養（溫度為25±0.5℃；光周期為光照16 h，黑暗8 h；濕度80%）?；ㄉ酌绯鐾梁? 周，取地上部的莖和葉作為RNA 提取材料，液氮速凍后-70℃保存備用。

野生型煙草（Nicotiana tabacumL.）品種NC89用于基因遺傳轉化。大腸桿菌DH5α、根癌農桿菌EHA105、植物表達載體pCAMBIA2300 均由本實驗室保存；反轉錄試劑盒和克隆載體pMD18-T購于寶生物（大連）有限公司（TaKaRa）；植物基因組DNA試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；DNA 聚合酶、限制性內切酶、T4 連接酶、DNA 分子量標準DL2000、卡那霉素、氨芐青霉素等實驗試劑購于上海生工生物工程股份有限公司；DNA 測序由山東省農業科學院測序中心完成。

1.2 AhMYB113生物信息學分析

利用ExPASy 網站（http://expasy. org/）對花生AhMYB113編碼蛋白的氨基酸序列進行等電點、分子量預測等。通過MUSCLE 程序對花生AhMYB113和其它同源蛋白進行多序列比對，選取MYB 結構域序列，再使用MEGA5.0（http://megasoftware. net）程序采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）生成系統進化樹，校驗參數Bootstrap 重復1000 次。保守性分析則采用DNAMAN 生物學軟件進行保守域序列比對。

1.3 AhMYB113表達載體構建

采用CTAB 法提取花生地上部總RNA，利用Ta-KaRa PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 合成cDNA 第一條鏈。根據綠色和紫色花生數字基因表達譜和花生轉錄組數據電子克隆花生AhMYB113，通過Primer5.0 軟件設計特異引物如下：Ah-MYB113F1：5’-GGTACCATGGAGGGATCCATAG-3’（帶KpnI 酶切位點），AhMYB113R1：5’-CTGCAGTTATTGTGGATCCCAC-3’（帶PstI酶切位點），PCR 產物連接pCAMBIA2300 表達載體，先提取質粒，然后轉化根癌農桿菌EHA105，用于侵染。

1.4 轉基因煙草的獲得

利用農桿菌介導的煙草轉化方法，農桿菌侵染轉化煙草無菌葉片后轉移至分化培養基上，待分化芽長至1 cm 時再轉移至生根培養基中，生根后移入基質中培養。提取煙草基因組DNA，利用引物，通過PCR 技術篩選出轉基因煙草株系。PCR 反應條件如下：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，59℃退火40 s，72℃延伸1 min，30 個循環；72℃延伸5 min，4℃保存。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

反應體系為：2×SYBR PCR mix 10μL，上、下游引物（10 mmol·L-1）各1 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 7μL，總體系為20μL。qRT-PCR 反應條件為：94℃1 min；94℃10 s，60℃10 s，72℃10 s，40 個循環。每次循環第3 步進行熒光采集。所有PCR 反應都設3次重復。采用2-ΔΔCT法對數據進行定量分析，用Excel 作圖。qRT-PCR 試驗所需的引物通過Beacon Designer 8 軟件設計，采用DNAMAN 和Primer BLAST軟件驗證引物特異性。

引物如下：AhMYB113F2（5’-GGAACAAGAACGGTGGCAAAGG-3’） 和AhMYB113R2 （5’ -CTTCTTCTTCTTCTTCCTCAGCACCT-3’）；內參基因AhActinF3：5’-GTCATCGTCATCCTCTTCTC-3’；AhActinR3：5’-CATTCCTGTTCCATTGTCAC-3’，所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2 結果與分析

2.1 花生AhMYB113基因克隆和序列分析

結合花生數字基因表達譜分析結果，篩選到可能與花生花青素積累密切相關的MYB轉錄因子，將其命名為AhMYB113。根據AhMYB113的中間片段分別設計引物進行3’RACE 和5’RACE 擴增，最終獲得AhMYB113的全長cDNA 序列?；ㄉ鶤h-MYB113的ORF 全長864 bp，編碼287 個氨基酸，預測分子量為32.6 kD，等電點為6.46。

2.2 花生AhMYB113結構域及進化樹分析

花生AhMYB113 在GenBank 蛋白數據庫中BLAST 結果顯示，AhMYB113 與多種植物MYB 轉錄因子有較高的同源性，尤其是大豆（Glycine max）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）等豆科植物。利用DNAMAN 軟件對包括AhMYB113 在內的17 個R2R3-MYB 的氨基酸序列進行多重序列比對（圖1），結果顯示在N端都含有高度保守的2個R 基序（R2 和R3）的MYB 結構域，分別包含52 個和51 個氨基酸殘基，表明AhMYB113 蛋白具有典型的R2R3-MYB結構域，屬于MYB轉錄因子家族成員。

圖1 花生AhMYB113與不同物種R2R3-MYB結構域序列比對Fig.1 Sequence alignment of R2R3-MYB domain in different species with AhMYB113 in peanut

系統進化樹分析發現，花生AhMYB113 與擬南芥（AtMYB75、90、113和114）、金魚草（AmVENOSA、AmROSEA1 和AmROSEA2）、矮 牽 牛（PhAN2、PhPHZ、PhAN4 和PhDPL）、蘋果（MdMYB1、A 和10）和葡萄（VvMYBA1和VvMYBA2）中調控花青素積累的相關MYB 聚成一大類（圖2），它們的親緣關系較近，表明花生AhMYB113 可能在花生花青素積累過程中發揮重要調控作用。

圖2 AhMYB113與其它物種調控花青素生物合成相關MYB的進化樹Fig.2 Phylogenetic tree between peanut AhMYB113 and other MYBs involved in the regulation of anthocyanin biosynthesis

2.3 不同花生品種AhMYB113的表達分析

利用qRT-PCR 技術分析AhMYB113在紫色和綠色花生中的表達，結果顯示，AhMYB113在紫色花生（PH 和PS）中的表達量明顯高于綠色花生（GH 和GS）（圖3）。由此一定程度上驗證了AhMYB113在花青素積累過程中發揮著調控作用。

圖3 AhMYB113在不同葉色花生品種中的表達量Fig.3 Expression of AhMYB113 in peanut species with different leaf color

2.4 異位表達AhMYB113 的轉基因煙草花青素含量的變化

為了進一步驗證AhMYB113的功能，構建了表達載體pCAMBIA2300-AhMYB113，采用農桿菌介導法將AhMYB113轉入煙草NC89，獲得轉基因煙草植株T-AhMYB113。隨后，觀察野生型煙草和轉基因煙草的表型差異，由圖4 可以看出，轉AhMYB113基因的煙草葉片呈現不同程度的紫色，甚至有些轉基因植株的根、莖和葉片均變成紫色，有些則是葉片局部呈現紫色（圖4A 右）。經對比花器官和不同花期顏色發現，野生型煙草的花是粉色（圖4B），轉AhMYB113基因的煙草花的顏色呈現深紅色甚至是深紫色，萼片顏色深于花瓣（圖4C、D 的右圖）；轉基因煙草的花藥、花絲和花柱的顏色也明顯不同于野生型煙草的淺黃、淺綠和綠色，而呈現深紫和淺紫色（圖4E）。以上結果表明，花生AhMYB113可以促進轉基因煙草的花青素積累，使轉基因煙草呈現不同程度的紫色。

圖4 野生型和轉AhMYB113煙草的表型Fig.4 Phenotype of WT and AhMYB113 transgenic tabacco

3 討論與結論

通過氨基酸序列分析表明花生AhMYB113在N端含有2 個高度保守的MYB 結構域，屬于一種典型的R2R3-MYB 轉錄因子。MYB 轉錄因子是植物中最大的轉錄因子之一，具有多種生物學功能，在植物生長發育、次生代謝產物合成、植物激素應答以及對干旱、低溫、高溫、鹽害、病蟲害等多種非生物逆境脅迫的響應中均發揮重要作用[17～23]。目前，花青素合成途徑是植物次生代謝產物合成中研究較多的一條途徑，很多調控花青素合成的R2R3-MYB轉錄因子已經從水稻、棉花、大豆、馬鈴薯、番茄、蘿卜、葡萄等植物中克隆，并進行了功能鑒定[19,24]。系統進化樹分析發現花生AhMYB113與擬南芥、金魚草、矮牽牛、蘋果和葡萄中調控花青素積累的MYB親緣關系較近，能夠聚成在一起，表明花生Ah-MYB113 轉錄因子可能參與次生代謝調控；序列比對分析結果顯示，花生AhMYB113與前人研究的Ah-MYB1和AhTc1的相似性非常高，而與AhMYB2和AhTT8的相似性較低，表明AhMYB113可能是Ah-MYB1和AhTc1的同源基因，因此，研究AhMYB113在花青素合成代謝中潛在的功能具有生物學意義。

R2R3-MYB 是調控植物花青素生物積累的一類重要轉錄因子。部分R2R3-MYB 轉錄因子能夠特異性識別并結合到CHS、ANS、DFR、UFGT等基因啟動子，激活下游結構基因的表達，促進花青素生物合成。這類R2R3 型MYB 轉錄激活因子過量表達，能夠提高轉基因植物中花青素含量，使轉基因植物呈現紫紅色或紫黑色[29]。將中國櫻桃MrMYB1分別在擬南芥和煙草中異位表達，轉基因擬南芥整株變成紫紅色；而轉基因煙草僅花瓣、花藥、子房、種子等生殖器官中有大量積累花青素，葉片仍為綠色；梅花PmMYBa1在煙草中過量表達得到相似的結果，僅花和果實中花青素大量積累[29～31]。本研究將花生AhMYB113在煙草中過量表達，轉基因煙草根、莖、葉、花、種子等器官均變成紫紅色，不存在組織差異。R2R3 型MYB 轉錄激活因子轉化煙草后，不同器官間花青素積累模式的差異，應該是內源bHLH以及相關結構基因表達水平或MYB轉錄因子作用模式不同引起的。

自然條件下R2R3-MYB 轉錄因子表達差異是引起農作物果實色澤變異的主要因素。由于gypsy轉座子插入引起草莓FvMYB10基因發生自然突變，截斷了FvMYB10蛋白全長的編碼，阻斷了花色素苷的合成，導致二倍體野生草莓果實色澤變異，果實變成白色[32]。蘋果MdMYB10 能夠調控果肉花青素合成，紅肉和白肉蘋果的果肉顏色差異，主要是由MdMYB10基因啟動子不同造成的，紅肉蘋果為R6型啟動子（R1:R6 或R6:R6），白肉蘋果為R1 型啟動子（R1:R1）。MdMYB10能夠更有效地反式激活R6型啟動子，從而保證紅肉蘋果中MdMYB10的高效表達以及花青素的大量積累[33]。蘿卜RsMYB1是控制花青素積累的關鍵基因，心里美紅肉野生型和白肉突變體RsMYB1核苷酸序列沒有差異，但在啟動子上游CACTA 轉座子的甲基化水平上，白肉突變體明顯高于野生型，去甲基化處理后白肉突變體能部分恢復花青素積累，表明RsMYB1啟動子區域CACTA 轉座子插入和甲基化程度較高是形成白肉突變體的主要原因[34]。

本研究結果表明，紫色花生幼苗中AhMYB113的表達水平要顯著高于綠色花生，且AhMYB113異位表達可以顯著提高轉基因煙草各種組織中花青素的積累。如果從AhMYB113的啟動子結構或者甲基化水平進行深入研究，或可進一步探究紫色和綠色花生中花青素含量差異的根本原因。

本研究克隆獲得花生MYB轉錄因子AhMYB113基因，通過生物信息學分析發現，AhMYB113屬于典型的R2R3 型MYB 轉錄因子，與擬南芥、金魚草、矮牽牛、蘋果、葡萄中調控花青素積累的R2R3-MYB親緣關系近。AhMYB113在花生紫葉雜交種的表達量明顯高于綠葉雜交種；在煙草NC89 中異位表達后，能夠促進花青素的積累，使得轉基因煙草葉片轉變為紫色，花瓣、花藥、花絲、花柱、柱頭和萼片等組織分別呈現為紫紅色或紫黑色。因此，我們認為花生的MYB 轉錄因子AhMYB113基因具有調控花青素積累的作用。