維生素C對鎘負荷小鼠睪丸抗氧化功能的影響*

周 健，秦 浩，李曉紅△，王永輝

（1.濰坊醫學院公共衛生學院，山東濰坊 261053；2.軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所，天津 300050）

重金屬鎘（cadmium，Cd）作為一種環境污染物，對人類和動物健康都構成威脅。在環境暴露人群中，吸煙者是暴露最嚴重的對象；不吸煙者通過飲食攝入受污染的食物和水而暴露于鎘［1］。近幾年，有研究報道，鎘對生殖系統有一定的影響，鎘暴露可導致睪丸組織損傷，嚴重可導致不育癥發生［2］。鎘致生殖系統損傷能影響人類繁衍，所以對其損傷的保護是研究的一個熱點。鎘生殖毒性是由多種機制介導的，其中之一是對睪丸細胞的氧化應激［1］。

維生素C（vitamin C，VC）是生活中常見的一種強抗氧化劑。波蘭Gren Agnieszka等學者［3］曾進行過VC對鎘染毒后小鼠肝、腎和腦的研究，結果顯示單次高劑量鎘比慢性低劑量鎘具有顯著的毒性效應，VC可減輕鎘的應激效應。本研究染毒鎘劑量和VC保護用量與其不同，且單次和重復染毒采用相同的劑量，而且目前鎘劑量與睪丸損傷強度之間的關系，以及鎘對睪丸損傷過程的機制尚不清楚。因此，本研究進行單次和重復染毒實驗，觀察睪丸的氧化損傷及VC保護作用，期望能夠為人群防治鎘暴露對生殖系統的不利影響提供理論依據，也為人們在日常生活中預防鎘危害提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

分析純氯化鎘（北京化工廠）；維生素C（華中藥業股份有限公司）；丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、微量還原型谷胱甘肽試劑盒、總谷胱甘肽（T-GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。multiskan FC型酶標儀（美國賽默飛世爾儀器有限公司）；分光光度計、紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；3-18K低溫離心機（德國SIGMA公司）。

1.2 實驗動物與分組

健康清潔級雄性昆明小鼠72只，6～7周齡，體重（34±2）g，購自青島動物實驗中心，生產許可證號為SCXK（魯）20140007。飼養環境安靜，通風良好，沒有已知污染物影響，自由攝食和飲水。72只小鼠隨機分為4組，對照組（Con）、氯化鎘（CdCl2）組、維生素C（VC）組、維生素C+氯化鎘（VC+CdCl2）組，分別灌胃+腹腔注射雙蒸水、灌胃雙蒸水+腹腔注射CdCl2、灌胃VC+腹腔注射雙蒸水、灌胃VC+腹腔注射CdCl2。在前期實驗的基礎上采用CdCl23 mg/kg腹腔注射染毒，VC 200 mg/kg灌胃進行保護，經過適應性喂養3 d后，每日染毒1次，染毒1 d和3 d及同時補充VC保護。每日同時間段進行體重稱量記錄和染毒操作。染毒期間小鼠自由進食，飲水。

1.3 樣本制備

第1日和第3日染毒24 h后取9只小鼠（8 h前已禁食），稱重并記錄，摘眼球取血并收集血液，待凝固后4℃離心取上清液，保存于-20℃冰箱備用。處死小鼠后，取出睪丸，用生理鹽水漂洗，濾紙吸干稱重并記錄，然后剪碎，放入玻璃勻漿器中，于4℃的低溫低速離心機離心10 min后取上清。

1.4 小鼠體重及臟器系數的測定

第1日和第3日染毒24 h后，各組小鼠稱重，處死后取雙側睪丸稱重，計算睪丸臟器系數。公式：睪丸臟器系數=（睪丸重量/體重）×100。

1.5 指標檢測

依據試劑盒說明書測定血清SOD、MDA水平，睪丸組織SOD、MDA、GSH、GSSG、GSH-Px、T-GSH水平。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 小鼠體重和臟器系數變化

結果顯示，Con與VC組近似，無顯著性差異；鎘負荷第1日與第3日小鼠體重與睪丸臟器系數都低于Con，VC處理后減輕的程度有所降低（表1）。

Tab.1 Effects of Cd on the body weight and testicular coefficient of mice in each group（±s，n=9）

Tab.1 Effects of Cd on the body weight and testicular coefficient of mice in each group（±s，n=9）

Group Body weight（g）1 d 3 d Testicular coefficient（%）1 d 3 d Con 34.12±2.12 35.98±2.02 0.58±0.21 0.56±0.17 VC 34.21±1.96 35.72±1.75 0.57±0.11 0.56±0.25 CdCl2 26.67±2.67 26.73±2.15 0.39±0.09 0.36±0.08 VC+CdCl2 28.27±1.92 28.76±1.68 0.41±0.26 0.38±0.10

2.2 小鼠血清SOD及MDA的變化

結果顯示，Con與VC組近似，無顯著性差異；鎘負荷第1日，染毒組SOD和MDA水平高于Con，VC處理后降低，接近Con；鎘負荷第3日，染毒組SOD水平較Con顯著降低（P＜0.05），VC處理后較染毒組顯著升高（P＜0.05），MDA含量較Con顯著升高（P＜0.05），VC處理后含量顯著降低（P＜0.05）；鎘負荷第3日，染毒組SOD水平顯著低于第1日（P＜0.05），MDA含量高于第1日，但無顯著性差異，VC處理后SOD水平低于第1日及MDA含量高于第1日，但無顯著性差異（表2）。

Tab.2 Changes in serum levels of SOD and MDA of mice in each group（±s，n=9）

Tab.2 Changes in serum levels of SOD and MDA of mice in each group（±s，n=9）

SOD：Superoxide dismutase；MDA：Malondialdehyde*P＜0.05 vs Con；#P＜0.05 vs CdCl2；ΔP＜0.05 vs CdCl2（1 d）

Group SOD（U/ml）1 d 3 d MDA（nmol/ml）1 d 3 d Con 116.60±10.06 108.30±8.04 2.24±0.18 2.24±0.19 VC 113.20±7.66 110.71±5.80 2.03±0.10 2.03±0.17 CdCl2 126.31±8.24 77.52±6.33*Δ2.43±0.08 3.43±0.36*VC+CdCl2 114.03±12.90 100.33±4.53# 2.33±0.05 3.00±0.21#

2.3 小鼠睪丸組織MDA及GSH/GSSG變化

結果顯示，Con與VC組近似，無顯著性差異；鎘負荷第1日，染毒組MDA水平顯著高于Con（P＜0.05），GSH/GSSG水平顯著高于Con（P＜0.05），VC處理后較染毒組顯著降低（P＜0.05）；鎘負荷第3日，染毒組MDA含量顯著高于Con（P＜0.05），VC處理后含量顯著降低（P＜0.05），GSH/GSSG水平顯著低于Con（P＜0.05），VC處理后顯著升高（P＜0.05）；鎘負荷第3日，染毒組MDA含量顯著高于第1日（P＜0.05），VC處理后含量較第1日顯著升高（P＜0.05），GSH/GSSG水平低于第1日；VC處理后，GSH/GSSG水平未有明顯變化（表3）。

Tab.3 Changes of MDA and GSH/GSSG in testis tissues of mice in each group（±s，n=9）

Tab.3 Changes of MDA and GSH/GSSG in testis tissues of mice in each group（±s，n=9）

MDA：Malondialdehyde；GSH：Reduced glutathione；GSSG：Oxidized glutathione*P＜0.05 vs Con；#P＜0.05 vs CdCl2；ΔP＜0.05 vs CdCl2（1d）；▲P＜0.05 vs VC+CdCl2（1 d）

Group MDA（nmol/mg）1 d 3 d GSH/GSSG 1 d 3 d Con 1.60±0.25 1.60±0.25 0.51±0.01 0.50±0.01 VC 1.65±0.21 1.77±0.18 0.50±0.03 0.50±0.02 CdCl2 2.51±0.17*5.06±0.33*Δ0.59±0.04*0.34±0.02*Δ VC+CdCl2 2.11±0.12 3.86±0.14#▲0.45±0.02#0.45±0.01#

2.4 小鼠睪丸組織SOD、GSH-Px及T-GSH的變化

結果顯示，Con與VC組近似，無顯著性差異；鎘負荷第1日，染毒組SOD、GSH-Px和T-GSH水平顯著高于Con（P＜0.05），VC處理后其水平顯著降低（P＜0.05）；鎘負荷第3日，染毒組SOD、GSH-Px和T-GSH水平顯著低于Con（P＜0.05），VC處理后其水平顯著升高（P＜0.05）；鎘負荷第3日SOD、GSH-Px和T-GSH水平顯著低于第1日（P＜0.05），VC處理后，第3日依舊低于第1日，但無顯著性差異（表4）。

Tab.4 Changes of SOD，GSH-Px and T-GSH in testis tissues of mice in each group（±s，n=9）

Tab.4 Changes of SOD，GSH-Px and T-GSH in testis tissues of mice in each group（±s，n=9）

SOD：Superoxide dismutase；GSH-Px：Glutathione peroxidase；T-GSH：Total glutathione*P＜0.05 vs Con；#P＜0.05 vs CdCl2；ΔP＜0.05 vs CdCl2（1 d）

Group SOD（U/mg）1 d 3 d GSH-Px（U/mg）1 d 3 d T-GSH（mg/g）1 d 3 d Con 91.88±6.50 91.88±6.56 27.51±1.30 28.03±1.50 25.82±2.35 26.05±1.90 VC 96.27±5.25 96.27±5.26 27.70±1.27 26.80±1.45 26.77±2.40 26.27±1.90 CdCl2 135.41±5.09*60.41±3.40*Δ 38.39±2.54* 13.39±0.86*Δ 36.18±2.38* 18.43±1.00*Δ VC+CdCl2 100.12±3.73#86.62±3.60# 30.12±1.97# 18.37±1.56# 28.62±0.72# 23.62±0.90#

3 討論

研究發現，鎘負荷致小鼠體重及睪丸臟器系數降低［4］，本研究也表明，不同鎘負荷下小鼠體重及睪丸臟器系數降低。睪丸臟器指數降低表明鎘對睪丸造成損傷［5］。VC處理后，降低的程度略有改善，說明VC對染鎘小鼠睪丸組織具有一定保護作用。

MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，其濃度與細胞損傷程度呈正相關 性，MDA濃度可間接反應膜脂過氧化程度［6］。隨著鎘負荷延長，鎘組小鼠血清、睪丸組織氧化產物MDA含量逐漸升高，呈劑量依賴性，表明鎘的蓄積致小鼠氧化應激程度加重，VC干預后，第1日和第3日MDA含量顯著低于染毒組，表明VC對第1日、第3日鎘致氧化損傷有一定保護作用。文獻報道，VC轉化為抗壞血酸根給脂自由基提供電子干預脂質過氧化反應［7］。VC可能通過上述機制發揮作用。

GSH/GSSG是細胞內最豐富的氧化還原對，也是主要的抗氧化系統之一［8］。GSH/GSSG是細胞健康的指標，它代表氧化劑和抗氧化劑之間的動態平衡，細胞內這個比值的變化是細胞信號轉導微調的基礎，包括細胞循環調節和其他細胞過程所需的氧化應激信號［9］。因此，本實驗分別對GSH/GSSG和T-GSH進行了研究。周雍［10］的研究表明，急性鎘染毒1 h后還原型GSH含量急劇升高，48 h含量接近對照組。本研究顯示，鎘負荷第1日睪丸組織GSH/GSSG比值升高，可能與GSH含量應激性升高有關。氧化應激時，GSH氧化成GSSG，隨著鎘負荷時間延長GSH含量下降；睪丸組織累積較多的GSSG，GSSG可在谷胱甘肽還原酶作用下可還原為GSH，NADP+/NADPH系統提供所需的還原當量。有文獻報道，苯并（a）芘染毒致小鼠睪丸組織細胞G-6-PD活性隨著染毒劑量逐漸降低［11］。鎘負荷可能也致小鼠睪丸組織細胞G-6-PD活性降低，GSSG在睪丸組織逐漸累積，導致GSH/GSSG比值降低。本研究鎘負荷第3日GSH/GSSG比值降低可能與上述機制有關。VC參與GSSG轉化為GSH的反應過程［12］。本研究不同鎘負荷經VC干預GSH/GSSG比值接近對照組，可能與此機制有關，說明VC在一定程度上維持該比值的平衡，對鎘負荷致小鼠睪丸組織細胞氧化損傷有一定保護作用。但是VC為水溶性易被代謝，鎘負荷再延長是否能發揮保護作用需進一步研究。

酶和非酶系抗氧化系統包括SOD、GSH-Px、GSH，它們可以清除氧自由基，保護細胞免受氧化損傷。鎘負荷第1日，血清SOD及睪丸組織SOD、GSH-Px、T-GSH水平升高。這一結果與其他學者［5，13］研究不一致，但也有學者［14］研究顯示SOD活力水平升高。原因可能是：（1）劑量不同，機體產生的應激反應不同。（2）觀察時間不同，本研究染毒結束后第1日觀察。因此，本研究鎘負荷第1日SOD、GSH-Px、T-GSH水平升高可能與應激性增加或者其他機制有關，需進一步研究。文獻報道，鎘能抑制SOD、GSH-Px活性，增加ROS和脂質過氧化損傷，干擾抗氧化酶的活性。鎘還能改變細胞內氧化還原狀態，通過與內源性及外源性抗氧化劑反應，如GSH［15］。本研究顯示鎘負荷第3日SOD、GSH-Px、T-GSH水平降低，可能與上述機制有關。細胞內氧化還原穩態的穩定是由于復雜的內源性抗氧化防御系統的保護作用，外源性抗氧化物質（如VC、VE等）強化內源性抗氧化防御系統的作用［16］。Culter提出，許多生物體有能力維持穩定的氧化應激，應用抗氧化補充劑證明有效性是假定初始氧化應激水平高于正?；蚋哂跈C體的調節點，這樣，抗氧化補充劑可能降低氧化應激增加的水平，但應激不能被內源性抗氧化物質阻止［16］。因為VC為水溶性的，可能在小鼠的日?；顒又斜淮x；鎘的半衰期長，易體內蓄積，所以本研究中VC處理后SOD、GSH-Px與TGSH水平得到改善，但鎘負荷第3日活力水平低于第1日，可能與上述機制有關。因此，VC在一定程度上可以減緩鎘致小鼠睪丸的氧化損傷，但該保護作用可能有一定的時間限制。

研究表明，自噬由嚴重氧化應激觸發，被認為是一種能清除細胞質中損傷的細胞器和蛋白降解成分的自然過程，但過度的自噬會破壞細胞的基本成分［17］。有研究表明，柚皮素通過下調p62和LC3-II的表達，進一步抑制MDA和H2O2的產生，保護睪丸免受鎘誘導的自噬［17］。陳明生等［18］研究表明，VC聯合替莫唑胺能夠增強對膠質瘤細胞的毒性，這一作用是通過ERK信號通路來促進細胞凋亡并抑制替莫唑胺所介導的自噬作用。本研究VC對鎘染毒的保護作用可能與睪丸自噬有關，需要進一步進行研究探討。