基于網絡藥理學探討菟絲子-枸杞子治療少弱精子癥的作用機制*

孟繁超 李海松 王 彬 馮雋龍1， 鄧 省 鮑丙豪 鄺 浩 王浩浩 王繼升**

1.北京中醫藥大學第一臨床醫學院（北京 100029）；2.北京中醫藥大學東直門醫院（北京 100700）

網絡藥理學的概念源于系統生物學和信息生物學?；谙到y生物學方法，網絡藥理學的概念最早由Li 等人[1]提出。由于網絡藥理學可以提供對網絡理論和系統生物學原理的完整或部分理解，它被認為是藥物發現的下一個范例[2]。此外，網絡藥理學方法已被用于研究“復合-蛋白質/基因-疾病”途徑，能夠從網絡的角度描述生物系統、藥物和疾病之間的復雜性，具有與中醫相似的整體哲學。網絡藥理學可以根據目標分子、生物功能和生物活性化合物形成復雜的相互作用網絡，滿足中藥配方的天然特性，從系統的角度，在分子水平闡明中藥配方的作用機理[3-5]。

本研究采用高效液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS/MS）檢測藥對菟絲子-枸杞子（SC-FL）的活性成分，并結合網絡藥理學預測SC-FL治療少弱精子癥的關鍵活性成分和靶點，為后續的實驗研究提供理論依據。

資料與方法

一、高效液相色譜串聯質譜分析

（一）藥物制備

中藥免煎顆粒菟絲子和枸杞子均購自康仁堂公司，為同一批號。取菟絲子和枸杞子各15g,用去離子水將其充分溶解為混懸液，以備高效液相色譜檢測。

（二）實驗試劑

甲醇(Methanol)，CAS：67-56-1，純度：LC-MS 級，品牌：Merck KGaA；乙腈(Acetonitrile)，CAS：75-05-8，純度：LC-MS級，品牌：Merck KGaA；甲酸(Fomic acid)，CAS：64-18-6，純度：LC-MS級，品牌：西亞試劑。

（三）實驗儀器

超高效液相色譜儀，型號: Thermo Vanquish UHPLC，品牌：Thermo Fisher Scientific；高分辨質譜，型號:Q-Exactive HF，品牌：Thermo Fisher Scientific；色譜柱，型號:Zorbax Eclipse C18，品牌：Agilent technologies。

（四）樣品提取

主要處理流程如下：

（1）將制備好的混懸液進行干燥、研磨等預處理;

（2）稱取10 g藥物置于50 mL 離心管中，加入10 mL乙腈提取溶劑，混勻后置于水平振蕩器中振蕩10 min，4500 r/min 離心5 min，待凈化;

（3）取上清液1 mL 于1.5 mL 離心管中，渦旋1 min，12000 r/min 高速離心 10 min 后，使用 0.22 μm 微孔濾膜進行過濾;

（4）將樣品置于機器進行測試。

（五）實驗條件

（1）儀器分析平臺：LC- MS (Thermo，Ultimate 3000LC，Q Exactive HF)

（2）色 譜 柱 ：C18 色 譜 柱 (Zorbax Eclipse C18(1.8μm*2.1*100mm))

（3）色譜分離條件為：柱溫為30℃；流速0.3mL/min；

流動相組成A：水+0.1%甲酸，B：純乙腈；進樣量為2μL，自動進樣器溫度4℃，見表1。

表1 液相色譜流動相條件

二、網絡藥理學材料方法

（一）網絡藥理學數據庫

（二）網絡藥理學方法

1.菟絲子-枸杞子靶點預測

從PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ )和Swiss Target Prediction（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，檢索代謝物全譜分析所得到的化合物的靶點，納入標準為Probability＞0。從人類基因數據庫（Gene-Cards，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ )中獲取少弱精子癥的靶點。將網絡藥理學復合靶點與少弱精子癥靶點相交，并將獲得的相交靶點視為SC-FL 治療少弱精子癥的潛在靶點，以便進一步網絡構建和分析[6]。

2.預測疾病靶點

選擇GeneCards數據庫進行檢索，尋找與疾病相關的基因，關鍵詞設置為“少弱精子癥(oligoasthenozoospermia)”，取相關數據庫的交集，刪除重復的基因，將活性成分相關的靶點和基因相對應，最終得到SC-FL活性成分的作用靶點信息數據集[7]。

3.蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）

使用String 數據庫（https://string-db.org/ )，分析已知和預測蛋白質。蛋白質的直接（結構）和間接（功能）相關相互作用是通過自動預測、生物體之間的知識轉移以及從其他數據庫聚合的相互作用來計算的。本研究使用String數據庫來確定可能的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）。為了提高獲得數據的可靠性，進一步過濾PPI，最小交互得分為0.40。篩選出的PPI 用于網絡構建和分析[8]。

4.網絡建設與分析

采用版本3.7.1 為Cytoscape 軟件，建立草藥-化合物-靶點-疾病網絡和蛋白互作網絡（Protein ProteinInteraction network，PPI network）。通過Network Analyzer plugin（Cytoscape 內置插件）分析計算網絡拓撲參數，獲取中藥復方靶病網絡信息，包括節點度（Degree，DG）、介數中心性（Betweenness Centrality，BC）、緊密中心性( Closeness Centrality，CC）。通過使用Cytoscape插件cytohubba 進一步分析PPI 網絡，并進一步設置節點顏色以反映度值以識別關鍵目標[9]。

5.Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析

（1）將SC-FL治療少弱精子癥的相關靶點導入生物信息學注釋數據庫David（版本6.8，https://david.ncifcrf.gov/）；

（2）將Select Identifier 設置為 Officical Gene Symbol，將 List Type 設置為Gene List，物種選擇人類，并選擇Gene Ontology（GO)下的分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）以及細胞組成（cellular component，CC）后，進行GO富集分析；

（3）選擇 Pathway 分析中 KEGG Pathway，設定顯著性為P ＜0.01，進一步尋找活性成分作用靶點顯著富集的主要功能注釋與體內通路；

（4）使用ImageGP（http://www.ehbio.com/ImageGP/），繪制條形圖[10]；

（5）保存SC-FL 治療少弱精子癥的GO 分析和KEGG通路分析結果。

結 果

一、SC-FL的化學成分分析

在進行保留時間矯正、峰識別、峰提取等工作時，使用Compound Discoverer 3.1。使用ThermomzValut本地數據庫和ThermomzCloud在線數據庫根據二次質譜信息對物質進行鑒定。SC-FL的全譜鑒定結果如圖1所示。

圖1 SC-FL全譜鑒定結果離子圖

二、靶點收集

從 SwissTargetPrediction 和 PubChem 獲 得 SC-FL靶點795個，從GeneCard獲得少弱精子癥相關靶點432個。最終獲得68個與SC-FL和少弱精子癥相關的重疊靶點。圖2 顯示與SC-FL 和少弱精子癥相關的重疊靶點，然后通過string數據庫分析PPI。

圖2 SC-FL和少弱精子癥均相關的重疊靶點

三、網絡的構建和拓撲分析

利用Cytoscape構建中藥復方靶病網絡，中藥復方靶病網絡圖如圖3所示。通過軟件中的“Network analysis”進行拓撲分析。把“度”參數最高的4種化合物認定為關鍵化合物，分別為 Luteolin，Kaempferol，Adenosine monophosphate 和 3-Methoxy-5，7，3′，4′-tetrahydroxyflavone。網絡分析后前4位化合物的信息如表2所示。

圖3 草藥-化合物-靶點-疾病網絡圖

表2 網絡分析后前四化合物信息表

PPI 網絡建設的結果，如圖4（a）所示，利用Cytoscape 軟件中的插件，cytohubba 進行分析，將“度”參數的前10的靶點認定為關鍵靶點，分別為AKT1（絲氨酸/蘇氨酸激酶1），ESR1（雌激素受體1），CASP3（半胱天冬酶3），EGFR（表皮生長因子受體），MAPK1（絲裂原激活的蛋白激酶1），TNF（腫瘤壞死因子），AR（雄激素受體），PTGS2（前列腺素-內過氧化物合酶2），NR3C1（核受體亞家族3C 組成員1），TLR4（Toll 樣受體 4）。排名前10關鍵靶點信息表3和圖4（b）所示。

表3 排名前10關鍵靶點信息表

圖4 PPI網絡圖及關鍵靶點圖

四、GO和KEGG富集分析

從對68 個靶點進行的富集分析的結果可以看出，SC-LF 涉及的細胞生物學過程有44 個，細胞成分有8個，分子功能有9 個，信號通路有51 個（P＜ 0.01）。依據P值的大小，選擇排名處于前5 位的通路，分別為Pathways in cancer(癌癥通路)、Proteoglycans in cancer(蛋白聚糖在癌癥中的通路)、PI3K-Akt signaling pathway(PI3K-Akt 通路)、HIF-1 signaling pathway(HIF-1 通路)、Prostate cancer(前列腺癌通路)。見圖5。

圖5 GO和KEGG富集分析

討 論

一、補腎生精法與SC-FL

腎精虧虛是少弱精子癥的核心病機，補腎生精為重要治則[11]。枸杞屬肝腎經絡，味甘、平，具有滋補肝腎、補精明目的功效。菟絲子性質溫和，味甘。具有補腎填精、養肝明目、健脾止瀉、固沖安胎之功?！侗静菁酚小把a而不重、溫而不燥”之說。從中藥配伍方面看，枸杞注重補腎陰，菟絲子部分補腎陽，陰陽兼用；同時，這兩種藥物性質溫和，屬于肝腎經絡。溫陽而不燥，滋陰而不寒，微調陰陽，平衡陰陽，達到陰陽互根，陰陽互用的效果，益氣養子。

二、SC-FL有效成分分析

木犀草素（Luteolin），山奈酚（Kaempferol），一磷酸腺苷（Adenosine monophosphate）和 3-O-Methylquercetin（3-O-甲基槲皮素）（3-Methoxy-5，7，3′，4′-tetrahydroxyflavone），是草藥-活性成分-靶點-疾病網絡圖分析排名前四的活性成分。

Luteolin屬于黃酮類物質，擁有類雌激素、抗氧化、抗炎等多種作用[12]。有研究指出其具有類FSH 作用，可促進睪酮和雌二醇的分泌。并且發現，它在FSH 的促分泌作用上效果顯著[13]。

Kaempferol與Luteolin同屬于黃酮類化合物，在抗氧化、抗炎和調節線粒體膜電位方面療效顯著[14-17]。同時，它能夠提高精子活力的主要原因之一就是因為其具備清除自由基的能力[18-19]。此外，Kaempferol還可以減少細胞脂質氧化產物和細胞凋亡，其機制與增加細胞抗氧化酶的含量有關[20]。Adenosine monophosphate 是新陳代謝的重要調節劑，Yang X[21]等研究發現，它的累積會導致睪丸代謝紊亂，進而影響生殖功能。

3-Methoxy-5，7，3′，4′-tetrahydroxy-flavone 具有抗氧化、抗炎、抗菌和心血管保護等作用，可以通過減少炎癥反應來提高精子活力與CYP19A1、AKT1、ESR2等靶點相連。Diao R等[22]采集了56名白細胞減少癥不育男性和44名正常生育男性的精液樣本。通過計算機輔助精液分析（CASA）（10μMol/L）測定槲皮素孵育前后的精子活力，說明槲皮素對白細胞介導的不育男性精子的抗氧化損傷起到了明顯的保護作用。

三、SC-FL有效成分作用靶點網絡分析

AKT1、ESR1、CASP3、EGFR、MAPK1、TNF、AR、PTGS2、NR3C1、TLR4，是最終獲得68個與SC-FL和少弱精子癥相關的重疊靶點中排名前10的重要靶點。

AKT1（AKT Serine/Threonine Kinase 1，AKT 絲氨酸/蘇氨酸激酶1），Akt 在細胞存活和凋亡中起重要作用，其活性是精子活力和線粒體活性氧的關鍵[23，24]。PI3K/AKT 信號通路參與多種生物學功能，包括DNA合成、細胞周期和細胞凋亡[24]。有研究指出，不育男性的精子PI3K/Akt通路的磷酸化水平與正常男性精子相比顯著下調[25]。

ESR1（Estrogen Receptor 1，雌激素受體1），雌激素受體是一種與雌激素應答DNA 元件相結合的激活轉錄因子，是核受體超家族的一員，作為媒介來轉導雌激素的多向性效應，有雌激素受體α(ESR1)與雌激素受體β(ESR2)兩種亞型[26,27]。ESR1 在維持男性生殖系統正常發育和功能以及內環境穩態中起著重要作用，其所表達的雌激素受體α可通過經典激活途徑、非經典激活途徑和生長因子受體激活途徑調節精子的發生和成熟，維持睪丸微環境的正常[28]。據報道，缺乏ESR1 的雄性小鼠的精子會出現精子異常，受精率下降[29]。有研究指出，ESR1 在睪丸支持細胞的細胞質、生殖細胞和睪丸間質細胞液中表達[30]。

CASP3（Caspase-3，半胱天冬酶3）是調節細胞凋亡的重要蛋白[31]。它的表達上調會對精子質量產生不利影響，從而導致生殖細胞死亡[32-34]。

EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor，表皮生長因子受體），表皮生長因子受體（epidermalgrowthfactor receptors，EGFRs）是一類被大量肽配體激活的受體酪氨酸激酶，可誘導形成具有活性的自身（反式）磷酸化受體同源/異二聚體。多細胞生物進化的關鍵一步是受體酪氨酸激酶(RTK)的出現。長期以來，EGFR 一直被認為是RTK 行為的原型，對細胞功能和人類健康至關重要[35]。EGFR 是調節哺乳動物細胞生長、存活、增殖和分化的最重要的受體之一。

精子頂體反應是受精的關鍵步驟，是一種鈣依賴性分泌事件，必須在受精前完成。EGFR 激活后，會發出Ca2+信號，使細胞內的Ca2+濃度瞬間增加[36]，促進精子獲能，發生頂體反應，提升生育能力[37]。

MAPK1（Mitogen-Activated Protein Kinase 1，絲裂原激活的蛋白激酶1），絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）是哺乳動物中存在的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[38]。它可以通過細胞外信號激活，例如物理和化學脅迫，細胞因子，生長因子等。在下一步中，它可以通過三個級聯反應激活下游轉錄因子，將各種類型的外部刺激轉移到細胞核，并與細胞增殖，分化，轉化，炎癥和細胞凋亡密切相關。有研究證實，MAPK 通路的激活對小型豬精子頂體反應至關重要，將MAPK 途徑抑制后，頂體反應減少，引發不育[39]。

睪酮等雄激素是正常男性生殖發育所必需的類固醇激素，并且雄激素通過AR（Androgen Receptor，雄激素受體）發揮作用，AR在睪丸中的信號傳導對于精子的產生至關重要[40]。PTGS2（Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2，前列腺素-內過氧化物合酶2），前列腺素內轉油氧化物合成酶（也稱為COX）是速率限制酶，其在植物酸的損傷細胞膜產物中轉化為前列腺蛋白，并且它們存在至少2個同種型，PTGS1（COX-1）和PTGS2中存在（COX-2）。PTGS2表達是細胞因子和生長因子誘導的，并且在炎癥期間上調。此外，PTGS2 蛋白在一些睪丸管周細胞中表達。據我們所知，目前僅在不育男性的管周細胞中描述了PTGS2 表達[41,42]。

四、PI3K-Akt 信號通路可能是SC-FL 治療少弱精子癥的關鍵通路

在精原細胞的更新、修復、增殖等功能與PI3K/Akt通路相關mRNA 及蛋白中有著密不可分的關系[43-45]。通過PI3K/Akt 通路可增加和維持生殖細胞數量，因此，這條通路對于細胞增殖而言至關重要[46]。此前，課題組的相關研究表明，調控精子數量和活力的重要通路之一，即為 PI3K/Akt通路[47]。

PI3K/AKT通路上相關mRNA及蛋白在促進DNA合成、調控細胞周期以及抑制細胞凋亡等多種生物學功能中發揮重要作用[48]，比如對調控精原細胞的增殖、凋亡方面[49]。PI3K/AKT 通路上游有 PI3K 、GFRα-1、RET 等分子，下游涉及到 AKT、Bcl-2、Bax、Bad 等分子。Bcl-2有線粒體通透性過渡孔之稱，與線粒體凋亡通路密切相關[50-51]。Bcl-2家族的蛋白有兩種的截然不同的功能，其中以Bax、Bad為代表的蛋白，可以促進細胞凋亡，而另外一種以Bcl-2 為代表的蛋白，可以抑制細胞凋亡[52]。

結 語

SC-FL治療少弱精子癥具有多靶標、多途徑、多細胞、綜合作用的特點。其發揮作用的機制與增殖凋亡、炎癥反應和能量代謝等息息相關，預測發現可能與PI3K/AKT信號通路密不可分。