靈芝水溶性和堿溶性多糖的抗氧化性能比較研究

韓 偉，陳煉茹，鄭丹婷，卜原玲，姚澤遠

(華東理工大學 藥學院 a.制藥工程與過程化學教育部工程研究中心;b.上海市新藥設計重點實驗室，上海 200237)

靈芝是一種具有很高營養和藥用價值的食用真菌.大量研究表明，靈芝多糖(Ganodermalucidumpolysaccharide，GLP)作為靈芝的主要有效成分，顯示了較強的抗氧化活性[1]，可用于預防和治療糖尿病、心臟病、癌癥、視網膜損傷、白內障、帕金森氏病、阿爾茲海默氏病、免疫功能受損等疾病[2-4].其具有抗自由基的作用，可延緩衰老并應用于化妝品中[5].相關研究還發現，提取方法、多糖濃度、相對分子質量等因素均可能影響靈芝多糖的抗氧化活性[6-8].

入藥的靈芝品種大多是赤芝，本文選取代表性的赤芝品種滬農靈芝、龍芝2號為研究材料，采用水提、堿提及乙醇分級沉淀的方法得到了不同相對分子質量的多糖組分.同時，利用普魯士藍法、羥自由基清除模型、DPPH自由基清除模型對各多糖進行抗氧化活性評價，為靈芝多糖的深入研究提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料與設備

滬農靈芝子實體、龍芝2號子實體，上海市農業科學院食用菌所提供.

體積分數95%乙醇、無水乙醇，上海沃化化工有限公司；氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、國藥集團化學試劑有限公司；磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、三氯乙酸、水楊酸、30%過氧化氫，上海凌峰化學試劑有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼)、葡聚糖凝膠G-100，上海源葉生物科技有限公司；DEAE-纖維素52，上海笛柏生物科技有限公司.以上試劑均為分析純.

SB-2000水浴鍋、N-1001旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；ER-692型微波爐，中國電子器件工業總公司；H1650-W離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；SCIENTZ-12N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV1900PC紫外可見分光光度計，上海亞研電子科技有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2414示差折光檢測器，美國Waters公司；Wyatt HELEOS8激光光散射儀，美國Wyatt公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝水溶性多糖的制備

取靈芝子實體，加入體積分數95%乙醇脫脂3 h，抽濾，樣品干燥至質量不變后加入去離子水進行多糖的微波輔助提取，控制微波功率325 W，料液比1∶35(g/mL)，提取時間24 min.提取完成后抽濾，分別收集濾液和濾渣，濾液減壓濃縮，隨后加入4倍體積的95%乙醇，于4 ℃的冰箱中靜置過夜.離心，沉淀用少量水溶解，真空冷凍干燥，得到靈芝水溶性多糖.

取靈芝水溶性多糖，復溶后加體積分數95%的乙醇至體積分數為30%，置于4 ℃的冰箱中沉淀過夜，離心5 min(10 000 r/min)，沉淀冷凍干燥，得GLPa.離心后的上清液旋蒸除去乙醇，加體積分數95%的乙醇至體積分數為50%，置于4 ℃的冰箱中沉淀過夜，離心5 min(10 000 r/min)，沉淀冷凍干燥，得GLPb.同法，乙醇體積分數為80%時得到GLPc.

1.2.2 靈芝堿溶性多糖的制備

取微波提取后的濾渣，干燥至質量不變后，料液比1∶35(g/mL)加入質量分數為5.4%的NaOH溶液，40 ℃熱水浴浸提75 min.抽濾，濾液減壓濃縮，調節pH至7左右，隨后加入4倍體積95%乙醇，于4 ℃的冰箱中靜置過夜.離心，沉淀用少量水溶解，真空冷凍干燥，得到靈芝堿溶性粗多糖，分別上DEAE-纖維素柱、Sephadex G-100層析柱，進一步分離后得到靈芝堿溶性多糖GLPj.

1.2.3 靈芝多糖的相對分子質量測定

采用高效凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光散色儀-示差折光檢測儀聯用分析法[9-10](HPSEC-MALLS-RI System)進行靈芝多糖的相對分子質量測定.

靈芝多糖供試液的制備：稱取5.0 mg靈芝多糖，用流動相配制成質量濃度5 mg/mL的靈芝多糖供試液，經0.45 μm濾膜過濾，待用.

色譜條件：Waters 2695高效液相色譜儀及Waters 2414示差折光檢測器；OHpak系列SB-806 HQ和SB-804 HQ色譜柱(8.0 mm×300 mm，TOSOH)；進樣量100 μL；流動相，去離子水；流速0.500 mL/min；柱溫35 ℃；激光散射儀波長663.1 nm；折光指數增量(dn/dc)0.146 mL/g.

數據采集分析：使用Astra(version 6.1.1，Wyatt Technology)數據分析軟件對光散射數據進行采集和分析.樣品的色譜峰數目和形狀可以反映其純度，在HPSEC圖譜中的保留時間與多糖樣品的相對分子質量具有函數關系[11].

1.2.4 靈芝多糖的抗氧化活性實驗

多糖樣品溶液配制：稱取0.050 g多糖樣品，溶于25 mL去離子水，得2 mg/mL多糖溶液.將2 mg/mL多糖溶液按3∶1加去離子水稀釋，得到1.5 mg/mL多糖溶液.同理，制得1、0.5、0.25 mg/mL多糖樣品溶液.

1)多糖總還原力

磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)配制：稱取3.12 g磷酸二氫鈉，加去離子水定容到100 mL，為A液.稱取7.16 g磷酸氫二鈉，加去離子水定容到100 mL，為B液.量取A液62.5 mL，B液37.5 mL，混合.

取5個質量濃度的多糖樣品液各1.0 mL分別置于試管中，每管加入2.5 mL磷酸緩沖液和1.5 mL質量分數1%鐵氰化鉀，混勻.將各試管轉移至水浴鍋中，50 ℃反應20 min.冷卻至室溫后，往各管中滴加2 mL質量分數10%三氯乙酸溶液.混合液轉入離心管，于3 000 r/min離心10 min.分別取2.5 mL上清液置于新試管中，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL質量分數0.1%三氯化鐵溶液，搖勻，室溫下靜置10 min，在700 nm處測量吸光度.設3個平行試驗，取均值.

2)羥基自由基清除能力

取5個質量濃度的多糖樣品液各1.0 mL分別置于試管中，每管中加入4 mmol/L硫酸亞鐵溶液、4 mmol/L H2O2溶液、4 mmol/L水楊酸無水乙醇溶液各1.0 mL，混勻，37 ℃避光反應30 min.反應完成后，轉入離心管，于8 000 r/min離心5 min.分別吸取上清液，測量并記錄510 nm處的吸光度值(Ai).按以上步驟，將水楊酸無水乙醇溶液換成同等體積的無水乙醇進行相同的實驗，將測得的吸光值記為Aj.用去離子水替換多糖溶液，測得的吸光值記為A0.設3個平行試驗，取均值.

羥自由基清除率=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100%.

(1)

3)DPPH自由基清除活性

取5個質量濃度的多糖樣品液各2.0 mL分別置于試管中，每管中加入2.0 mL的 0.2 mmol/L DPPH無水乙醇溶液，混勻.將各試管轉移至黑暗環境，反應30 min.隨后測量517 nm處的吸光值(Ai).按以上步驟，將 DPPH無水乙醇溶液換成同等體積的無水乙醇進行相同的實驗，記錄吸光值(Aj).用去離子水替換多糖溶液，記錄相應的吸光值(A0).設3個平行試驗，取均值.

DPPH自由基清除率=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100%.

(2)

2 結果與分析

2.1 靈芝多糖的純度

實驗所得靈芝的水溶性多糖為淺黃色粉末，堿溶性多糖為黃棕色粉末，均可溶于水，不溶于乙醇，能產生苯酚-硫酸顯色反應.

2.1.1 多糖的高效液相色譜圖

各多糖組分經高效液相色譜檢測，示差檢測器(RI)信號峰為單一強峰，臨近結束時出現一個弱峰，證明多糖純度較高.圖1顯示，經不同方法提取、不同體積分數乙醇沉淀得到的靈芝多糖的出峰位置和峰面積均存在差異，表明水溶性多糖GLPa和GLPb、GLPc和堿溶性多糖GLPj含有不同種類的組分，且含量各不相同，從GLPa到GLPb、GLPc、GLPj含量逐漸減小.

圖1 滬農靈芝和龍芝2號多糖的高效液相色譜圖

2.1.2 多糖的紫外吸收譜圖

各靈芝多糖樣品的紫外吸收如圖2所示.由圖2可以看出，各靈芝多糖樣品均顯示單一對稱吸收峰，證明其中不含核酸和蛋白質，或含量極低不足以形成特征峰.

圖2 靈芝多糖的紫外吸收譜圖

2.2 靈芝多糖的相對分子質量

利用HPSEC-MALLS-RI技術對靈芝多糖的相對分子質量進行分析.以普魯蘭多糖(P-50，相對分子質量4.88×104)為標準品，對各個角度的激光進行歸一化處理，計算多糖相對分子質量[11].各多糖組分的平均分子相對質量見表1.

表1 各組分多糖的相對分子質量

由表1可知，低體積分數乙醇沉淀法可得到大分子多糖，滬農靈芝、龍芝2號的30%醇沉多糖的平均相對分子質量均為百萬級.隨著乙醇體積分數增加，沉淀得到的多糖相對分子質量減小，滬農靈芝、龍芝2號的50%、80%醇沉多糖的平均相對分子質量均為1×105級.以稀NaOH為溶劑從靈芝水提殘渣中提取得到的堿溶性多糖相對分子質量最低，小于1×104級.

2.3 靈芝多糖的抗氧化活性

2.3.1 多糖總還原力

通常情況下，物質的抗氧化活性與還原能力呈正相關關系[12].具有良好的還原能力的物質往往能提供電子，與活性氧基團反應，從而起到清除自由基的效果.其還原產物能與三價鐵離子作用，生成普魯士藍絡合物，在700 nm處有最大吸收峰.利用此性質，可根據反應液在700 nm處的吸收值推斷原樣品還原能力的強弱.滬農靈芝、龍芝2號各多糖組分的還原力見圖3.

圖3表明，各多糖樣品的還原能力隨著多糖質量濃度的增加而增加，但龍芝2號GLPj在大多數實驗點下無顯著差異，且其還原能力明顯較弱.在所有測試濃度，2種靈芝的30%醇沉水溶性多糖GLPa均具有較強的還原力.

圖3 靈芝多糖的還原力

提取方式、相對分子質量等差異都可能對靈芝多糖的還原力強弱帶來影響.本實驗中，對滬農靈芝來說，多糖的還原力大小順序為：GLPa>GLPc>GLPb>GLPj，對龍芝2號來說，多糖的還原力大小順序為：GLPa≈GLPc>GLPb>GLPj.可見，水溶性多糖比堿溶性多糖具有更好的還原力，且低體積分數乙醇沉淀得到的大分子多糖比小分子多糖有更好的還原力.

2.3.2 羥基自由基清除能力

羥基自由基是一種高活性的自由基，具有極大的生物毒性.清除羥基自由基對人體健康有著非常重要的作用[13].滬農靈芝、龍芝2號各多糖組分對羥自由基的清除能力如圖4所示.由圖4可知，各靈芝多糖對羥基自由基均有一定的清除作用，且隨著質量濃度的增大，清除率越來越大.30%、80%醇沉水溶性多糖的清除作用較好，隨著多糖質量濃度的增加，30%和80%醇沉水溶性多糖的羥自由基清除率最高到達40%～50%.2種靈芝的50%醇沉水溶性多糖清除作用相當，最大值在30%上下.堿溶性多糖清除羥基自由基的能力相對較弱，最大實驗濃度下的清除率小于20%.

圖4 靈芝多糖清除羥自由基的能力

2.3.3 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基是一種穩定的質子自由基.良好的抗氧化劑能提供電子，與DPPH自由基配對，形成穩定分子，使得溶液在517 nm處的吸光度降低[14-16].吸光值變化的程度與自由基清除程度呈正相關.

滬農靈芝、龍芝2號各多糖組分的DPPH自由基清除能力見圖5.由圖5可看出，2種靈芝的多糖GLPa、GLPb、GLPc、GLPj均對DPPH自由基具有一定的清除能力，且隨著多糖濃度的增加，清除能力亦增加.在實驗范圍內，靈芝水溶性多糖組分均具有較強的還原力，DPPH自由基清除率最高可達70%～80%左右，能夠將溶液還原成黃色，表明清除能力顯著.而堿溶性多糖的DPPH自由基最大清除率約為30%，其還原能力明顯較弱.

圖5 靈芝多糖的DPPH自由基清除能力

3 結語

本研究以滬農靈芝和龍芝2號的子實體為原材料，制得了不同質量濃度的水溶性多糖和堿溶性多糖，并檢測了各多糖的體外抗氧化的能力.結果表明，各多糖均具有一定的還原力、羥基自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，且隨著樣品質量濃度的增加，各活性也有所增強，呈濃度依賴性，這說明2個赤芝品種的子實體具有一定的抗氧化活性.結合靈芝多糖的提取方法、相對分子質量分析，微波輔助法得到的水溶性多糖具有較大相對分子質量，GLPa的相對分子質量達百萬級，GLPb和GLPc的相對分子質量均在十萬級，而堿提法得到的堿溶性多糖GLPj相對分子質量小于1萬，實驗中各水溶性多糖普遍比堿溶性多糖表現出更好的抗氧化活性，可能與提取方法及順序有關.其中，GLPa抗氧化活性較其他多糖為最強，推測抗氧化活性可能與相對分子質量呈正相關.

靈芝多糖一直是靈芝研究的重點.除了提取方式、相對分子質量之外，靈芝多糖的組成結構、空間構象等都可能是影響多糖抗氧化活性的因素，因此，有必要進一步研究其化學結構的差異及構效關系，為靈芝中活性物質的精確利用提供研究基礎.