響應面法優化超聲輔助提取山藥素Ⅰ工藝

王曉輝,胡明航,董黎明,李 靖,陳 艷,李 昭,黃 菊

(徐州工程學院 材料與化學工程學院，江蘇 徐州 221018)

山藥為薯蕷的根莖，為我國傳統的藥食同源食物[1-2]，含有多糖、氨基酸、脂肪酸和山藥素類化合物等，具有降血糖、降血脂和抗氧化等藥理活性，廣泛用于治療糖尿病、腎炎和癌癥等臨床疾病[3-4].1972年，Hashimoto等[5]由山藥零余子中分離得到山藥素.山藥素有5種構型，山藥中含量最高的山藥素Ⅰ是控制山藥休眠的重要因素之一，具有抗菌、抗氧化及抑制α-D-葡萄糖苷酶等生物活性的作用[3,5-7].由于山藥中山藥素類物質的含量較低，國外研究者主要致力于研究山藥素類物質的人工合成，但合成成本較高，產品價格昂貴，其藥理及生物活性研究進展緩慢[5,8].為推動山藥及其活性成分的研究，近年來，我國學者如曹國棟[9]和朱金花等[10]建立了同時測定山藥素類化合物的HPLC法，但對精密儀器的操作要求較高；劉繡華等[11]開發了一種從植物山藥中提取山藥素的方法，但對山藥素Ⅰ的提取研究較缺乏.

為此，本文選取與山藥素Ⅰ的結構類似，在308 nm左右處有最大吸收，且具有價格低廉優勢的9-溴菲代替山藥素Ⅰ作為標準品，因而山藥素含量可以9-溴菲計，由此建立了鐵棍山藥提取液中山藥素Ⅰ的紫外分光光度分析方法.在此基礎上，通過單因素試驗和響應面試驗并結合超聲技術，探討主要因素對鐵棍山藥中山藥素Ⅰ提取量的影響，優化提取工藝，為山藥素Ⅰ的深入研究與開發提供依據.

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

鐵棍山藥，江蘇市售；9-溴菲，TCI(上海)化成工業發展有限公司；無水乙醇，分析純；蒸餾水，自制.

1.2 儀器與設備

粉碎機，浙江萬基塑業有限公司；小型研磨機，永康市招風耳工貿有限公司；篩子，100目；電熱鼓風干燥箱DHG-9070A，蘇州江東精密儀器有限公司；超聲波電加熱清洗機UC-2H，上海泰坦科技股份有限公司；紫外-可見分光光度計UV-5500PC，上海元析儀器有限公司；低速離心機TDL-4，上海安亭科學儀器廠；電子天平CN-LQC20002，昆山優科維特電子科技有限公司；容量瓶，江蘇金鑰匙科教儀器設備有限公司.

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

鐵棍山藥→洗凈去皮→切片→50 ℃干燥粉碎→過篩→乙醇浸泡→超聲提取→抽濾→離心→濾液定容.

1.3.2 標準曲線繪制

9-溴菲與山藥素Ⅰ的結構類似，在308 nm左右處有最大吸收，但具有價格低廉的優勢，本研究選擇9-溴菲代替山藥素Ⅰ作為標準品，建立鐵棍山藥提取液中山藥素Ⅰ的紫外分光光度分析方法，山藥素含量以9-溴菲計.準確稱量5 mg 9-溴菲，用無水乙醇溶于25 mL容量瓶中配成0.2 mg/mL的標準儲備液.各移取0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL儲備液于25 mL容量瓶中，以無水乙醇定容至刻度，搖勻、靜置15 min.配成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的9-溴菲標準液.以無水乙醇為空白對照，以吸光度(A)對質量濃度(c)繪制標準曲線，經最小二乘法得標準曲線方程：A=6.189c+0.011 9，R2=0.998 0，說明在0～0.10 mg/mL吸光度和9-溴菲濃度呈良好的線性關系.

1.3.3 鐵棍山藥山藥素Ⅰ含量測定

移取2 mL鐵棍山藥山藥素Ⅰ的提取液于25 mL容量瓶中，定容、搖勻、靜置 15 min，測定308 nm波長處吸光度.

式中：A為鐵棍山藥山藥素Ⅰ提取液吸光度；V0為提取液定容體積，mL；V1為提取液定容后吸取的體積，mL；V2為稀釋液定容體積，mL；m為鐵棍山藥粉樣品質量，g.

1.3.4 單因素試驗設計

稱取過100目篩的干燥鐵棍山藥粉1.0 g，超聲功率240 W，溫度 50 ℃，分別在如下條件下進行提取試驗.

1)液料比.在超聲時間30 min和乙醇體積分數70%時，按液料比(mL/g)10∶1～50∶1.

2)乙醇體積分數.在超聲時間30 min和液料比40∶1時，按乙醇體積分數20%～80%.

3)超聲時間.在液料比40∶1和乙醇體積分數30%時，按超聲時間20～90 min.

分別按照章節1.3.3的方法測定鐵棍山藥山藥素Ⅰ含量，考察各單因素對山藥素Ⅰ提取量的影響.

1.3.5 Box-Behnken試驗設計

以山藥素Ⅰ提取量為響應，以上3因素為考察變量，采用Design-expert 8.0.6軟件，利用 Box-Behnken方法設計響應面試驗，各因素與水平見表1.

表1 響應面試驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對提取量的影響

如圖1所示，在液料比增加時，山藥素Ⅰ的提取量先增后減，在40∶1處達到最大值.因為隨著溶劑量的增多，其稀釋作用降低了山藥素Ⅰ的溶出阻力，但液料比過高時，山藥素Ⅰ的提取量反而略有下降.為了節約溶劑及降低提取成本，液料比選擇40∶1.

2.1.2 乙醇體積分數對提取量的影響

如圖2所示，在乙醇體積分數增加時，山藥素Ⅰ的提取量也出現最大值.因為山藥素Ⅰ為水溶性分子，30%體積分數的乙醇溶液和山藥素Ⅰ的極性相當.當乙醇體積分數過高時，溶液極性過低，山藥素Ⅰ的溶出困難，不利于提取量的提高.過高的乙醇體積分數也加重了提取的成本，乙醇體積分數以30%為宜.

圖2 乙醇體積分數對山藥素Ⅰ提取量的影響

2.1.3 超聲時間對提取量的影響

如圖3所示，山藥素Ⅰ提取量的最大值出現在超聲時間為60 min處.這可能是因為超聲劇烈的振熱效應造成部分山藥素Ⅰ破壞分解，故適宜的超聲時間為60 min.

圖3 超聲時間對山藥素Ⅰ提取量的影響

2.2 響應面試驗結果

根據Box-Behnken原理，對液料比、乙醇體積分數和超聲時間進行3因素3水平的響應面試驗，結果見表2.

表2 響應面試驗結果

Design-expert 8.0.6多元回歸擬合響應值-山藥素Ⅰ提取量(Y)對編碼自變量液料比(Xa)、乙醇質量濃度(Xb)和超聲時間(Xc)的二次多項回歸方程：

Y=0.66-0.000 75Xa-0.028Xb-0.015Xc+0.007 75XaXb-0.020XaXc-

0.015XbXc-0.080Xa2-0.037Xb2-0.019Xc2，

表3 回歸方差分析

F值反映了單因素對山藥素Ⅰ提取量的影響順序：乙醇體積分數>超聲時間>液料比.由于P(XaXc)和P(XbXc)都小于0.005，表明液料比和超聲時間、乙醇體積分數和超聲時間對山藥素Ⅰ提取量具有顯著的交互作用，液料比和乙醇體積分數間的交互作用不顯著.

2.3 雙因素間的交互影響作用分析

液料比和超聲時間、乙醇體積分數和超聲時間對鐵棍山藥山藥素Ⅰ提取量具有顯著的交互作用.

圖4等高線反映了所考察雙因素之間的交互作用情況.當其趨近于圓時，說明雙因素之間的相互作用不顯著，故圖4(a)的液料比和乙醇體積分數的兩因素相互作用較弱；當其接近橢圓時，相互作用顯著，如圖4(b)和(c).當曲線較為密布時，相互作用越明顯，如圖4(b)和(c).

從圖4(b)可以看出，當液料比較低時，山藥素Ⅰ提取量隨著超聲時間的增加而遞增，當液料比較高時，提取量隨著超聲時間先增后減；當超聲時間較短時，提取量隨著液料比的增加略有增加，當超聲時間較長時，提取量隨著液料比的增加而增加.從圖4(c)可知，在乙醇體積分數較低時，超聲時間的增加導致提取量遞減，在乙醇體積分數較高時，隨著超聲時間的增加提取量出現最大值；增加乙醇體積分數有利于增加提取量.

圖4 交互影響顯著的雙因素等高線

綜合來看，適當地增加超聲時間和選擇合適的液料比，或者適當地增加乙醇體積分數和選擇合適的超聲時間，均有利于提高山藥素Ⅰ的提取量.在選擇最佳工藝參數時，根據液料比45.7∶1(mL/g)、乙醇體積分數29.2%和超聲時間63.3 min，此時山藥素Ⅰ的理論提取量為0.643 4 mg/g.實際工藝參數調整為液料比46∶1、乙醇體積分數29%和超聲時間63 min，3次驗證試驗得到山藥素Ⅰ的平均提取量為 0.627 1 mg/g(RSD=1.61)，略低于理論提取量2.53%.

3 結論

1)選取具有價格低廉優勢的9-溴菲代替山藥素Ⅰ作為標準品，建立了鐵棍山藥提取液中山藥素Ⅰ的紫外分光光度分析方法，為探討鐵棍山藥中山藥素Ⅰ提取量的影響因素，優化提取工藝提供了依據.

2)在此基礎上，選取液料比、乙醇體積分數和超聲時間等3個對鐵棍山藥山藥素Ⅰ提取量影響較大的因素進行響應面試驗，建立了二次回歸方程.方差分析和響應面分析表明，3因素及其2次項對提取量的影響順序：乙醇體積分數>超聲時間>液料比，其中，液料比和超聲時間、乙醇體積分數和超聲時間的二次交互作用顯著.該模型的統計學意義顯著，用于山藥素Ⅰ提取工藝的優化較為合理，也為山藥素Ⅰ的純化、生物活性研究以及其余山藥素類成分的開發提供了研究依據和研究基礎.