上海地區學齡前兒童對羥基苯甲酸酯類物質暴露與肺功能的相關性研究

戶 宜，丁國棟

1.上海交通大學醫學院附屬兒童醫院生物醫學信息研究中心，上海 200040；2.上海交通大學醫學院附屬兒童醫院呼吸科，上海 200040

對羥基苯甲酸酯類物質，因其廣譜抗菌、安全性能好、低毒性和低成本的優勢，作為防腐劑被廣泛地應用到食品、藥品和個人護理品當中［1-2］。常用的對羥基苯甲酸酯類物質包含羥基苯甲酸甲酯（methyl 4-hydroxybenzoate，MeP）、對羥基苯甲酸乙酯（ethyl 4-hydroxybenzoate， EtP）、 對 羥 基 苯 甲 酸 丙 酯（propyl 4-hydroxybenzoate，PrP）、對羥基苯甲酸丁酯（butyl 4-hydroxybenzoate，BuP）和對羥基苯甲酸芐酯（benzyl 4-hydroxybenzoate，BzP）等［3］。

在日常生活中，對羥基苯甲酸酯類物質可通過消化道、呼吸道和皮膚接觸等多種途徑進入人體［4］。對羥基苯甲酸酯類物質在人體代謝后主要經由尿液排出，檢測其在尿液樣本中的濃度常用于評估人體對羥基苯甲酸酯類物質的內暴露水平［5］。近年來，國內外多篇文獻報道［6-8］指出，包括兒童在內的普通人群尿液樣本中對羥基苯甲酸酯類物質檢出率高，引發對其潛在健康風險的擔憂。兒童對環境污染物易感性高、呼吸系統發育尚不成熟、免疫功能較低，對羥基苯甲酸酯類物質對其健康的影響受到廣泛關注［9］。國外流行病學研究［10-12］發現兒童對羥基苯甲酸酯類物質暴露可能會損害呼吸系統，增加兒童哮喘發作風險等，但國內尚無相關報道。肺功能是呼吸系統生理功能的真實反映［13］，其定量檢測結果是兒童呼吸系統疾病臨床診斷的重要依據之一，并在呼吸生理科學研究中占據重要地位［14］?；诖?，本研究擬通過檢測上海市學齡前兒童對羥基苯甲酸酯類物質暴露水平，測定其肺功能指標，分析對羥基苯甲酸酯類物質暴露與兒童肺功能的相關性，以期為探討對羥基苯甲酸酯類物質毒性效應及對兒童健康風險評估提供參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年8月—2020年1月在上海交通大學醫學院附屬兒童醫院兒童保健科門診招募的學齡前健康兒童為研究對象。納入標準：5～7 歲身體健康的兒童；父母至少一方為上海市常住人口。排除標準：兒童有嚴重心腦血管疾病、遺傳代謝性疾病及外傷史；近2 周內有發熱、咳嗽、喘息等呼吸系統癥狀；有哮喘疾病史及相關用藥史；監護人拒絕簽署知情同意書，不愿意參加此次調查。在取得兒童家長同意后，對家長進行問卷調查。問卷內容包括兒童和父母基線資料、家庭環境情況等信息。最終，研究納入136 名5～7歲學齡前兒童。

1.2 尿液樣本收集和對羥基苯甲酸酯類物質檢測

用無菌無酶的聚丙烯杯收集學齡前兒童隨機尿液50 mL，分裝至15 mL 無菌無酶的聚丙烯凍存管（美國Corning公司），后立即放置于-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存。采用Ao 等［15］建立的高效液相色譜串聯質譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測兒童尿液中5 種對羥基苯甲酸酯類物質（MeP、EtP、PrP、BuP和BzP）的水平。尿樣解凍后經β-葡萄糖醛酸酶水解，用乙酸乙酯液液萃取方法進行提取，使用Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱進行梯度分離，最終用HPLC-MS/MS進行進樣分析。

對羥基苯甲酸酯類物質檢測時，隨機選擇2 名兒童的尿液混合均勻，作為空白質控樣本。在檢測過程中每間隔25 個樣本設置1 個空白質控樣本、1 個低濃度質控樣本（1 μg/mL） 和一個高濃度質控樣本（100 μg/mL），用以檢測分析性能。所有批次的質控樣本對應的目標化合物回收率的范圍均在80%～120%內。MeP、EtP、PrP、BuP 和BzP 的檢出限（limit of detection， LOD） 分 別 為0.002、 0.005、 0.000 5、0.002 和0.003 μg/L。尿液中對羥基苯甲酸酯類物質水平低于LOD 時用LOD/ 2 表示對應物質的水平［15］；根據LOD 計算檢出率，檢出率＜75%的對羥基苯甲酸酯類物質不納入統計分析。

為減少尿液濃稀程度對對羥基苯甲酸酯類物質檢出水平的影響，使用尿肌酐對對羥基苯甲酸酯類物質水平進行校正。尿樣樣本從-80 ℃冰箱中取出后室溫溶解，8 947×g離心1 min；取0.2 mL上清液，放入全自動生化分析儀（7100 Hitachi，日本）進行尿液肌酐的檢測。

1.3 肺功能檢測

采用肺功能儀（型號MasterScreen PFT System，JAEGER，德國）進行兒童肺功能檢測。檢測前對家長詳細講解肺功能檢測的方法及注意事項，檢測過程中確保兒童情緒穩定、周圍環境安靜，在兒童良好配合的情況下完成肺功能檢測。檢測指標包括：用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、1 s用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second， FEV1）、FEV1/FVC 和最大呼氣流量（peak expiratory flow，PEF）、呼氣中段流速（forced expiratory flow between the 25th and 75th percentile of forced vital capacity，FEF25-75）。肺功能檢測結果重復測定3次，3次結果差異＜5%為合格；選取3 次結果的最佳值（呼吸曲線最平穩）作為最終檢測結果。

1.4 敏感性分析

為驗證結果穩定性，依據2007 世界衛生組織頒布的5～19 歲兒童生長標準［16］，參照“同年齡、同性別兒童體質量指數（body mass index，BMI）＞生長標準中位數2 個標準差為肥胖”標準排除肥胖兒童后，在正常體質量兒童中進行敏感性分析。

1.5 統計學分析

采用Epidata 3.0 軟件進行數據錄入，應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的定量資料使用描述，符合偏態分布的定量資料使用百分位數P25、P50、P75、P90或者P50（P25，P75）描述；定性資料使用n（%）進行描述。使用Spearman 相關性分析計算對羥基苯甲酸酯類物質之間的關聯強弱。采用秩和檢驗比較不同性別兒童之間肺功能指標的差異。由于肌酐校正后，對羥基苯甲酸酯類物質水平和肺功能指標為偏態分布，在納入多元回歸前先進行log 轉化，然后采用多元線性回歸探討對羥基苯甲酸酯類物質暴露與兒童肺功能的相關性。參考相關文獻報道［9-10，17-18］，選取年齡、性別、身高、體質量指數（body mass index，BMI）、早產和家庭年收入作為混雜因素。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 學齡前兒童人口學信息

在納入研究的136 名5～7 歲兒童中，5 歲67 名（49.3%），6 歲34 名（25.0%），7 歲35 名（25.7%），平均年齡（5.76±0.84）歲；男性59 名（43.4%），早產兒11 名（8.1%），肥胖兒童13 名（9.6%）；在家庭年收入方面，16 名（11.8%）兒童家庭年收入＜10 萬元/年，51 名（37.5%）兒童家庭年收入10～30 萬元，66 名（48.5%）兒童家庭年收入≥30 萬元/年，此外有3 名（2.2%）兒童家長拒絕回答該問題。兒童身高和BMI分別為（117.29±8.15）cm和（15.78±2.86）kg/m2。

2.2 學齡前兒童對羥基苯甲酸酯類物質的暴露水平

學齡前兒童尿液中對羥基苯甲酸酯類物質MeP、EtP、PrP、BuP 和BzP 的 檢 出 率 分 別 為97.8%、86.8%、99.3%、77.9%和11.8%（表1）。其中，肌酐校正前MeP、EtP、PrP 和BuP 水平的中位數（P50）分別16.42、2.08、0.64 和0.04 μg/L。經肌酐校正后，MeP、EtP、PrP和BuP水平的中位數（P50）為36.12、3.88、1.50 和0.06 μg/g。BzP 因檢出率僅為11.8%而不納入后續統計分析。

2.3 學齡前兒童肺功能檢測結果

136 名學齡前兒童肺功能檢測結果見表2。其中，FVC、FEV1、FEV1/FVC、PEF 和FEF25-75的P50（P25，P75）分別為1.16（1.01，1.39）L、1.02（0.84，1.20）L、86.65%（80.89%，91.04%）、1.96（1.60，2.30）L/s和1.06（0.75，1.38）L/s。通過秩和檢驗比較不同性別兒童肺功能指標是否存在差異，結果顯示男性的FVC 和FEV1顯著高于女性（P＜0.05），但不同性別兒童FEV1/FVC、PEF 和FEF25-75差異未發現統計學意義（P＞0.05）。

表2 學齡前兒童肺功能指標結果（n=136）Tab 2 Distributions of pulmonary function measures in preschool children（n=136）

2.4 學齡前兒童對羥基苯甲酸酯類物質的Spearman相關性

通過Spearman相關性分析計算各種對羥基苯甲酸酯類物質之間相關性（表3）。結果顯示，4種對羥基苯甲酸酯類物質之間均呈顯著正相關（P＜0.05），其中MeP與PrP正相關最強（rs=0.56），然后依次為EtP與BuP（rs=0.38）、MeP與EtP（rs=0.28）、PrP與BuP（rs=0.20）、MeP與BuP（rs=0.16）和EtP與PrP（rs=0.15）。

表3 學齡前兒童對羥基苯甲酸酯類物質的Spearman相關性（n=136）Tab 3 Spearman's correlation among parabens in preschool children（n=136）

2.5 學齡前兒童對羥基苯甲酸酯類物質暴露與肺功能的相關性

在校正年齡、性別、身高、BMI、早產和家庭年收入等混雜因素后，多元線性回歸的結果顯示，兒童尿 液 中MeP 與FVC （β=-0.018，95%CI-0.035～-0.001）、PrP 與FEV1（β=-0.032，95%CI-0.051～-0.013）、BuP 與FVC（β=-0.018，95%CI-0.034～-0.002）以及BuP與FEV1（β=-0.021，95%CI-0.041～-0.001）均呈顯著負相關（表4）。排除13 名肥胖兒童后，在123 名正常體質量兒童中重新分析對羥基苯甲酸酯類物質暴露與肺功能的相關性作為敏感性分析，結果與表4基本保持一致。

表4 學齡前兒童對羥基苯甲酸酯類物質暴露與肺功能的相關性（n=136）Tab 4 Association between paraben exposure and pulmonary function in preschool children（n=136）

3 討論

本研究發現上海地區學齡前兒童尿液對羥基苯甲酸酯類物質檢出率高，其中MeP 和PrP 檢出率達到97.8%和99.3%，提示上海地區學齡前兒童可能普遍暴露于對羥基苯甲酸酯類物質。其中，兒童MeP、EtP、PrP 和BuP 的中位數水平分別為16.42、2.08、0.64、0.04 μg/L。經比較發現，本研究檢出的對羥基苯甲酸酯類物質的水平高于任璐等［8］報道的廣州幼兒園兒童的水平（MeP 和EtP 的尿液中位數水平分別為4.42 和1.39 μg/L），但是低于美國產前維生素D 降低哮喘試驗（Vitamin D Antenatal Asthma Reduction Trial，VDAART） 研 究［19］中460 名 兒 童 的 水 平（MeP 和PrP 中位數為62.8 和6.8 μg/L），以及美國國家健康與營養調查（National Health and Nutrition Examination Survey，NHANES）研究［20］中1 324 名兒童的水平（MeP 和PrP 中位數為52.4 和5.5 μg/L）。與國外研究相比，我國兒童尿液中對羥基苯甲酸酯類物質水平相對較低，這可能與不同國家地區在防腐劑使用量存在差異有關［2］。此外，本研究發現4種對羥基苯甲酸酯類物質之間均呈顯著正相關（P＜0.05），其中MeP 與PrP 正相關最強（rs=0.56），這與一項歐洲研究［21］中發現兒童尿液中MeP 與PrP 呈強正相關（rs=0.79）保持一致，這一現象可能跟MeP 和PrP 經常以聯合的方式加入食品、藥品和化妝品有關［2，8］。

對羥基苯甲酸酯類物質因為其在人體代謝快、不易蓄積而一度被認為對人類相對安全［22］。然而，越來越多的動物研究證據［23］表明對羥基苯甲酸酯類物質具有潛在的環境內分泌干擾作用，可通過雌激素和抗雄激素作用損害人體健康。近年來，有流行病學研究［9，12，23-25］指出兒童對羥基苯甲酸酯類物質暴露與呼吸系統不良結局有關，但研究相對較少且結論不一致。例如，Quirós-Alcalá 等［9］基于NHANES 開展的橫斷面研究發現兒童尿液中MeP 和PrP 濃度每增加10 倍，男孩出現哮喘急診就診行為的風險分別增加2.61 （95%CI1.40～4.85） 倍 和2.18 （95%CI1.22～3.89）倍。但是，美國［24］和日本［25］的2項病例對照研究卻未發現兒童對羥基苯甲酸酯類物質暴露與哮喘的關聯?，F有研究大多關注兒童哮喘，不同研究之間哮喘定義和分組方式不同可能與結論不一致有關。因此，在兒童對羥基苯甲酸酯類物質暴露對呼吸系統影響的研究中引入具有定量檢測結果的肺功能十分必要。據我們所知，目前僅有歐洲一項名為人類生命早期暴露組（Human Early-Life Exposome，HELIX）的研究［12］分析兒童對羥基苯甲酸酯類物質暴露對肺功能的影響，該研究者發現兒童EtP 暴露與FEV1呈顯著負相關（β=-0.05，95%CI-0.10～-0.01）。本研究發現兒童MeP 和BuP 暴露與FVC 呈顯著負相關，PrP和BuP 暴露與FEV1呈顯著負相關。本研究與歐洲HELIX 研究結果均提示兒童對羥基苯甲酸酯類物質暴露與肺功能指標呈負相關。盡管現有肺功能證據較少，考慮到兒童普遍暴露于對羥基苯甲酸酯類物質且其呼吸系統發育尚不成熟，仍需高度重視對羥基苯甲酸酯類物質對兒童呼吸系統特別是肺功能指標的影響。

本研究選取上海地區小樣本學齡前兒童為研究對象，通過檢測尿液樣本中對羥基苯甲酸酯類物質水平、探討其與兒童肺功能指標的相關性，為了解上海地區學齡前兒童該類物質暴露水平及評估其對兒童健康風險提供了參考依據。但本研究尚存在一定局限性。首先，樣本量相對較少，人群代表性有限。其次，采集的是兒童隨機尿液樣本。盡管對羥基苯甲酸酯類物質水平已進行尿肌酐校正，但仍可能存在暴露偏倚。最后，本研究為橫斷面研究，在確定因果關聯時受限，未來仍需進一步驗證對羥基苯甲酸酯類物質暴露與兒童肺功能的關系。

綜上所述，本研究發現上海地區學齡前兒童對羥基苯甲酸酯類物質檢出率較高，對羥基苯甲酸酯類物質暴露與兒童肺功能指標呈負相關。未來開展大樣本、多中心和多時點的對羥基苯甲酸酯類物質暴露評估，可更精準地反映其在我國學齡前兒童的實際暴露情況；此外，通過前瞻性隨訪兒童肺功能指標，探討兒童對羥基苯甲酸酯類物質暴露對呼吸系統的影響，可為評估兒童健康風險提供更多參考依據。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有試驗均已通過上海交通大學醫學院附屬兒童醫院倫理委員會的審核批準［審批號2019R046-E02，日期2019-08-05］。研究對象的監護人已經簽署知情同意書。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by Shanghai Children's Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （approval letter No.2019R046-E02，dated 08/05/2019）. Consent letters have been signed by the guardian of research participants.

作者貢獻/Authors'Contributions

丁國棟、戶宜參與研究設計；戶宜、丁國棟參與論文寫作和修改；所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by DING Guodong and HU Yi. The manuscript was drafted by HU Yi and revised by DING Guodong.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-29

·Accepted：2022-07-06

·Published online：2022-08-08

參·考·文·獻

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