KRAS4AG12C和KRAS4BG12C對人肺上皮細胞生長和運動的作用差異及機制研究

鄒菁華，宮淼淼，沈 瑛

1.上海交通大學基礎醫學院藥理學與化學生物學系，上海200025；2.上海市轉化醫學協同創新中心，上海200025

肺癌的發病率和病死率都高居惡性腫瘤前列，預計5 年生存率僅為18%，嚴重威脅著人類生命健康［1］。在疾病進展過程中，肺癌原發部位的腫瘤細胞會通過局部浸潤以及血管和淋巴管的遠端轉移而定植到其他部位生長，稱為腫瘤轉移［2］。轉移不僅是腫瘤耐藥復發的主要原因，更是患者常見的死因［3-4］。

大鼠肉瘤病毒（rat sarcoma，Ras）家族是腫瘤中突變頻率最高的基因家族［5］，其中鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，Kras）的惡性程度最高，是肺癌（30%）、結腸癌（40%）、胰腺癌（80%） 三大致命癌癥的主要致癌驅動基因［6］。人類約13%的惡性腫瘤伴隨KRAS基因突變［7］，肺癌中KRAS主要突變亞型包括KRASG12C、KRASG12D、KRASG12V、KRASQ61H等，其 中KRASG12C占比高達46%［8］。然而，由于KRAS 與鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）的高親和力以及表面缺少可以與小分子緊密結合的疏水口袋，KRAS 一度被認為是不可成藥的靶點［8-10］。 近年來，KRASG12C共價抑制劑AMG510 和MRTX849 成功研發，臨床試驗療效顯著，給KRASG12C突變患者帶來新的希望，然而長期使用均不可避免發生適應性或獲得性耐藥［11］。

KRAS基因轉錄表達的過程中，其第四外顯子發生選擇性剪切，得到KRAS4A 和KRAS4B 這2 種剪接形式的蛋白，這2 種蛋白在保守結構域（1-165殘基） 具有高度同源性，其中包括鳥苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）/GTP 結合區和效應因 子 結 合 區［12-13］， 在 C 端 高 度 可 變 區（hypervariable region，HVR，166-188 或189 殘基）存在差異，這一區域在膜靶向性、蛋白-蛋白相互作用和信號轉導方面起著重要作用［14］。KRAS4A和KRAS4B在人類胚胎發育早期表達水平相當，而在成體組織中差異表達［15］，且均能編碼致癌蛋白［16］。在腫瘤細胞中，KRAS通常在第一或第二外顯子的12、13、61 密碼子發生點突變，蛋白構象發生改變，從而處于異常激活狀態，促進癌癥的發生發展［17-19］。有研究報道，KRAS4A 具有獨特的雙膜靶向結構，能夠特異性結合并激活己糖激酶1（hexokinase 1，HK1）［20］，而KRAS4B 通過C 端高度可變區與鈣調蛋白（calmodulin，CaM） 結合，有利于保持腫瘤細胞的干性狀態［21］。在肺癌細胞系中，KRAS4BmRNA 水平顯著高于KRAS4AmRNA［16］。然而，關于KRAS4A 和KRAS4B 在肺癌轉化過程中的生物學差異尚未研究清楚。本研究將圍繞KRAS4A 和KRAS4B 促進人肺支氣管上皮細胞生長和運動的差異與分子機制進行深入探究，構建人正常肺支氣管上皮細胞BEAS-2B KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過表達細胞株，通過細胞增殖、細胞遷移、細胞黏附實驗觀察細胞表型差異，全轉錄組RNA-seq 方法檢測差異基因及信號通路變化并用實時熒光定量PCR （quantitative real-time PCR，qPCR）進一步驗證，通過探究不同剪接體致癌機制的差異，為KRAS 特異性靶向抑制劑的研究提供一定的實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 細胞系 人正常肺支氣管上皮細胞系BEAS-2B，人胚腎上皮永生化細胞系293FT 均在上海交通大學基礎醫學院藥理學與化學生物學系保存并使用。

1.1.2 主要試劑 0.25%胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、青霉素-鏈霉素（雙抗）溶液及谷氨酰胺溶液購自上海源培生物科技股份有限公司，Takara RNA 提取試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix （Perfect Real Time）試劑盒購自日本Takara 公司，轉染專用減血清培養基、DMEM 高糖培養基、BCA 蛋白定量試劑盒、預染蛋白分子量marker、Lipofectamine 3000 試劑、P3000試劑及ECL 顯色液購自美國Thermo Fisher Scientific公司，胎牛血清購自美國Gemini 公司，Ku86 抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司，Tubulin 抗體購自美國Proteintech 公司，RAS 抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 及抗小鼠IgG 購自美國Cell Signaling Technology 公司，RIPA 裂解液、Western blotting 一抗稀釋液及蛋白酶抑制劑購自上海碧云天公司。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜、CO2細胞培養箱購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，制冰機購自美國Scotsman 公司，蛋白電泳及轉印系統、預制膠、多功能酶標儀購自美國Bio-Rad 公司，實驗用超純水系統購自美國Millipore 公司，Incucyte 活細胞動態實時成像儀購自美國Essen 公司，Odyssey 雙色紅外成像系統購自美國LI-COR 公司，倒置相差顯微鏡購自日本Nikon 公司，磁力攪拌器購自德國IKA 公司，移液器、低溫高速離心機購自德國Eppendorf 公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養及傳代 配制DMEM 高糖完全培養基（含1%谷氨酰胺、1%雙抗溶液、10%胎牛血清）。PBS 清洗細胞，37 ℃預熱的0.25%胰蛋白酶（含0.038% EDTA）消化1～2 min，新鮮完全培養基終止消化。1∶3 傳代，持續觀察細胞狀態。

1.2.2 構建過表達KRAS4AG12C和KRAS4BG12C細胞系 按比例配制轉染專用減血清培養基、Lipo 3000試劑、P3000 Enhancer Reagent、包裝質粒、目的基因質?；旌衔镛D染293FT 細胞。收集24 h 和48 h 病毒。使用含病毒培養液和Polybrene 感染BEAS-2B 細胞，1 μg/mL 嘌呤霉素篩選，擴增、保種及后續實驗。

1.2.3 蛋白質印跡法檢測 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測模型的構建。配制10% SDS-PAGE 膠，電泳2～3 h；使用甲醇活化PVDF 膜，4 ℃恒流轉膜2～3 h；5%脫脂奶粉室溫封閉1～2 h；一抗冷室孵育過夜；二抗室溫孵育1 h；ECL 顯色液顯影。

1.2.4 劃痕實驗分析 取對數生長期細胞（20 000個/孔）接種，待細胞匯合度達到95%時，無菌劃痕儀劃痕，PBS 清洗2 次，換用新鮮培養基。使用Incycute 活細胞動態實時成像儀拍照并分析數據。

1.2.5 Transwell 實驗分析 于上層小室中接種細胞，50 000 個/孔，上層小室和下層小室分別為基礎培養基和完全培養基，孵育20 h。PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛固定25 min，結晶紫染色過夜。用棉簽輕柔擦掉上室細胞，PBS 清洗2 次，于顯微鏡下觀察及拍照。待液體蒸發后用10% 冰醋酸萃取，595 nm 波長下檢測吸光度值進行定量分析。

1.2.6 RNA-seq 檢測 提取RNA 樣品后送至武漢華大基因科技有限公司檢測。

1.2.7 基因集富集分析 采用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）對RNA-seq數據進行分析做圖，具體操作步驟見文獻［22］。其中標準化富集得分（normalized enrichment score，NES）絕對值大于1，normalP＜0.05 的通路下的基因集合是有意義的。

1.2.8 RNA 提取及qPCR 檢測 參照Takara RNA 提取試劑盒說明書提取RNA，經細胞裂解、DNA 清除、RNA 純化、洗脫、DNA 酶消化、洗脫等步驟得到50 μL RNA。使用Nanodrop 檢測RNA 樣品的R 值及濃度。配制反轉錄體系：4 μL 1.5×PrimeScript RT Master Mix+RNA 1 000 ng+無RNA 酶水。參照儀器內反轉錄程序，關鍵步驟為37 ℃15 min，85 ℃5 s。qPCR 反 應 體 系 配 制：6.4 μL 無RNA 酶 水+10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ+0.8 μL PCR 上 游 引 物（10 μmol/L）+0.8 μL PCR 下游引物（10 μmol/L）+2 μL cDNA。預變性條件為95 ℃反應30 s；擴增條件為95 ℃反應5 s，60 ℃反應34 s，循環40 次。引物序列見表1。

表1 qPCR所用的引物序列Tab 1 Sequences of primers for qPCR

1.3 統計學方法

使用GraphPad Prism 8 軟件對數據進行統計分析及作圖。定量結果采用xˉ±s表示，使用student'st檢驗進行組間比較。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過表達引起人正常肺支氣管上皮細胞形態變化并增強其增殖能力

Western blotting 結果顯示BEAS-2B KRAS4AG12C和BEAS-2B KRAS4BG12C穩定過表達細胞株構建成功（圖1A、1B）。Incucyte 實時觀測細胞增殖變化，結果顯示與親本相比，BEAS-2B KRAS4AG12C和BEAS-2B KRAS4BG12C細胞增殖能力增強（圖1C）。為了探究KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過 表 達 對BEAS-2B 細胞形態的影響，于顯微鏡下觀察細胞形態（圖1D）：BEAS-2B 對照組細胞整體形態偏圓，細胞較薄，立體結構不明顯。BEAS-2B KRAS4AG12C細胞趨向不規則形狀生長，有偽足狀結構生成；BEAS-2B KRAS4BG12C細胞立體結構明顯，形狀變為長梭形，細胞間連接增多，有偽足狀結構生成。這些結果提示KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過表達促進BEAS-2B細胞增殖并引起形態改變。

圖1 KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過表達對肺上皮細胞形態及增殖的影響Fig 1 Effects of KRAS4AG12C or KRAS4BG12C overexpression on pulmonary epithelial cells morphology and proliferation

2.2 KRAS4BG12C引起細胞運動能力增強效果強于KRAS4AG12C

進一步探究KRASG12C不同剪接體對人肺上皮細胞運動能力的影響。劃痕實驗結果顯示12 h后，BEAS-2B KRAS4BG12C細胞劃痕區完全愈合，而BEAS-2B KRAS4AG12C細胞與親本細胞劃痕區尚未愈合，表明BEAS-2B KRAS4BG12C細胞運動能力顯著強于BEAS-2B KRAS4AG12C細胞（P=0.006）及BEAS-2B 親本細胞（P=0.000，圖2A、2B）。同樣，Transwell 實驗結果也證實BEAS-2B KRAS4BG12C細胞遷移能力顯著強于BEAS-2B KRAS4AG12C細胞（P=0.048），且顯著強于BEAS-2B 親本細胞（P=0.033，圖2C、2D）。這些結果說明過表達KRAS4BG12C引起人肺支氣管上皮細胞運動能力增強效果強于KRAS4AG12C。

圖2 KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過表達對肺上皮細胞運動的影響Fig 2 Effects of KRAS4AG12C or KRAS4BG12C overexpression on pulmonary epithelial cells migration

2.3 KRAS4BG12C過表達促進BEAS-2B細胞黏附相關基因CLDN1和CADM3表達上調

為了進一步探究過表達KRAS4BG12C促進人肺上皮細胞運動的分子機制， 我們對BEAS-2B KRAS4AG12C過表達細胞和BEAS-2B KRAS4BG12C過表達細胞進行RNA-seq 測序，后對測序結果進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG） 通 路 富 集 分 析 及GSEA，尋找差異基因及信號通路變化。KEGG 分析的結果顯示，細胞黏附分子信號通路排名第二（P=0.000，圖3A）。GSEA 分析的結果顯示，與BEAS-2B KRAS4AG12C過表達細胞相比，BEAS-2B KRAS4BG12C過表達細胞中的細胞黏附分子相關信號通路發生顯著上調（P=0.002，圖3B）。使用qPCR對細胞黏附分子通路中關鍵基因CLDN1和CADM3的mRNA 水平進行檢測， 發現與BEAS-2B KRAS4AG12C過表達細胞相比，BEAS-2B KRAS4BG12C過表達細胞中黏附相關基因CLDN1和CADM3的mRNA 水平顯著升高（P=0.000，圖3C、3D）。這些結果提示KRAS4BG12C促進黏附相關基因CLDN1和CADM3上調，促進細胞運動。

圖3 KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過表達對黏附相關基因CLDN1和CADM3表達的影響Fig 3 Effects of KRAS4AG12C or KRAS4BG12C overexpression on the mRNA levels of CLDN1 and CADM3

3 討論

KRAS作為多種癌癥中的主要致癌驅動基因，30多年來一直被認為是不可成藥的靶點。近年來，KRASG12C特異性共價抑制劑AMG510 的上市給KRAS突變癌癥患者帶來了希望［23］。但KRAS基因不同剪接變體在驅動癌癥進展方面的分子機制以及KRAS不同基因突變類型致癌分子機制均尚未研究清楚，也增加了KRAS 抑制劑研發的難度。最近有研究報道KRAS4A 和KRAS4B 在各種癌癥細胞株中均廣泛表達，肺癌和胰腺癌細胞中以KRAS4B 表達為主，而結腸癌和黑色素瘤細胞中KRAS4A 和KRAS4B 表達水平相當［16］。為了研究KRASG12C不同剪接變體促進肺上皮細胞生長和運動的差異及其機制，我們通過慢病毒感染在人正常肺支氣管上皮細胞BEAS-2B 中成功構建KRAS4AG12C和KRAS4BG12C（2 種剪接體）穩定過表達細胞株，鏡下觀察發現KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過表達均引起肺上皮細胞形態變化，并且均可以促進細胞增殖。于是我們提出科學假設：攜帶活化突變的KRAS4AG12C和KRAS4BG12C2 種剪接體對肺上皮細胞的運動能力有何影響？哪種惡性程度更高？引起肺上皮細胞運動能力變化的分子機制如何？

為了解決這些問題，我們使用劃痕實驗和Transwell 實驗模擬體內細胞遷移的過程，結果顯示過表達KRAS4BG12C引起肺上皮細胞運動能力增強效果強于過表達KRAS4AG12C。 為了進一步探究KRAS4BG12C促進肺上皮細胞運動的分子機制，我們使用RNA-seq 方法對細胞全基因轉錄組進行測序并用GSEA 進行基因集富集分析，尋找差異基因及信號通路變化。結果顯示與BEAS-2B KRAS4AG12C細胞相比，BEAS-2B KRAS4BG12C細胞中細胞黏附分子相關信號通路發生顯著上調。使用qPCR 對細胞中黏附相關基因CLDN1和CADM3的表達水平進一步驗證發現，與過表達KRAS4AG12C相比，過表達KRAS4BG12C促進黏附相關基因CLDN1和CADM3表達上調。有文獻報道，結腸癌中CLDN1高表達，誘導腫瘤細胞發生上皮間充質轉化，促進腫瘤轉移［24］；RAS突 變 合 并CLDN1表 達 上 調 與 肺 腺 癌 患者預后不良密切相關［25］；結腸癌中CADM3 高表達與患者預后不良相關［26］。綜上，KRAS4BG12C促進細胞運動能力更強，與CLDN1 表達水平升高相關，這也與肺癌細胞系中KRAS4B 更高的表達水平相匹配。雖然KRAS4AG12C促進肺上皮細胞運動較弱，但KRAS4AG12C同樣可以促進肺上皮細胞增殖，具有一定的致癌活性。因此我們認為，針對KRAS 突變腫瘤開發的治療策略仍然需要考慮對KRAS 2 種蛋白剪接體的抑制作用。

本研究在細胞實驗中探究了KRAS4AG12C和KRAS4BG12C促進人肺上皮細胞BEAS-2B 生長和運動的差異，即初步證明人肺上皮細胞BEAS-2B 有發生惡性轉化的趨勢，關于是否發生惡性轉化還需體內成瘤實驗進一步深入探究。 而KRAS4AG12C和KRAS4BG12C2 種剪接體之間的這種差異與其哪個功能區相關，還需構建蛋白截斷體及失活突變過表達細胞模型進一步深入探究。

綜上，本研究表明KRAS4AG12C和KRAS4BG12C均可促進人肺上皮細胞增殖，KRAS4BG12C促進肺上皮細胞運動能力更強，并初步探究了相關分子機制。本研究進一步揭示了KRASG12C不同剪接體在肺癌中生物學差異的分子機制，為KRAS特異性靶向抑制劑的研究提供了一定的實驗依據和理論基礎。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻/Authors'Contributions

沈瑛和鄒菁華參與實驗設計；沈瑛、鄒菁華、宮淼淼參與論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意最終稿件的提交。

The study was designed by SHEN Ying and ZOU Jinghua. The manuscript was drafted and revised by SHEN Ying，ZOU Jinghua and GONG Miaomiao. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-10

·Accepted：2022-03-08

·Published online：2022-04-26

參·考·文·獻

[1] TURNER M C,ANDERSEN Z J, BACCARELLI A, et al. Outdoor air pollution and cancer: an overview of the current evidence and public health recommendations[J]. CA A Cancer J Clin, 2020, 70(6):460-479.

[2] TSAY J C J,WU B G,SULAIMAN I,et al. Lower airway dysbiosis affects lung cancer progression[J]. Cancer Discov,2021,11(2):293-307.

[3] BIRKBAK N J, MCGRANAHAN N. Cancer genome evolutionary trajectories in metastasis[J]. Cancer Cell,2020,37(1):8-19.

[4] BERGERS G, FENDT S M. The metabolism of cancer cells during metastasis[J]. Nat Rev Cancer,2021,21(3):162-180.

[5] PRIOR I A, LEWIS P D, MATTOS C. A comprehensive survey ofRasmutations in cancer[J]. Cancer Res,2012,72(10):2457-2467.

[6] FERNáNDEZ-MEDARDE A, SANTOS E. Ras in cancer and developmental diseases[J]. Genes Cancer,2011,2(3):344-358.

[7] AACR Project GENIE Consortium. AACR project GENIE:powering precision medicine through an international consortium[J]. Cancer Discov,2017,7(8):818-831.

[8] MOORE A R, ROSENBERG S C, MCCORMICK F, et al. RAStargeted therapies: is the undruggable drugged? [J]. Nat Rev Drug Discov,2020,19(8):533-552.

[9] KESSLER D, GMACHL M, MANTOULIDIS A, et al. Drugging an undruggable pocket on KRAS[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2019,116(32):15823-15829.

[10] LI S Q,BALMAIN A,COUNTER C M. A model for RAS mutation patterns in cancers:finding the sweet spot[J]. Nat Rev Cancer,2018,18(12):767-777.

[11] ZHANG B Y, ZHANG Y, ZHANG J W, et al. Focal adhesion kinase(FAK) inhibition synergizes with KRAS G12C inhibitors in treating cancer through the regulation of the FAK-YAP signaling[J]. Adv Sci(Weinh),2021,8(16):e2100250.

[12] VIGIL D,CHERFILS J,ROSSMAN K L,et al. Ras superfamily GEFs and GAPs:validated and tractable targets for cancer therapy?[J]. Nat Rev Cancer,2010,10(12):842-857.

[13] BOS J L, REHMANN H, WITTINGHOFER A. GEFs and GAPs:critical elements in the control of small G proteins[J]. Cell, 2007,129(5):865-877.

[14] AHEARN I M, HAIGIS K, BAR-SAGI D, et al. Regulating the regulator: post-translational modification of RAS[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2011,13(1):39-51.

[15] PELLS S, DIVJAK M, ROMANOWSKI P, et al. Developmentallyregulated expression of murine K-ras isoforms[J]. Oncogene, 1997,15(15):1781-1786.

[16] TSAI F D, LOPES M S, ZHOU M, et al. K-Ras4A splice variant is widely expressed in cancer and uses a hybrid membrane-targeting motif[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2015,112(3):779-784.

[17] SIMANSHU D K, NISSLEY D V, MCCORMICK F. RAS proteins and their regulators in human disease[J]. Cell,2017,170(1):17-33.

[18] SMITH M J, NEEL B G, IKURA M. NMR-based functional profiling of RASopathies and oncogenic RAS mutations[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(12):4574-4579.

[19] HANCOCK J F. Ras proteins: different signals from different locations[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2003,4(5):373-384.

[20] AMENDOLA C R, MAHAFFEY J P, PARKER S J, et al. KRAS4A directly regulates hexokinase 1[J]. Nature,2019,576(7787):482-486.

[21] WANG M T, HOLDERFIELD M, GALEAS J, et al. K-ras promotes tumorigenicity through suppression of non-canonical Wnt signaling[J].Cell,2015,163(5):1237-1251.

[22] SUBRAMANIAN A, TAMAYO P, MOOTHA V K, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(43):15545-15550.

[23] LANMAN B A, ALLEN J R, ALLEN J G, et al. Discovery of a covalent inhibitor of KRASG12C (AMG 510) for the treatment of solid tumors[J]. J Med Chem,2020,63(1):52-65.

[24] DHAWAN P, SINGH A B, DEANE N G, et al. Claudin-1 regulates cellular transformation and metastatic behavior in colon cancer[J].J Clin Investig,2005,115(7):1765-1776.

[25] SUN B S,YAO Y Q, PEI B X, et al. Claudin-1 correlates with poor prognosis in lung adenocarcinoma[J]. Thorac Cancer, 2016, 7(5):556-563.

[26] CHEN W Z, HUANG JF, XIONG J B, et al. Identification of a tumor microenvironment-related gene signature indicative of disease prognosis and treatment response in colon cancer[J]. Oxid Med Cell Longev,2021,2021:6290261.