海綿來源的smenospongine 通過抑制非小細胞肺癌細胞中的EGFR-Akt-ABCG2信號通路抑制順鉑耐藥

廖雅慧，劉麗云，朱泓睿，林厚文，嚴繼舟，孫 凡#

1.上海海洋大學海洋生物與組織再生實驗室，上海 201306；2.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院海洋藥物實驗室，上海200127；3.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院黃浦分院藥劑科，上海 200011

肺癌的發病率和死亡率均高居全球惡性腫瘤之首。據統計資料表明，2020 年全球肺癌發病人數220萬，死亡人數亦高達180萬［1］。肺癌在臨床上分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。其中，NSCLC 包括肺腺癌（adenocarcinoma）、肺鱗癌（squamous cell carcinoma）和大細胞肺癌（large-cell carcinoma），占肺癌總數的85%［1］。NSCLC 治療的方法主要有手術治療和化學治療（化療），近年來靶向藥物和免疫治療的應用也逐漸廣泛。但許多NSCLC 患者在最初就被診斷為ⅢB 或Ⅳ期，或在手術后復發［2］，靶向藥物如表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI）和免疫抑制劑如程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）抑制劑的用藥指征尚不明確，因此化療仍然是目前主要的治療方法。由于腫瘤出現化療耐藥，NSCLC 患 者 的5 年 生 存 率 僅 為26%［3］。以 順 鉑（cisplatin， cis-diamminedichloroplatinum， DDP） 為基礎的治療方案是晚期NSCLC 治療中應用最廣泛的方案［4］。因此，尋找逆轉順鉑耐藥的方法是NSCLC治療中亟待解決的關鍵問題。目前，順鉑耐藥的主要原因有：癌細胞DNA 損傷修復能力增強、多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）蛋白的過度表達以及癌細胞對凋亡的抵抗［5-7］。在多藥耐藥機制中，ATP結合盒（ATP-binding cassette，ABC）蛋白的過度表達被認為是最常見的［8］。迄今為止已經發現至少15種ABC 蛋白，這些蛋白形成藥物外排泵，與介導MDR 有關［9］。一項對結腸癌奧沙利鉑耐藥株的研究［10］發現，與母本細胞相比，耐藥株中ABC 蛋白G超家族成員2 （ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2） 表達水平明顯增高，加入ABCG2抑制劑維拉帕米可誘導內質網應激進而導致細胞凋亡。磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，Akt）信號通路通過對細胞外刺激做出應答，參與調控增殖、生長、存活、運動性和代謝等多種細胞功能，該通路的異常激活是加速癌癥發展的因素。Akt是PI3K的主要下游效應因子之一，最初被認為是胰島素受體細胞內信號轉導的重要組成部分。有研究者［11］發現，Akt1 在肺腺癌細胞A549 順鉑耐藥株中過表達，并通過調控Rapamycin/p70S6K1信號通路產生耐藥。當抑制Akt1 活性時，耐藥株對順鉑的敏感性顯著增加。

Smenospongine （SME） 是 本 實 驗 室 從 海 綿Spongia pertusaesper 中分離得到的一種倍半萜氨基醌［12］。據報道［13-14］，SME 可誘導K562 細胞紅系分化，誘導白血病細胞的G1 期阻滯和凋亡。其他研究［15-16］也報道了SME 在人臍靜脈內皮細胞中的抗增殖和抗血管生成活性。本實驗室前期研究［17］發現SME 對腫瘤干細胞樣細胞有抑制作用。然而，SME對NSCLC順鉑耐藥的作用和機制尚未見報道。

本研究構建了NSCLC順鉑耐藥株A549/DDP，并深入探討了SME對該耐藥株的抑制作用和分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用細胞 人NSCLC 系A549 購自中國科學院上海細胞庫，順鉑耐藥細胞株A549/DDP 購自湖南豐暉生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM F12k 培養基、RPMI 1640 培養基、10%胎牛血清購自美國Gibco 公司；CCK-8 試劑盒購于日本東仁化學；RNA Simple Total RNA Kit 購于北京天根生物科技公司，Prime Script RNA RT試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqⅡ（Tli RNAseH Plus）購于日本Takara 公司；順鉑、吉西他濱（gemcitabine，GEM）、培美曲塞、酒石酸長春瑞濱（vinorelbine，NVB）購于美國Selleck 公司；魚藤素（deguelin）購于上海皓元生物醫藥科技有限公司；表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）購于美國Gibco公司；BCA 蛋白檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術有限公司；抗E-cadherin、N-cadherin、鋅指轉錄因子slug（SNAI2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、重組人B細胞淋巴瘤因子2 xL（recombinant human B-cell leukemia/lymphoma 2 xL，Bcl-xL）、Akt、p-Akt、EGFR、p-EGFR、甘油醛-3- 磷 酸 脫 氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體，抗兔IgG，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯二抗和抗鼠IgG 購自美國Cell Signaling Technology 公司；抗ABCG2抗體購于英國Abcam公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購于上海雅酶生物醫藥科技有限公司；蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、結晶紫染色液和TUNEL （TdTmediated dUTP Nick-end labeling）試劑盒購于江蘇碧云天生物技術有限公司； 聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國Merck Millipore 公司；封閉液購于美國Odyssey 公司；PI/RNAse染色液和Transwell小室購于美國BD公司。

SME 的提取和分離由本實驗室從南海海綿Spongia pertusaesper中分離得到，其結構和純度已由本實驗室確定，SME的純度超過98%［17］。

二氧化碳培養箱購于美國Thermo Fisher Scientific公司；核酸和蛋白分析儀購于美國Beckman公司；Amersham Imager 600 超靈敏多功能成像儀購于美國GE 公司；熒光定量PCR 儀Light Cycler 480 購于瑞士Roche 公司；-80 ℃低溫冰箱、流式細胞儀購于美國Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 NSCLC 細胞A549 培養于DMEM F12k 培養基（含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素）中，A549/DDP細胞培養于RPMI 1640培養基（含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和1 μg/mL 順鉑）中，2種細胞均于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。

1.2.2 CCK-8 實驗 將各實驗組細胞按3 000個/孔接種于96孔板中，每組5個復孔，37 ℃培養過夜，待細胞貼壁之后，分別加入順鉑、GEM、培美曲塞、NVB和5-氟尿嘧啶等抗癌藥物。培養48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 工作液，繼續避光45 min。隨后以酶標儀檢測細胞活力，最后繪制不同時間細胞的生長曲線。

1.2.3 克隆形成試驗 采用結晶紫染色和定量方法進行集落形成實驗。細胞以每孔1 000 個細胞的密度種植在6孔板中。37 ℃培養48 h后加入藥物。藥物處理8～9 d，每3 d 更換含藥培養基。最后細胞用4%甲醛固定，0.5%結晶紫染色。

1.2.4 蛋白質印跡法 將收集的細胞樣品加入RIPA蛋白裂解液，用BCA 試劑盒測定蛋白濃度；取12 μg總蛋白量上樣至SDS-PAGE 膠進行電泳；電泳結束后，轉移SDS-PAGE 膠至PVDF 膜上；轉膜結束后，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育2 h；化學發光成像系統進行顯色反應。

1.2.5 實時熒光定量PCR 檢測A549 和A549/DDP 經處理后ABCG2的mRNA 表達水平 用試劑盒提取總RNA、Prime Script RNA RT 試劑盒合成cDNA。實時熒 光 定 量PCR （quantitative real-time PCR， qRTPCR） 的10 μL 擴增體系：5 μL SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ（2×），1 μL RT 反應液（cDNA 溶液）、上下引物各0.2 μL，3.6 μL dH2O（滅菌蒸餾水）。程序設置為：95 ℃3 min；95 ℃5 s，60 ℃25 s，72 ℃25 s，循環數為40 次。每個樣本設置3 個復孔，采用2-ΔΔCT法對2 株細胞的ABCG2、β-actin 表達水平進行分析。所設計的ABCG2的上游和下游引物分別為5'-GGAT GAGCCTACAACTGGCTT-3'、 5'-TTCCTGAGGCCA ATAAGGTG-3'；β-actin 的上游和下游引物分別為5'-CCTGGCACCCAGCAGCAAT-3'、 5'-GGGCCGGAC TCGTCATAC-3'。

1.2.6 細胞周期分析 將細胞暴露于不同濃度的SME 中24 h 后，用70%乙醇固定，置于-20 ℃過夜。采用PI-RNase 溶液避光染色15 min。流式細胞儀分析細胞周期分布。并用Modfit軟件分析細胞周期分布以及繪圖。

1.2.7 TUNEL 法檢測細胞凋亡 將細胞固定在4%多聚甲醛中，按說明用TUNEL 試劑盒染色。熒光信號在熒光顯微鏡上捕捉。

1.2.8 Transwell侵襲實驗 細胞用100 μL無血清培養基重懸接種于Transwell上室，下室加入500 μL含10%血清培養基，置于培養箱中常規培養24 h。用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，并將小室適當風干，于顯微鏡下觀察，拍照，并計數。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行數據分析和繪圖。定量資料用表示。采用獨立樣本t檢驗分析2組數據間的差異；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 順鉑耐藥株A549/DDP的鑒定

我們首先利用順鉑誘導獲得A549/DDP 細胞并對其耐藥性進行了檢測。對順鉑在A549和A549/DDP細胞中的IC50檢測結果如圖1 所示，發現A549 的IC50為3.73 μmol/L，而A549/DDP 的IC50為155.10 μmol/L，即A549/DDP 是A549 的41.55 倍，表 明A549/DDP 細胞對高濃度的順鉑具有耐藥性。為了檢測A549/DDP對其他藥物的反應，我們檢測了一些臨床上常用的一線NSCLC 化療藥物［GEM、NVB、培美曲塞和5-氟尿嘧啶（5-FU）］對2 種細胞的IC50。結果如表1 所示。我們利用GEM、NVB 和培美曲塞同時處理2 株細胞，發現A549/DDP 的耐藥指數分別是A549 的5.050 倍、895.000 倍以及6.342 倍。結果提示A549/DDP與母本細胞相比獲得了MDR特性。

表1 順鉑耐藥株的MDR特性Tab 1 MDR features of cisplatin-resistant cells

圖1 順鉑耐藥株的鑒定Fig 1 Authentication of cisplatin-resistant cells

2.2 SME抑制順鉑耐藥細胞增殖和轉移

為了研究SME 對A549/DDP 細胞的作用，我們用SME 處理A549 和A549/DDP 細胞，以CCK-8 檢測了細胞對SME 的IC50。結果可見，SME 對A549/DDP的IC50與A549 十分接近，甚至小于A549（圖2A），提示SME 對順鉑耐藥細胞的增殖有抑制作用，甚至優于母本細胞。進一步利用克隆形成實驗驗證SME對細胞增殖的抑制作用。圖2B 可見，在對照組中A549 和A549/DDP 的克隆有明顯的差異（圖2B 左）。然而，當分別用5 和20 μmol/L SME 處理細胞時，克隆形成明顯減少（圖2B中和右），幾乎與母本細胞相同。上述結果提示SME 可有效抑制A549/DDP 細胞增殖。

為了研究SME 對A549/DDP 遷移能力影響，我們進行了Transwell 實驗。結果顯示，5 和20 μmol/L SME 能明顯抑制A549/DDP 細胞的遷移能力（圖2C）。此外，利用蛋白質印跡法（Western blotting）檢測上皮間質轉化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）標志物蛋白，結果發現與A549 細胞相比，A549/DDP 細胞的上皮標志物E-cadherin 蛋白水平較低，而間質標志物slug 和N-cadherin 較高（圖2D）。提示在耐藥細胞中發生了EMT。隨后我們用0、5、10 和20 μmol/L SME 分別處理A549/DDP 24 h，隨著實驗中SME 濃度的增加，A549/DDP 細胞E-cadherin 蛋白水平升高，slug 和N-cadherin 蛋白水平則逐漸下調（圖2E），提示SME可有效抑制耐藥細胞EMT和遷移能力。

圖2 SME抑制順鉑耐藥細胞增殖和轉移Fig 2 SME inhibits cell proliferation and EMT in cisplatin-resistant cells

上述結果表明，SME 可有效抑制順鉑耐藥細胞的增殖能力和遷移能力，抑制耐藥細胞的增長。

2.3 SME抑制順鉑耐藥細胞ABCG2基因表達

為了揭示SME 抑制耐藥細胞的機制，我們研究了SME 作用下，A549/DDP 細胞中與MDR 密切相關的ABC 家族蛋白水平的變化。利用0、5、10 和20 μmol/L SME 分 別 處 理A549/DDP 細 胞，采 用Western blotting 檢 測ABCC11 和ABCB1 蛋 白 水 平（圖3A）。結果發現，在SME 的作用下，ABCC11 和ABCB1 均無明顯差別。進一步研究發現，以0、5、10 和20 μmol/L SME 處理A549 和A549/DDP 24 h 后，ABCG2 蛋白水平呈SME 濃度梯度依賴性下調，SME濃度越高，對ABCG2 蛋白抑制越明顯。同時結果顯示耐藥細胞中的ABCG2 水平明顯高于母本細胞（圖3B）。為了檢測SME是否影響ABCG2的mRNA水平，我 們 對A549 和A549/DDP 中ABCG2進 行 了qRT-PCR檢測，結果發現以20 μmol/L SME處理，可顯著降低A549 和A549/DDP 中ABCG2mRNA 水平（圖3C）。這些結果表明，SME 可抑制ABCG2的基因轉錄進而減少蛋白表達，A549/DDP的耐藥性可能與ABCG2上調相關。

圖3 SME抑制順鉑耐藥細胞ABCG2基因表達Fig 3 SME inhibits the mRNA expression of ABCG2 in cisplatin-resistant cells

2.4 SME抑制順鉑耐藥細胞EGFR-Akt信號通路活性

為了深入探究SME 抑制耐藥株的分子機制，我們用Western blotting檢測了與細胞代謝、生長和增殖相關的信號通路的活性，包括p38、AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-Jun 氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、PI3K 等（數據未顯示）。結果發現，使用SME 處理后，磷酸化Akt（p-Akt）明顯降低。相一致的是，以0、5、10 和20 μmol/L SME 處理后，受Akt抑制的下游蛋白forkhead box protein O1（FoxO1）在A549 和A549/DDP 中明顯增加（圖4A）。為了進一步證實SME 對Akt 磷酸化水平的抑制作用，我們利用Akt 抑制劑deguelin 和SME 處理母本細胞和耐藥株；結果顯示，250 nmol deguelin 和20 μmol/L SME均可抑制p-Akt，同時上調FoxO1 蛋白。二者同時處理細胞后，對p-Akt 的抑制作用更加顯著，提示deguelin 和SME 對抑制p-Akt 有協同作用（圖4B）。進一步對Akt 與ABCG2 的調控關系進行探究，結果顯 示，250 nmol deguelin 和20 μmol/L SME 可 抑 制A549 和A549/DDP 中ABCG2 蛋白水平，并且二者對ABCG2 的抑制也有協同作用（圖4C）。這些結果提示Akt 是ABCG2 的上游調控信號，Akt 上調ABCG2的同時抑制FoxO1。SME 通過抑制Akt 信號而下調ABCG2，同時上調FoxO1。

為了進一步檢測SME 可能的抑制靶點，我們檢測了Akt 上游蛋白EGFR 的活性。我們用100 nmol EGF 處理細胞以激活EGFR，結果表明20 μmol/L SME 可降低EGF 激活的磷酸化EGFR（p-EGFR）蛋白水平（圖4D）。提示SME 可通過抑制EGFR 活性，進而抑制下游Akt-ABCG2信號通路。

圖4 SME抑制順鉑耐藥細胞EGFR-Akt信號通路活性Fig 4 SME inhibits the activity of EGFR-Akt pathway in cisplatin-resistant cells

2.5 SME 誘導順鉑耐藥細胞G0/G1 期阻滯和細胞凋亡

誘導腫瘤細胞周期阻滯和細胞凋亡是多種化療藥物的作用機制［18］。為了研究SME 對腫瘤細胞周期阻滯和細胞凋亡的影響，我們首先采用流式細胞儀檢測細 胞 周 期；如 圖5A 和5B 所 示，20 μmol/L SME 使A549 的G0/G1 期細胞比例從55.79%升至81.00%，而A549/DDP 的G0/G1 期 細 胞 比 例 從64.41% 升 至74.63%。表明SME 可誘導細胞G0/G1 期阻滯。進一步利用TUNEL 檢測細胞凋亡，結果顯示，以20 μmol/L SME 處理后，提示凋亡的綠色熒光信號明顯增多（圖5C、5D）。隨后我們利用Western blotting檢測凋亡蛋白，發現分別以0、5、10 和20 μmol/L SME 處理后，A549/DDP 中促凋亡蛋白Bax 增加而抗凋亡蛋白Bcl-xL 降低（圖5E），與TUNEL 結果相一致。該結果表明SME可誘導A549/DDP細胞凋亡。

圖5 SME誘導順鉑耐藥細胞G0/G1期阻滯和細胞凋亡Fig 5 SME induces G0/G1 arrest and apoptosis in cisplatin-resistant cells

綜上所述，SME 可通過抑制EGFR-Akt-ABCG2信號通路，抑制MDR基因ABCG2的表達，同時上調受Akt 抑制的下游蛋白FoxO1，誘導耐藥細胞G0/G1期阻滯和細胞凋亡，從而抑制A549/DDP 的增長（圖6）。

圖6 SME抑制EGFR-Akt-ABCG2信號通路模式圖Fig 6 A schematic diagram depicting a model of the inhibition of SME on the EGFR-Akt-ABCG2 pathway

3 討論

化療耐藥是長期困擾NSCLC 臨床治療的瓶頸問題?；熀蟮墨@得性化療耐藥是導致患者死亡的最主要的原因［19］。我們利用NSCLC 細胞株A549 誘導建立了順鉑耐藥株A549/DDP。通過檢測不同化療藥物的IC50，我們發現A549/DDP具有MDR特征。與前人報道的一旦肺癌細胞對順鉑產生耐藥就很難進行有效治療的現象一致［20］。

利用本實驗室分離得到的小分子化合物SME 處理細胞，我們發現SME 對A549 和A549/DDP 2 種細胞的IC50很接近，提示SME不僅對A549有抑制作用，同時也對其耐藥細胞A549/DDP 有抑制作用。細胞克隆形成實驗是觀察腫瘤細胞增殖的另一指標。與SME 抑制A549/DDP 細胞生長現象一致，我們發現SME可有效抑制A549/DDP的克隆形成。遷移能力是腫瘤細胞的惡性特征之一?；熀竽[瘤細胞發生EMT，遷移能力提高并發生轉移是導致預后不良的主要原因［21］。我們發現SME 可下調間質細胞標志物N-cadherin 和slug 的表達，同時上調上皮細胞標志物E-cadherin 的表達［22］。這些結果表明SME 逆轉A549/DDP的EMT，抑制A549/DDP的遷移能力。

在化療耐藥機制中最為重要的是ABC 蛋白家族的上調。ABC 蛋白作為細胞膜上的離子泵，可將化療藥物泵出癌細胞，從而導致耐藥［23］。我們通過對與MDR 密切相關的ABC 家族蛋白進行篩選，發現SME 可 抑 制ABCG2 蛋 白。多 項 研 究［24］表 明，ABCG2水平的升高會導致順鉑耐藥和患者預后不良。抑制肺癌干細胞中的ABCG2 水平可增強肺癌干細胞對順鉑的敏感性［25］。我們的研究發現ABCG2 在A549/DDP 細胞中表達增加，提示ABCG2 可能是A549/DDP 發生MDR 的機制。SME 不僅可明顯降低ABCG2 蛋白水平，也可降低ABCG2的mRNA 水平，提示SME 可能通過抑制ABCG2的轉錄調控而減少ABCG2的蛋白表達。

EGFR 作為腫瘤生長的激酶信號通路，其突變和過表達導致的異常激活與NSCLC 的發生有關。EGFR-Akt 信號通路可通過調控多種轉錄因子促進腫瘤細胞的增殖、抑制凋亡并增強細胞的侵襲和轉移能力［26］。EGFR-Akt 下游還可以抑制誘導細胞凋亡的FoxO1。因此PI3K/Akt/FoxO1通路的激活減少了細胞凋亡并刺激了細胞增殖并且最終導致癌癥［27］。有報道表明ABCG2 受PI3K/Akt 信號通路的調控［28］。與上述報道相一致，我們的結果表明，利用Akt的抑制劑deguelin處理細胞，deguelin和SME協同抑制p-Akt的同時也抑制了ABCG2，因此，我們推測Akt 是ABCG2 的上游。與deguelin 相似，SME 也可有效抑制A549/DDP 中p-Akt 和ABCG2 表達，并升高FoxO1蛋白水平，表明SME 可抑制Akt 信號通路。進一步研究表明SME 可降低EGF 激發的p-EGFR 蛋白水平。提示SME可通過抑制順鉑耐藥細胞中EGFR-Akt信號通路進而抑制下游ABCG2 蛋白表達，同時增加凋亡誘導蛋白FoxO1。

最后，我們通過腫瘤細胞周期阻滯和細胞凋亡的檢測證明了SME 的抗腫瘤活性。SME 不僅可誘導耐藥細胞發生G0/G1 期阻滯，TUNEL 實驗和凋亡蛋白的檢測均表明SME還可以誘導耐藥細胞的凋亡。

總之，我們的研究發現了能抑制順鉑耐藥的新化合物SME，并闡明其作用機制。即SME 通過抑制EGFR 活性，一方面抑制EGFR-Akt-ABCG2 信號通路，下調ABCG2 蛋白水平，抑制腫瘤細胞耐藥；另一方面激活FoxO1，誘導細胞G0/G1期阻滯和細胞凋亡；最終達到抑制NSCLC順鉑耐藥的目的。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻/Authors'Contributions

廖雅慧、劉麗云參與了實驗設計和實驗操作；廖雅慧、劉麗云、朱泓睿、林厚文參與了論文的寫作和修改；嚴繼舟、孫凡參與了課題設計和論文修改；所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed and conducted by LIAO Yahui and LIU Liyun.The manuscript was drafted and revised by LIAO Yahui，LIU Liyun，ZHU Hongrui and LIN Houwen. The project was designed and the manuscript was revised by YAN Jizhou and SUN Fan.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-11

·Accepted：2022-05-13

·Published online：2022-08-28

參·考·文·獻

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