不同月齡C57BL/6J小鼠耳蝸線粒體和NAD+水平比較

馮寶怡，董庭婷，鄭曉飛，陶 永，吳 皓

1.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200011；2.上海交通大學醫學院耳科學研究所，上海 200092；3.上海市耳鼻疾病轉化醫學重點實驗室，上海 200092；4.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院樣本庫，上海 200092

WHO 調查顯示，年齡相關性聽力下降在60 歲以上人群中發病率達42%，可造成嚴重的社會及經濟負擔［1］。年齡相關性聽力下降病因復雜，其危險因素包括耳蝸老化、環境因素、遺傳易感性、家族史和合并疾病等［2］。年齡相關性聽力下降可伴有耳蝸感覺毛細胞和螺旋神經節的丟失，以及血管紋萎縮等一系列聽覺系統的退行性病變。SCHUKNECHT 根據人類內耳病理分型將年齡相關性聽力下降分成4 型，分別是感音性、神經性、血管紋性及機械性年齡相關性聽力下降，但導致年齡相關性聽力下降的機制尚無定論。線粒體的受損、氧化還原失衡及線粒體DNA 的損傷導致耳蝸老化及感覺細胞的退行性病變很可能是年齡相關性聽力下降的原因［3］。已有研究［4］表明，線粒體在多個方面參與年齡相關性聽力下降的發生發展，包括線粒體DNA 突變、線粒體能量代謝異常及凋亡調節異常等。而煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）參與線粒體重要的能量代謝活動及多種細胞活動，在細胞衰老中也起到重要作用［5］。本研究擬通過觀察不同月齡C57BL/6J 小鼠耳蝸中的線粒體能量代謝中氧化磷酸化 相 關 基 因Ndufb5（NADH： ubiquinone oxidoreductase subunit B5） 、Sdha（succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A）、Sdhc（succinate dehydrogenase complex subunit C）和Atp5b（ATP synthase， H+transporting mitochondrial F1 complex，beta subunit）的表達水平及NAD+水平的變化，聽性腦干反應（auditory brain response，ABR）、畸變產物耳聲發射（distortion product otoacoustic emission，DPOAE）的聽閾改變，以及耳蝸線粒體超微結構受損的情況，探討耳蝸線粒體能量代謝對年齡相關性聽力下降發生發展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 不同月齡雄性C57BL/6J 小鼠購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司，生產許可證號為SCXK（滬）2017-0012，無噪聲暴露史。小鼠飼養及動物實驗操作在上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物飼養中心進行，實驗動物使用許可證號為SYXK（滬）2020-0025。

1.1.2 主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒（#74136，德國Qiagen），反轉錄試劑盒、SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（艾科瑞生物工程有限公司），NAD+/NADH 定量比色試劑盒（K337-100，美國BioVision）。 抗 小 清 蛋 白（parvalbumin） 抗 體（#P3088，美國Sigma）和抗熱休克蛋白60（HSP60）抗體（#12165，美國CST），二抗（Donkey antirabbit Alexa Fluor 488 和Donkey anti-mouse Alexa Fluor 594）及封片劑（美國Invitrogen），驢血清（美國Abbkine）。

TDT 聽覺誘發電位工作站（TDT System3 RZ6 workstation）、MF1揚聲器（美國Tucker-Davis Tech），共聚焦顯微鏡（DMi8，德國Leica），120 kV 透射電子顯微鏡（透射電鏡，美國賽默飛），多功能酶標儀（瑞士Tecan）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組與處理 將40 只C57BL/6J雄性小鼠按月齡分為4 個組：1 月齡組、4 月齡組、8 月齡組及12月齡組。通過ABR和DPOAE檢測小鼠聽力，實時熒光定量PCR 檢測小鼠線粒體功能相關基因的表達，透射電鏡下觀察小鼠耳蝸各類細胞的超微結構，比色試劑盒檢測不同組小鼠耳蝸的NAD+/NADH水平。

1.2.2 ABR 及DPOAE 的檢測 采用TDT System3 RZ6 workstation 對小鼠進行ABR 及DPOAE 檢測。通過賽拉嗪（20 mg/kg）和氯胺酮（100 mg/kg）混合腹腔注射對小鼠進行麻醉，并將小鼠放置到隔聲屏蔽室的恒溫直流加熱墊上維持體溫。以小鼠左耳為測試耳對小鼠進行ABR 檢測：將3 種電極插入小鼠皮下，包括小鼠頭頂正中（記錄電極）、耳乳突區（參考電極）和臀部背側（接地電極）。使用MF1 揚聲器進行給聲，揚聲器前端接有3 cm 軟管，將軟管另一端放置于小鼠外耳道口，對小鼠進行5.66～45.00 kHz 范圍內共7 個頻率的閉合場短純音（tone burst）刺激，聲音強度自90 dB SPL 開始，以5 dB SPL 為1 個間隔遞減；以能重復出現ABR 波形的最低刺激強度確定閾值。對小鼠進行DPOAE 檢測：同時給予小鼠2 個不同頻率（f1/f2=1.22）的聲音刺激，2 個聲音刺激強度相同，并在2f1-f2位置讀取DPOAE 振幅；檢測頻率取5.66～32.00 kHz 范圍內共6 個頻率，聲音強度自80 dB SPL 開始，以5 dB SPL 為1 個間隔遞減；以可檢測到振幅的最低刺激強度確定閾值。

1.2.3 實時熒光定量PCR 檢測 對小鼠進行頸椎脫臼處死，迅速取出雙側耳蝸，將部分耳蝸組織放入預冷的RNA 保護液中避免RNA 降解。在解剖顯微鏡下去除前庭后液氮速凍保存于-80 ℃。對耳蝸進行研磨后按照TRIzol 法提取RNA，測定濃度后反轉錄合成為cDNA。使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit 進行PCR 擴增，引物序列見表1，擴增程序為：95 ℃孵育5 min；隨后95 ℃10 s，60 ℃10 s，72 ℃10 s，共45 個循環。將每個靶基因的相對表達量以Rpl19（ribosomal protein L19）為內參基因進行標準化，并使用2-ΔΔCt方法計算出Ndufb5、Sdha、Sdhc和Atp5b的相對量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for real-time qPCR

1.2.4 樣品處理及免疫組織化學染色 將小鼠處死后取出的部分耳蝸放入4%多聚甲醛中，4 ℃固定過夜，隨后置于0.5 mol/L EDTA 中，4 ℃脫鈣12 h。在解剖顯微鏡下進行耳蝸鋪片，并將耳蝸基底膜分為頂、中、底圈3 個部分。鋪片組織在室溫下用含8%驢 血 清 和0.5%Triton X-100 的PBS （10 mmol/L，pH7.4）封閉1 h，然后一抗4 ℃孵育過夜。一抗抗體：抗小清蛋白抗體（1∶300）和抗HSP60抗體（1∶200）。次日使用0.1%Triton X-100 清洗3 次，每次5 min；接著二抗室溫孵育1 h。一抗和二抗均以8%驢血清和0.5%Triton X-100 稀釋。PBS 洗3 遍后，封片、晾干，于共聚焦顯微鏡鏡下觀察。

1.2.5 透射電鏡樣品制備及觀察 將部分小鼠耳蝸置于冰上，用4%多聚甲醛和0.5%戊二醛混合固定液進行耳蝸灌注，然后置于2.5%戊二醛中4 ℃固定過夜。隨后將耳蝸置于0.5 mol/L EDTA 中，4 ℃脫鈣5 h；1%四氧化鋨室溫固定2 h。0.1 mol/L PB 緩沖液洗滌后依次在乙醇和丙酮中進行梯度脫水，然后將樣品包埋在Epon 812 樹脂中，65 ℃聚合48 h。將耳蝸在螺旋器水平切成薄片，切片樣品用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，用120 kV透射電鏡觀察。

1.2.6 小鼠耳蝸NAD+水平檢測 使用NAD+/NADH定量比色試劑盒檢測耳蝸組織中的NAD+水平。一個樣品需要2 個耳蝸，每個年齡組檢測4 個樣品，即8 個耳蝸。將耳蝸取出后，置于400 μL NAD+/NADH提取緩沖液中進行勻漿，16 000×g離心5 min。提取上清液并分成3 份，分別用于測量NADt（NAD+和NADH 的總和）、NADH 和蛋白質含量。NADH 的測定需要先置于60 ℃條件下30 min，將NAD+分解完全后進行。檢測NADt和NADH 的樣品上清液與反應液混合后，使用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度值［D（450 nm）］；蛋白質濃度通過BCA 法檢測。標準化的NAD+水平通過以下公式計算：（NADt-NADH）/蛋白質。

1.3 統計學方法

使用GraphPad Prism 9.0 程序進行數據統計分析，定量資料用表示，組間比較采用兩樣本t檢驗、單因素方差分析或兩因素方差分析。所有實驗至少重復3次。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C57BL/6J小鼠聽覺功能隨月齡增長下降

通過TDT 系統分別檢測了1、4、8、12 月齡4 個年齡組（每組5 只） C57BL/6J 小鼠的ABR 和DPOAE 閾值，結果提示小鼠聽覺功能隨年齡增長而下降，特別是高頻聽力（圖1）。相較于1 月齡小鼠，C57BL/6J 小鼠自4 月齡起ABR 閾值在16.00～45.00 kHz 范圍內出現顯著升高（均P＜0.05），在8 月齡ABR 閾值顯著升高的頻率范圍擴展到8.00～45.00 kHz（均P＜0.01），12 月齡時全頻聽力下降，ABR 閾值顯著升高（均P＜0.01）。同樣，8 月齡和12 月齡C57BL/6J 小鼠的DPOAE 閾值在11.32～32.00 kHz 顯著升高（均P＜0.01）。

圖1 不同月齡C57BL/6J小鼠聽力比較(n=5)Fig 1 Comparison of auditory function in C57BL/6J mice at different ages(n=5)

2.2 C57BL/6J 小鼠耳蝸中線粒體功能隨月齡增長逐漸下降

4 組小鼠耳蝸內線粒體能量代謝中氧化磷酸化相關基因Ndufb5、Sdha、Sdhc和Atp5b的表達水平見圖2A。以1 月齡C57BL/6J 小鼠作為對照組，分別與4、8、12 月齡組的小鼠mRNA 相對表達量進行比較。結果表明，與1月齡小鼠相比，4、8、12月齡小鼠耳蝸中Ndufb5、Sdha、Sdhc和Atp5b這4 個基因的表達水平呈現隨年齡下降的趨勢，并從8 月齡開始差異有統計學意義（均P＜0.05）。為進一步觀察耳蝸毛細胞中的線粒體狀態，對1月齡和12月齡小鼠的耳蝸毛細胞及線粒體進行染色和觀察，HSP60抗體用于標記線粒體，小清蛋白抗體用于標記毛細胞，結果發現在12月齡小鼠耳蝸中，毛細胞中HSP60 表達數量減少，說明內毛細胞中線粒體數量較1 月齡明顯減少（圖2B）。

圖2 不同月齡C57BL/6J小鼠耳蝸線粒體功能相關基因和蛋白表達水平的比較Fig 2 Comparison of expression levels of mitochondrial function-related genes and proteins in the cochleae of C57BL/6J mice at different ages

2.3 C57BL/6J衰老小鼠耳蝸中線粒體結構受損

透射電鏡比較1 月齡和12 月齡小鼠耳蝸中內毛細胞、外毛細胞、螺旋神經節細胞及神經纖維中的線粒體超微結構?？梢娕c1 月齡小鼠相比，12 月齡C57BL/6J 小鼠外毛細胞中的線粒體結構正常（圖3），而在內毛細胞、螺旋神經節細胞及神經纖維中線粒體出現空泡樣變性（圖3），螺旋神經節細胞中線粒體體積變大，同時在胞質中可觀察到較大的脂褐素形成。

圖3 1月齡和12月齡C57BL/6J小鼠耳蝸中不同細胞的線粒體超微結構對比Fig 3 Comparison of mitochondrial ultrastructure in different cells in the cochleae of mice aged 1 month and 12 months

2.4 C57BL/6J 小鼠耳蝸NAD+水平隨月齡增長逐漸下降

4 組小鼠耳蝸NAD+水平見圖4。結果表明，與1月齡小鼠相比，4、8、12 月齡小鼠耳蝸NAD+水平呈現隨月齡增長而下降的趨勢，并自8 月齡開始與1 月齡NAD+水平相比差異有統計學意義（均P＜0.01）。

圖4 不同月齡C57BL/6J小鼠耳蝸NAD+水平比較Fig 4 Comparison of NAD+ levels in the cochleae of mice at different ages

3 討論

年齡相關性聽力下降的發生發展主要是由于內耳的不可逆改變。通過年齡相關性聽力下降小鼠和人類的耳蝸組織病理研究，均發現隨年齡增長的聽覺感覺上皮細胞的丟失［6］。由于攜帶Cdh23（cadherin related 23）突變，C57BL/6J小鼠在3～6月齡開始出現高頻聽力損失，較其他野生近交系更早；在15月齡時表現為嚴重的全頻聽力損傷，伴隨著內毛細胞、外毛細胞和螺旋神經節細胞的丟失，而這種丟失在高頻和低頻區域更為嚴重［7-8］。因此，C57BL/6J小鼠是研究年齡相關性聽力下降的合適模型。而本研究也證明，相較于1月齡小鼠的ABR和DPOAE閾值，8月齡和12月齡小鼠出現了明顯的聽力閾移，說明小鼠聽覺功能隨月齡增長而下降。

年齡相關性聽力下降與線粒體功能障礙密切相關。線粒體是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要來源及儲存場所，線粒體膜電位異?；蚰な軗p可導致ROS釋放到細胞質中，激活下游一系列細胞通路，如促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）等，還可導致促炎因子的產生和釋放，對內耳結構造成損傷［9-10］。同時，線粒體本身也受到ROS誘導氧化應激的影響，出現線粒體DNA、線粒體呼吸鏈復合物蛋白、線粒體膜等的損傷，線粒體能量代謝功能受損［11］。促凋亡調節因子BAX、BCL-2等均位于線粒體膜上，線粒體的損傷還可導致細胞色素C的釋放，誘導細胞凋亡［12］。已有研究［13］證明，在Idh2（isocitrate dehydrogenase 2）敲除小鼠中觀察到早發的年齡相關性聽力下降，伴隨感覺上皮細胞的氧化損傷乃至嚴重丟失。這些損傷還會隨著時間推移而堆積，導致一系列年齡相關性細胞損傷。線粒體氧化磷酸化功能相關基因Ndufb5、Sdha、Sdhc和Atp5b，是呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ的組成亞基，可反映線粒體氧化磷酸化的功能［14-15］。本研究發現在C57BL/6J小鼠耳蝸中Ndufb5、Sdha、Sdhc和Atp5b的mRNA表達水平，隨月齡增長而逐漸下降，提示耳蝸線粒體功能逐漸下降。老年小鼠的毛細胞會隨年齡增長而丟失，我們也對耳蝸毛細胞及其線粒體進行染色觀察，發現12月齡小鼠耳蝸毛細胞中線粒體數量明顯減少，提示這可能影響耳蝸毛細胞功能。而透射電鏡觀察也發現在12月齡小鼠的內毛細胞、神經纖維和螺旋神經節細胞中觀察到線粒體的空泡樣變性，并且出現較大的脂褐素。線粒體大多數呼吸復合物嵌合在線粒體嵴中，線粒體嵴是線粒體進行能量代謝的重要場所。電鏡下線粒體結構出現異常，線粒體嵴的丟失、變寬均反映了老年小鼠線粒體功能的受損［16］。同時線粒體功能的異常及隨年齡增長發生的自噬功能異常也會誘發脂褐素的形成，說明隨年齡增長，出現線粒體損傷和功能障礙，并進一步導致小鼠聽覺功能異常。

NAD+是細胞中氧化還原酶的氫載體和細胞信號分子，參與了包括線粒體功能和代謝、氧化還原反應、DNA修復等細胞活動，并可作為底物調控細胞信號轉導。NAD+水平在多個器官中被發現會隨著年齡的增長而下降，包括心臟、中樞神經、肝臟等［17］，這主要是由于NAD+合成和消耗相關的酶和蛋白的功能隨年齡發生變化。NAD+影響著從能量代謝到細胞存活的數百個關鍵生物學功能，衰老和疾病狀態下NAD+水平的下降可影響機體代謝和穩態，參與衰老相關疾病的發生發展，如動脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥、神經退行性變性疾病等［5］。有報道［18］指出，在老年或疾病動物體內恢復NAD+水平可以恢復動物健康并且延長動物壽命。NAD+補充治療已經被證明可以保護阿爾茨海默病小鼠模型中的神經元損傷，改善認知功能，可改善心力衰竭小鼠的心肌功能以及預防脂肪肝等疾?。?9-21］。除此以外，通過多種手段實現小鼠體內NAD+水平的提高在聽覺領域也多有應用，并證明對噪聲性、老年性及順鉑引起的聽力損失均有一定的保護作用［22-24］。本研究檢測了不同月齡C57BL/6J小鼠耳蝸中的NAD+水平，結果提示NAD+水平隨月齡增長而逐漸下降。這也為使用NAD+補充劑增強線粒體功能、保護小鼠年齡相關性聽力下降的可行性提供了理論依據。

本研究通過比較不同月齡小鼠聽覺功能、耳蝸中線粒體功能和形態及NAD+水平，發現小鼠外周聽覺關鍵細胞線粒體功能和結構隨月齡增長而改變，耳蝸NAD+水平隨月齡增加而下降，與年齡相關性聽力下降一致；提示線粒體功能障礙、NAD+減少可能是小鼠年齡相關性聽力下降的原因，推測補充NAD+增強線粒體功能可能有助于改善小鼠年齡相關性聽力下降。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有動物實驗均已通過上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物倫理委員會的審核批準（批件號SH9H-2020-A102-1）。所有實驗過程均遵照《實驗動物飼養管理和使用指南》及《上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物中心管理手冊》進行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Ethics Committee of Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine（Approval Letter SH9H-2020-A102-1）. And all experimental animal protocols were carried out by followingGuide for the Care and Use of Laboratory AnimalsandManual for Laboratory Animals Management of Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.

作者貢獻/Authors'Contributions

吳皓參與了課題指導；陶永、董庭婷、馮寶怡參與了實驗設計；馮寶怡、董庭婷、鄭曉飛參與了實驗操作；馮寶怡參與了數據整理、論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was instructed by WU Hao，designed by TAO Yong，DONG Tingting and FENG Baoyi and conducted by FENG Baoyi，DONG Tingting and ZHENG Xiaofei.The manuscript was drafted and revised by FENG Baoyi. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-27

·Accepted：2022-06-05

·Published online：2022-08-12

參·考·文·獻

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