流式微球捕獲蛋白定量檢測技術的原理與應用

徐曉雪 戶乃麗 鄒林樾 趙君朋

在液態生物樣品，如血清、培養物上清、細胞裂解液中溶解有大量具有廣泛生物學活性的蛋白質，在細胞或機體的生理活動和病理進程中發揮重要的作用，它們的濃度變化可以反映機體的免疫狀態，評價實驗和治療的效果，預示疾病的轉歸，具有重要的科研和臨床意義[1]。目前廣泛采用的蛋白定量檢測技術是酶聯免疫吸附技術（enzymelinked immunosorbent assays，ELISA），通常需要準備大量的生物樣品，1 次實驗只能檢測1 種目的蛋白，對樣品中多種蛋白的檢測需要成倍樣品重復多次實驗才能完成。傳統的流式細胞術也可以檢測細胞分泌的蛋白因子，但是由于流式檢測信號必須由實體顆粒觸發記錄，因此檢測局限于細胞及細胞附屬物分析，無法直接檢測懸液中溶解的成分，對細胞分泌蛋白的流式檢測一般需要經過體外刺激培養細胞、阻滯細胞蛋白分泌、細胞表面染色、固定通透、胞內染色多步反應，樣品處理復雜，干擾因素多，結果穩定性較差，無法定量。21 世紀初出現了專用于蛋白捕獲的微球，通常為直徑4～7.5 μm的聚苯乙烯微球，不同廠商有所區別，微球表面經過化學處理共價結合有特異性蛋白捕獲抗體，可與目的蛋白形成免疫結合，捕獲目的蛋白的微球如同一個表達特異蛋白的細胞，觸發流式信號采集，通過流式熒光定量檢測實現對溶解蛋白的定量檢測，這就是流式微球捕獲蛋白定量技術，它以微球代替細胞實現懸液中溶解蛋白的捕獲檢測[2]，增加流式定量檢測可溶性蛋白的新應用。與傳統蛋白檢測技術相比，這一技術結合流式技術的優點，速度快、定量準確、高通量、可同時分析微球的多個參數，可以實現溶解蛋白的快速、準確、多重定量，在SARS、白血病等研究領域被多次使用，為疾病的研究和治療提供新的工具[3]。本文主要介紹流式微球捕獲蛋白定量檢測的技術原理、特點、應用與局限性，幫助讀者更好地理解和應用這一新技術。

1 檢測原理

流式微球捕獲蛋白定量技術也被稱為懸浮點陣技術或液態芯片技術，是基于流式檢測平臺的液相、高通量、多重蛋白定量技術，是一項快速多重細胞因子定量檢測技術。其技術原理是利用懸液中的微球表面固化樣品中溶解的蛋白質，用各種帶有差異固有熒光的微球分別包被特異性蛋白捕獲抗體，使用時混合多種特異性捕獲微球，制成微球懸液，形成液態捕獲微球陣列，通過與待測樣品溶液中的被測蛋白形成特異性抗原-抗體結合物，再與熒光檢測抗體形成“三明治”夾心復合物。反應后的懸液樣品經過流式細胞儀檢測，識別不同捕獲微球的固有熒光信號差異，在流式散點圖上形成有序微球陣列，每種編碼熒光微球對應一種目的蛋白，同時檢測每種微球上結合的檢測抗體熒光強度，由于檢測抗體的熒光強度與待測蛋白的濃度正相關，使用待測目的蛋白的標準品，經過倍比稀釋制備濃度已知的系列標準樣品，檢測1 組標準樣品測得的熒光強度繪制標準曲線，將待測樣品中測得的不同目的蛋白捕獲微球的檢測熒光強度代入各自的標準品曲線方程，可計算出反應樣品中各種蛋白的濃度。因技術原理與固相中的酶聯免疫吸附實驗相似，因此也被稱為懸液中的ELISA[1-2]。

2 技術特點及優勢

流式微球捕獲蛋白定量檢測技術由4 個要素組成：微球、檢測抗體試劑、流式檢測儀器和數據分析軟件。專用于蛋白捕獲的微球是這一技術的關鍵，通常為直徑4 ～7.5 μm 的聚苯乙烯微球，利用2 種或3 種光譜差異大的熒光染料按精確配比混合，分別染色微球，使其具有可精確區分的固有熒光，每種微球都共價偶聯一種特異性捕獲抗體，當不同微球混合在一起，可以在同一個反應體系中同時檢測多種溶解蛋白。檢測抗體偶聯有熒光報告基團，通常為藻紅蛋白，與被微球捕獲的蛋白特異性反應，形成定量熒光信號，熒光強度與捕獲蛋白的量正相關。微球的精確區分和蛋白的定量檢測依賴流式檢測技術，多數雙激光、三激光流式細胞儀都可完成，也有專用檢測儀器如Luminex 200、MAGPIX 等，原理與流式檢測一致，微球編碼熒光通常由紅激光激發檢測，檢測抗體熒光通常由藍色或黃綠色激光激發檢測。檢測數據的分析通常使用與試劑配套的專用軟件，常見的通用流式數據分析軟件，如Flowjo、Kaluza 等，也整合了用于分析微球捕獲蛋白定量檢測數據的分析模塊。微球捕獲蛋白檢測具有和流式細胞檢測類似的特點，樣品制備反應在懸液中進行，抗原抗體混合均勻，接觸充分，免疫結合特異性好，反應速度快；又由于完全采用熒光標識系統，信號存在光敏感性，全程需要避光；流式檢測是對群體中大量顆粒的多重熒光定量，具有準確、快速、高通量、多參數的特點，1 次實驗可以批量完成上百例樣品的檢測，檢測樣品體積低至25 ～50 μL，可同時檢測1 個樣品中的數十種蛋白。流式微球捕獲蛋白定量檢測具有和ELISA檢測類似的特點，每個微球表面相當于ELISA 檢測中的1 個微孔，具有固定的反應面積，結合有限量的反應物，因此檢測樣品濃度有上限，對于較濃的樣品需要稀釋檢測；由于微球本身熒光本底與非特異性反應造成的本底在特異性熒光信號的識別中存在識別下限，檢測下限通常為5 ～10 pg/mL，通常認為其檢測靈敏度與ELISA 相當，高靈敏度的捕獲微球則更為靈敏。由于流式檢測微球數量巨大，遠遠超出ELISA 檢測中的1 個微孔，數據是成百上千個微球的平均值，因此數據更穩定，具有結果穩定、可重復性好的特點[2]。見（圖1）。

與ELISA 技術比較：流式微球捕獲蛋白定量檢測與經典的ELISA 檢測比較有較為明顯的優勢[1-2]， 所需樣本體積僅為常規ELISA 分析所必需樣本量的1/6；完成1 次檢測通常需要2 h，較ELISA 分析所需的4 ～5 h 縮短一半；反應中微球分散懸浮沒有酶和底物背景的干擾；檢測靈敏度通常為5 ～10 pg/mL，較ELISA 檢測的通常靈敏度20 ～100 pg/mL 有所提高；可同時完成多種蛋白定量，常見的試劑盒一次可以完成6 個、7 個、13 個、24 個、36 個因子的檢測，并且可根據實驗需要自行組合被檢測蛋白，數目可不固定；檢測動態范圍一般為500 倍濃度，大大超過ELISA 檢測60 倍濃度的動態范圍，可以減少對樣品的稀釋，更適合多種不同濃度、不同反應特征的待測物的同時分析；1 個樣品1 次實驗可獲得多次ELISA 檢測的結果，節省大量時間，費用也相應降低；對于有感染風險的樣品，由于檢測樣品總量的下降，反應步驟的簡化，檢測時間的大幅縮短，可以大幅減少感染性飛沫和氣溶膠的產生，生物安全性更高；分析微球數量巨大，結果穩定性高、可重復性更好。

與流式原位蛋白檢測技術比較：目前應用流式檢測平臺可以進行細胞內蛋白檢測和流式微球捕獲蛋白定量檢測，胞內蛋白檢測樣品細胞通常需要經過培養刺激蛋白分泌、表面標記、固定破膜、胞內標記與洗滌等多步，可以識別分泌蛋白的特異細胞群體，由于操作復雜，所需細胞數量巨大，操作時間長，干擾因素較多，且無法定量，主要應用于對特定細胞群體的功能狀態分析，可重復性較差，臨床較少使用；后者主要用于溶液樣品中蛋白含量的檢測，一般無法識別分泌蛋白的細胞來源，對于位于細胞內的蛋白成分需要制備細胞裂解液進行檢測，但是所需樣品量小，檢測快速，檢測通量大，同時檢測多種蛋白，定量準確，靈敏度高，可重復性好，更適用于相對均一體系的蛋白檢測和總體蛋白水平的監測，適用于科研和臨床，這兩種方法可根據檢測目的選擇或配合使用。

3 主要應用

流式微球捕獲蛋白定量技術因其樣品量小、靈敏度高、快速、可重復性好的優點，正逐漸成為基礎研究與臨床廣泛應用的多重蛋白定量技術。應用此項技術已有多種商品化檢測試劑產品，包括主要應用于通用流式儀器的BD CBA、AimPlex、Bender FlowCytomix 等檢測產品，應用于Luminex 平臺的Luminex、ProcartaPlex、Milliplex 等檢測產品，應用于iQue Screener 平臺的QBeads PlexScreen 檢測產品等。理論上所有的熒光捕獲微球檢測都可以采用通用流式儀器和分析軟件完成，但是根據儀器型號和性能不同，檢測技術略有差異，不同公司的產品所覆蓋的檢測目的因子也有不同。目前可檢測蛋白包括人、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬和豬的可溶性細胞因子及多種可溶性蛋白靶標[4]。在科研中常用來對培養物上清、細胞裂解液、動物血清、體液、組織灌洗液樣品中的免疫蛋白、炎癥因子、趨化因子、生長因子細胞信號傳導中磷酸化蛋白、凋亡相關蛋白等蛋白靶標進行定量檢測[5]。主要應用于感染疾病研究、腫瘤研究、干細胞研究、免疫學研究、疫苗研究、藥物研發等領域。利用其微量高靈敏度的特點可以用來檢測實驗動物眼部房水樣品中多種蛋白和牙髓腔內液體中多種炎癥因子的含量，其快速高通量多重檢測的特性適用于大規模的高通量藥物篩選。在臨床上，這種技術可用于患者機體炎癥狀態、免疫狀態監測，識別炎癥因子風暴的發生發展，監測自身免疫病患者病情，監測移植后患者免疫狀態，監測腫瘤生物治療后免疫狀態、癌癥篩查，在各種感染、非感染炎癥、自身免疫病、過敏性疾病、內分泌與代謝性疾病以及腫瘤科、血液科、婦產科、兒科、精神科等臨床研究中都有應用價值，特別是在兒科危重病患兒的診斷和治療、急性公共傳染性疾病的研究和臨床診治中具有特殊意義[6-9]。

4 技術局限性

與ELISA 技術類似，檢測溶解的蛋白因子濃度，無法獲得蛋白的來源細胞信息，得到的總濃度無法反映總體中各種細胞的反應差別；對多重蛋白同時檢測，在被測蛋白濃度差異巨大時，可能需要以不同的稀釋倍數重復檢測；因為反應體系中同時存在多種反應成分，無法完全避免成分間相互作用的發生，對于特殊情況的了解還需要長時間大樣本量數據的積累[10]。多重蛋白檢測時微球的編碼依賴差異熒光的識別，如果不同目的蛋白的微球編碼熒光相近或重合，可能造成誤讀，個別試劑盒出現過相鄰編碼蛋白無法區分的情況；由于檢測試劑盒品牌不同、采樣儀器靈敏度差異可能帶來檢測結果的差異，跨平臺的數據無法直接比較；實驗操作上的差異，如樣本凍融次數、反應溫度時間、抗凝劑的種類、內毒素污染、稀釋液的配方、標準曲線的配置不同批次的血清等，都可能帶來檢測的誤差，不同批次的檢測由于實驗條件的不完全齊同所得數據的可比性下降；作為一項新興技術微球捕獲蛋白定量檢測的商品化試劑盒還在不斷發展中，產品覆蓋的目的蛋白數量較為局限，對于較不常用的檢測蛋白可能需要用戶自行包被捕獲微球用于檢測。

5 總結

流式微球捕獲蛋白定量檢測技術的出現打破了流式細胞儀只能檢測細胞內或細胞表面附屬標記的局限，利用微球表面捕獲實現各種可溶性蛋白因子的定量檢測，具有流式技術的準確、快速、定量、高通量的優點，可同時完成多種因子的定量檢測，節省樣品、時間和費用，溶液中抗原抗體反應更充分，實驗微球數量巨大，結果是大量微球反應的平均值，測定結果穩定性高，可重復性好，生物安全風險小，尤其適合分析臨床微量樣品中多種蛋白的含量，使用中應注意其技術局限性。