模擬高原低氧環境下運動疲勞大鼠腦皮層單羧酸轉運蛋白的變化及其意義

高 晨,凡春玲,李玉榮,裴文娟,關彩萍

(聯勤保障部隊第九四〇醫院全科醫學科,蘭州 730050)

運動性疲勞是指運動引起的肌肉最大收縮或最大輸出功率暫時性下降的生理現象，機體生理過程不能維持其機能在特定水平上進行和（或）不能維持預定的運動強度。它是運動本身引起機體工作能力暫時降低，經過適當時間的休息和調整可以恢復正常的生理現象，是一個極其復雜的身體綜合反應過程［1-3］。疲勞的發生是外周肌肉和中樞神經共同作用的結果。后者是由運動引起的中樞神經系統不能產生和維持足夠的沖動到運動所需的肌肉而引起［4］，其機制是腦能量代謝失衡，即與運動缺氧致腦電活動減弱，反饋性抑制中樞神經系統和脊髓前角α運動神經元活動有關［5-7］。

劇烈運動及低氧環境下，機體通過糖原等碳水化合物的無氧糖酵解來維持能量代謝的平衡，乳酸是這一過程的代謝產物。急進高原后機體運動能力迅速下降，與高原低氧環境下機體乳酸堆積加速導致體內pH值變化有關［8］。由此引起的一系列病理反應損傷神經元［9-10］。但長期高原生活出現高原習服現象，抗疲勞能力等機體生理功能在一定程度上有所恢復。近年來，相關研究已證明乳酸在特定情況可作為能量代謝的來源［11］?！爸袠腥樗岽┧蟆奔僬f（astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis）［12-14］表明極量運動或缺氧狀態下，膠質細胞無氧代謝所產生的乳酸被神經元攝取作為能量底物為其供能，且乳酸優先于葡萄糖被神經元利用氧化供能。據此推測，高原習服的產生與機體乳酸代謝及利用有關。機體乳酸代謝轉運的載體是廣泛分布于組織細胞膜上的具有14種亞型的單羧酸轉運蛋白（monocarboxylate transporters，MCTs）［15］。中樞乳酸穿梭主要依靠神經元表達的MCT2和星形膠質細胞表達的MCT4形成的閉合環路實現［16］。本研究通過模擬高原低氧環境下大鼠乳酸代謝的干預，記錄其運動能力變化。進一步測定鼠腦皮層MCT2和MCT4的表達，缺氧神經元損傷情況以及腦組織乳酸含量，探討高原低氧環境運動疲勞與腦乳酸代謝轉運之間的相關性，為運動疲勞的醫學干預奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

8周齡清潔級雄性SD大鼠63只，體質量（280±10）g，由聯勤保障部隊第九四〇醫院動物實驗科提供［SCXK（軍）2017-0023］，分籠飼養于屏障設施內［SYXK（軍）2017-0047］。正常飲水、飲食。環境溫度維持在18～24℃，相對濕度40%～60%。大鼠隨機分為7組，每組9只：對照組在常壓常氧環境下正常飼養，不建立運動疲勞模型；常規運動組在常壓常氧環境下正常飼養2周后建立運動疲勞模型；急進高原組在常壓常氧環境下飼養2周后迅速轉至模擬低壓低氧環境后建立運動疲勞模型；高原習服3 d組在常壓常氧環境下飼養11 d后轉至模擬低壓低氧環境，再飼養3 d后建立運動疲勞模型；高原習服1周組先后在常壓常氧環境和模擬低壓低氧環境下各飼養1周后建立運動疲勞模型；高原習服2周組在模擬低壓低氧環境飼養2周后建立運動疲勞模型；高原抑制劑組在模擬低壓低氧環境飼養2周，給予乳酸轉運抑制劑后再建立運動疲勞模型。動物實驗經聯勤保障部隊第九四〇醫院倫理委員會書面同意（編號2020KYLL032）。

1.2 實驗設備及試劑

FLYDWC50-ⅡA型低壓低氧動物實驗艙（中航工業貴州風雷航空軍械有限責任公司）。ZH-PT型動物跑臺（安徽淮北正華生物儀器設備有限公司）。SpectraMax i3全自動熒光酶標儀（美國Molecular Devices公司），EG1150H自動包埋機（德國Leica有限公司），AX80熒光顯微鏡（日本奧林巴斯），ASP-200S自動脫水機，M398419自動切片機。

MCT4抗體（貨號：PAB21410）購自中國臺灣Abnova公司，MCT2抗體（貨號：sc-50323）購自美國Santa Cruz公司。二甲基聯苯胺（3，3-diamino-benzidine，DAB）顯色試劑盒（貨號：AR1002）購自武漢博士德生物工程有限公司。尼氏染色試劑盒（亞甲藍法，貨號：UFJ01207）購自上海君瑞生物技術有限公司。比色法乳酸檢測試劑盒（貨號：A019-2）購自南京建成生物工程研究所，α-氰基-4-羥基肉桂酸乙酯（α-cyano-4-hydroxycinnamate，4-CIN）購自美國Sigma公司。

1.3 模擬高原低壓低氧環境

低壓低氧動物實驗艙模擬海拔5 000 m低壓低氧環境。具體參數如下：壓力0.054 MPa，氧分壓11.3 kPa，上升速度10 m/s，溫度12℃（每日8:00～20:00）及2℃（每日20:00～次日8:00），相對濕度30%～40%。

1.4 建立運動疲勞模型及抑制劑注射

除對照組以外，其余各組大鼠均在建立運動疲勞模型前在動物跑臺上進行為期3 d的適應性訓練（速度為15 m/min，時間為5 min/d，坡度0°）。之后采用Bedford等的［17］遞增負荷運動方案建立運動疲勞模型，速度及持續時間方案：8.2 m/min×15 min+15 m/min×15 min+20 m/min持續，直至力竭。力竭標準：大鼠跑步姿態由蹬地式變為伏地式，滯留跑道后1/3處達3次以上，各種刺激驅趕無效，停跑后表現為呼吸急促、神情倦怠、反應遲鈍［18］。抑制劑運動組在建立運動疲勞模型前1 h，按90 mg/kg劑量為每只大鼠腹腔注射乳酸轉運抑制劑4-CIN［19］。分別記錄各組大鼠負荷運動達到力竭狀態的運動時間，取平均值。

1.5 免疫印跡檢測[20]

疲勞模型建立后，各組分別取3只大鼠在異氟烷麻醉下斷頭處死。取運動區皮層組織勻漿后裂解，提取總蛋白，BCA法測定濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）每孔上樣蛋白總量為20 μg，時間120 min。350 mA恒流帶電轉膜（120 min），5%牛血清白蛋白室溫振蕩封閉1 h，5%脫脂奶粉稀釋后分別加入一抗MCT2抗體（1:1 000）和MCT4抗體（1:500），以α-tubulin抗體（1:1 000）作為內參，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1:5 000），在室溫下振蕩孵育2 h。滴加發光檢測液，在凝膠成像系統中攝影。應用Image J軟件進行灰度量化分析，重復3次實驗取平均值。

1.6 鼠腦切片制備

各組再取3只大鼠在異氟烷麻醉下經心臟灌流處死，斷頭取腦。質量分數4%多聚甲醛溶液固定24 h，蔗糖PB溶液階梯脫水48 h。包埋后連續冠狀位冰凍切片，切片厚度分別為6 μm。切片置于60%甘油磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中，-20℃冷凍保存待用。

1.7 免疫組織化學檢測（DAB染色法）[21]

鼠腦切片用1%牛血清蛋白（BSA）+0.3% Triton X-100在室溫下封阻非特異性結合并破膜1 h。PBS清洗。加入1:500的MCT2或1:200的MCT4一抗稀釋液，4℃緩慢振蕩器孵育過夜。PBS清洗。滴加以生物素標記的二抗（試劑A），在室溫下，60 r/min振蕩器上，孵育10 min。PBS清洗。滴加鏈霉素菌抗生素-過氧化物酶復合物（試劑B），室溫下，60 r/min振蕩器上，孵育10 min。PBS清洗。鼠腦切片轉移至載玻片上，滴加新鮮配制的DAB顯色液（20倍緩沖液50 μL+20倍底物H2O250 μL+20倍DAB色源50 μL+去離子水850 μL），避光顯色，以抗體稀釋液取代一抗做空白對照。顯色后脫水，中性樹膠封片，顯微鏡明場下觀察拍照。

1.8 神經元尼氏染色及病理學評價[22-23]

鼠腦切片常溫下復溫，晾干。0.01 mol/L PBS漂洗3次，將切片置于60℃水浴中的5%尼氏染液中5～10 min，蒸餾水沖洗。70%乙醇溶液中浸泡2 min，置于95%乙醇溶液中分色，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，明場鏡下觀察并拍照。

選擇對缺氧損傷較為敏感的鼠腦皮層切片圖像，通過組織學分級（histological grade，HG）和平均神經元密度（neuronal density，ND）值進行鼠腦遲發性神經元死亡的病理學評價。HG分為4個等級［24］：0級，無神經元死亡；Ⅰ級，散在單個神經元死亡；Ⅱ級，大量神經元死亡；Ⅲ級，神經元幾乎全部死亡。ND值計量方法如下：隨機選取運動區皮層6個高倍視野（high power field，HPF，×400），計數250 μm直線上正常存活（細胞膜、細胞核完整，核仁清晰可辨）的錐體神經元數量，取平均值。

1.9 腦組織乳酸含量測定

各組剩余3只大鼠在異氟烷麻醉下斷頭處死。取腦組織標本準確稱取重量，按照重量（g）∶體積（mL）=1∶9加入0.9%NaCl溶液（即生理鹽水）后在玻璃勻漿器中勻漿，制成10%腦組織勻漿。3 500 r/min，4℃離心10 min，取上清液裝入EP管，采用比色法檢測腦組織乳酸含量［25］。嚴格依照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書執行操作。

1.10 統計學方法

本研究數據資料采用SPSS 13.0統計軟件包進行分析。計量資料采用平均數±標準差（-x±s）表示。不同組樣本均數間比較采用單因素方差分析。根據各組總體方差齊同與否，選擇Bonferroni法或Tamhane’s T2法修正結果，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠力竭運動時間變化情況

各組大鼠平均運動力竭時間如表1所示。與常規運動組比較，急進高原組、高原習服3 d、1周組及高原抑制劑組運動能力均明顯下降（P＜0.05）。高原習服2周組大鼠運動能力明顯恢復，與急進高原組和高原抑制劑組比較均有明顯統計學差異（P＜0.05），與常規運動組比較則差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組運動疲勞模型大鼠平均力竭時間Table1 Average time-to-exhaustion in rats under exercise-induced fatigue conditions（-x±s,n=9）

2.2 大鼠腦運動皮層MCT2及MCT4表達變化

免疫印跡法檢測各組大鼠運動皮層MCT2和MCT4表達變化情況如圖1所示。對照組大鼠運動皮層MCT2及MCT4均少量正常表達。與對照組比較，常規運動組、急進高原組二者表達變化均無統計學意義（P＞0.05）。高原習服后，二者表達水平逐漸升高。其中高原習服1周組，高原習服2周組及高原抑制劑組MCT2表達分別較對照組明顯升高約81.5%、120.6%和164.4%，差異均有統計學意義（P＜0.05）。MCT4表達升高較MCT2更早。高原習服3 d組、1周組、2周組及高原抑制劑組MCT4表達分別較對照組明顯升高約144.3%、176.1%、174.6%和168.8%，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 免疫印跡檢測各組運動疲勞模型大鼠腦運動皮層中MCT2和MCT4的表達Figure 1 Western blotting analysis of MCT2 and MCT4 expressions in the cerebral motor cortex of rats in each group

采用免疫組織化學DAB染色技術對比檢測各組鼠腦運動區皮層神經元上MCT2和星形膠質細胞上MCT4表達情況。如圖2所示，與對照組相比，大鼠腦運動皮層神經元上MCT2的表達在高原習服1周后明顯升高并維持穩定。與MCT2不同，MCT4表達在星形膠質細胞內，其在高原習服3 d后即開始升高，2周后明顯升高并維持穩定。MCT2和MCT4免疫組織化學檢測變化趨勢與免疫印跡檢測結果基本一致，可互相印證。

圖2 免疫組織化學檢測各組運動疲勞模型鼠腦運動皮層中MCT2（A）和MCT4（B）表達（DAB染色法，×400）Figure 2 Immunohistochemical detection of MCT2(A)and MCT4(B)in the cerebral motor cortex of rats in each group(DAB staining,×400)

2.3 大鼠腦遲發性神經元死亡病理學評價情況

通過腦切片尼氏染色進行遲發性神經元病理學評價。各組鼠腦神經元組織學分級及平均ND值如表2所示。與對照組比較，急進高原組、高原習服3 d和1周組及高原抑制劑組的平均ND值均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。常規運動組和高原習服2周組的平均ND值與對照組無明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組運動疲勞模型鼠腦運動皮層神經元組織學分級數量和平均神經元密度值Table 2 Histological grade and average neuronal density in the cerebral motor cortex of rats under exercise-induced fatigue conditions（-x±s,n=3）

圖3所示為具有代表性的各組大鼠腦皮層神經元尼氏染色圖像。對照組、常規運動組、高原習服1周組及高原習服2周組的神經元排列均較為整齊、均勻，細胞間分界清楚，細胞膜、細胞核完整，核仁清晰，染色質分布均勻。急進高原組、高原習服3 d組及高原抑制劑組的神經元細胞排列稀松紊亂，細胞間分界不清，染色質濃集。特別是急進高原組和高原習服3 d組的細胞骨架及細胞器均有明顯破壞，部分凋亡或壞死細胞固縮深染。

圖3 各組運動疲勞模型鼠腦運動皮層神經元尼氏染色（×200，局部放大×400）Figure 3 Nissl staining in the cerebral motor cortex of rats under exercise-induced fatigue conditions(×200，local enlarged image×400)

2.4 鼠腦乳酸含量測定情況

各組鼠腦乳酸含量及變化趨勢見表3。與常規運動組比較，除對照組外，其余各組鼠腦乳酸含量均明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），且隨著模擬高原時間延長呈逐漸上升趨勢。與急進高原組比較，高原習服1周后，鼠腦乳酸含量上升趨勢明顯加快，差異有統計學意義（P＜0.05）。高原抑制劑組鼠腦乳酸含量最高，與各組之間差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表3 各組運動疲勞模型大鼠平均腦組織乳酸含量Table 3 Average brain lactate content in rats under exercise-induced fatigue conditions（-x±s,n=3）

3 討論

3.1 高原習服與中樞乳酸的關聯性

高原低氧環境對機體最顯著且持久的影響是運動能力降低。有研究表明，急進4 500 m高原時，人體最大運動能力可降至平原的50%。隨著在高原駐留時間延長，機體發生高原習服適應，運動能力逐漸恢復［7，26］。針對高原習服現象的研究是高原運動醫學研究的核心內容之一。已有研究表明，中樞乳酸堆積可造成神經元損傷，同時在極量運動及缺氧狀態下中樞乳酸亦可被神經元利用而氧化供能［11-12］。細胞間乳酸的轉運依賴于MCTs。1974年英國研究人員率先報告了人體紅細胞中MCT1及其抑制劑4-CIN。隨后的研究陸續發現擁有14種亞型的MCTs分布于不同的組織細胞膜表面，其中MCT1、MCT2和MCT4對運動狀態下的乳酸轉運至關重要［27］。本課題組前期的研究表明，鼠腦乳酸排出與攝取利用的整個鏈路均表現出適應運動疲勞的積極變化［28］。據此推測，高原習服現象的產生與中樞乳酸的損傷及氧化供能兩個過程取得平衡密切相關。

3.2 乳酸轉運抑制與高原習服阻斷

在前期研究的基礎上，本研究利用乳酸轉運抑制劑的干擾因素，針對高原運動能力變化、皮層神經元損傷及腦乳酸代謝之間的關聯性進行了深入探討。4-CIN是一種特異性線粒體乳酸和丙酮酸的共價轉運抑制劑［29-32］，可以有效抑制MCTs對乳酸的轉運功能。MCTs的不同亞型之間對4-CIN的敏感性不盡相同，屬競爭性抑制。MCT2對4-CIN抑制效應最為敏感，MCT4的敏感性較差［33-34］。中樞乳酸穿梭假說指出，由膠質細胞釋放的乳酸通過MCT4流出細胞外，再經由MCT2轉運進入神經元內部作為能量代謝的底物。這一閉合的能量代謝環路中無論是哪一個環節受到有效的競爭性抑制，均可被有效阻斷。因此，本課題組將4-CIN引入高原運動疲勞研究中。研究結果表明，急進高原后大鼠平均運動力竭時間明顯縮短，隨著高原習服時間延長，運動耐力逐漸恢復。鼠腦運動區皮層MCT2和MCT4表達變化與高原習服時間呈正相關，免疫印跡和免疫組織化學檢測均顯示出相同的可互相印證的變化趨勢。4-CIN的應用則迅速阻斷了高原習服帶來的運動能力的恢復。從4-CIN作為乳酸轉運競爭性抑制劑的角度出發，筆者認為上述阻斷主要源于能量代謝環路中乳酸經MCT2轉運進入神經元被有效抑制。實驗結果也表明，4-CIN僅抑制了MCT2和MCT4對乳酸的轉運功能，并未影響二者在分子水平的表達。

3.3 運動疲勞狀態下腦乳酸的損傷與供能平衡

體外細胞研究表明，在缺氧狀態下，神經元-膠質細胞共培養體系中MCT4表達升高，神經元利用膠質細胞產生的乳酸作為能量底物抵抗缺氧性損傷［16］。體內研究表明，由于血腦屏障的存在，腦內胞外乳酸是獨立于血乳酸而存在的［10，35］。缺氧及運動狀態下，血乳酸的增加對腦乳酸變化影響較小。腦內細胞外乳酸主要來源于星形膠質細胞［35］。腦內乳酸堆積既可導致遲發性神經元損傷［9］，也可在特定情況下作為神經元活動的能量底物［13］。本研究特別設定了神經元死亡病理學評價和腦乳酸含量測定對運動疲勞狀態下的乳酸損傷和供能機制進行深入研究。結果表明，隨著高原習服時間延長，大鼠疲勞負荷運動能力逐漸恢復，鼠腦乳酸含量呈現出逐漸上升的趨勢，其神經元損傷與死亡程度亦逐漸減輕。應用乳酸轉運抑制劑4-CIN可明顯阻斷這一恢復過程。綜合分析，筆者認為急進高原后，腦乳酸堆積造成了明顯的神經元損傷。隨著高原習服時間延長，MCTs表達升高，運動疲勞狀態下部分神經膠質細胞產生的腦乳酸經過MCTs的轉運被神經元利用氧化供能，從而減輕了乳酸堆積造成的神經元損傷，運動能力隨之逐漸恢復。4-CIN阻斷乳酸轉運后，這一保護作用隨之消失。

綜上所述，筆者認為MCTs可以作為高原低氧環境下運動疲勞醫學干預的重要靶點。本研究中4-CIN僅阻斷了MCTs的乳酸轉運作用，并未影響其分子表達。后續研究中或可引入siRNA干擾及基因沉默等方法，人為調控MCTs表達，將會對這一機制提供更為有力的佐證。另外，體外研究中MCTs和興奮性氨基酸轉運蛋白相互作用參與神經元的遲發性損傷［36］，也值得在高原運動醫學中深入探究。

[醫學倫理聲明Medical Ethics Statement]

本研究涉及的所有動物實驗均已通過聯勤保障部隊第九四〇醫院實驗動物倫理委員會審查批準（No.2020KYLL032）。所有實驗過程均遵照中國實驗動物相關法律法規條例要求進行。All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Experimental Animal Ethics Committee of the 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese People's Liberation Army(Approval Letter No.2020KYLL032).All experimental procedures were performed in accordance with the requirements of laws and regulations in China related to experimental animals,includingAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal:Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892-2018),and so on.

[作者貢獻Author Contribution]

高晨負責實驗總體設計、數據統計及課題論文撰寫；凡春玲負責高原低氧大鼠運動疲勞模型構建及運動能力檢測；李玉榮負責鼠腦皮層蛋白提取及蛋白質印跡檢測；裴文娟負責鼠腦切片制備、免疫組織化學檢測和尼氏染色；關彩萍負責鼠腦遲發性神經元死亡病理學評價和乳酸測定。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。