不同年齡段食蟹猴骨礦含量與骨密度測定分析

韋祝梅,申 果,李振明,曾 勇,季 風,楊繼紅

(1.廣西華仁醫學科技集團有限公司,南寧 530000;2.廣西科學院醫學與健康研究院,南寧 530000;3.廣西瑋美生物科技有限公司,南寧 530021)

食蟹猴是獼猴屬動物之一，是人類的近屬動物，在形態、生殖、代謝等方面與人類非常相似。食蟹猴在遺傳物質上與人有75.0%～98.5%的同源性［1］，并且它們經常性保持直立體位，生物力學與人類最為相近。食蟹猴體內器官系統包括消化系統、內分泌系統和生殖系統等，其飲食要求、組織器官、骨生物力學特性、雌性動物性周期與人類相似，骨代謝也與人類接近。因此作為非人靈長類動物的重要一員，食蟹猴是進行生物醫學研究較為理想的實驗動物［2］。目前，在骨質疏松癥藥物治療評價中就有研究選擇食蟹猴作為實驗模 型 動 物［3］，以 骨 礦 含 量（bone mineral content，BMC）和骨密度（bone mineral dendity，BMD）降低到一定的標準作為造模成功的依據。BMC是指骨骼中的礦物質含量，以克（g）表示；BMD是指單位面積的骨礦含量，以克每平方厘米（g/cm2）表示［4］。BMD和BMC的測定值是骨鈣沉積狀況的一種定量指標，能夠比較精確地反映骨骼的發育及成熟狀態，也是目前人類診斷骨質疏松的重要手段［5-6］。然而不同動物的骨骼發育情況不同，不同動物在不同年齡不同部位的BMD和BMC值差異大。食蟹猴作為理想的實驗動物，在骨骼發育和骨質疏松的研究中具有巨大的價值，只有建立完整、準確的骨骼數據標準，掌握健康食蟹猴的正常BMD和BMC值，才能在評價食蟹猴骨質疏松癥模型造模結果評價方面有更加確切的依據，這對于后續實驗效果的評價也至關重要。

目前臨床和科研常用的BMD測量方法有雙能X線吸收檢測法（dualenergy X-ray absorptiometry，DXA）、定量計算機斷層攝影術（quantitative computed tomography，QCT）、外周QCT（peripheral quantitative computed tomography，pQCT）和定量超聲（quantitative ultrasound，QUS）等多種方法，其中基于DXA測量結果是骨質疏松癥診斷金標準［7］。判斷人類及實驗動物骨質健康狀況均是基于DXA測量結果。因此，同性別、同品種健康食蟹猴骨峰值的準確數據是骨質疏松癥模型研究所必需的基礎數據。

本實驗通過對健康雄性和雌性食蟹猴各個年齡階段283只的大樣本量DXA測量，獲得1～15歲及15歲以上全年齡段、不同性別的健康食蟹猴BMD和BMC的標準數據和變化趨勢，為食蟹猴骨骼生長發育特點提供數據支持，為以食蟹猴為模式動物的骨科疾病的研究提供可供參考的基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

283只普通級食蟹猴，年齡1～19歲，其中雄性187只，雌性96只。分為雄性和雌性不同年齡段：1歲≤年齡＜3歲（1～2）組（雄性10只，雌性10只）、3歲≤年齡＜5歲（3～4）組（雄性20只，雌性14只）、5歲≤年齡＜7歲（5～6）組（雄性10只，雌性10只）、7歲≤年齡＜9歲（7～8）（雄性16只，雌性11只）組、9歲≤年齡＜11歲（9～10）（雄性28只，雌性12只）組、11歲≤年齡＜13歲（11～12）組（雄性10只，雌性12只）、13歲≤年齡＜15歲（13～14）組（雄性21只，雌性0只）、年齡≥15歲（≥15）組（雄性72只，雌性27只）。動物由廣西瑋美生物科技有限公司提供［SCXK（桂）2012-0004］。動物均飼養于普通級動物房內，檢測血液學、血生化等指標未見異常，無運動障礙。環境溫度：16～28℃，相對濕度：40%～80%，自然光照，大欄飼養，每天飼喂食蟹猴專用顆粒料2次，分別在7:30和17:00投喂專用飼料，自由飲水，每天14:00點投喂蘋果約半個/只。項目在廣西瑋美生物科技有限公司實驗部完成［SYXK（桂）2013-0008］，本實驗中動物飼養、麻醉及檢測等操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》和《關于善待實驗動物指導性意見》的要求。

1.2 實驗器材

TC30K電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠，中國）；雙能X線骨密度儀（DEXA）（Discovery Wi，美國）。

1.3 食蟹猴骨密度與骨礦含量的測量

（1）DEXA測量儀器：采用美國HOLOGIC生產的雙能X線骨密度儀（DEXA）測量骨密度與骨礦含量。

（2）DEXA測量方法：動物于測量前一天晚17:00后禁食，自由飲水，次日早餐禁食。稱量動物的體質量，測體溫，查看糞便和精神狀況，確保動物健康。使用麻醉藥物前15 min核對確認動物ID牌，肌內注射硫酸阿托品劑量為0.01 mg/kg。肌內注射麻醉藥舒泰50劑量為2.5 mg/kg。動物麻醉后根據儀器SOP進行掃描，見圖1。結束確認動物的心跳、血壓、體溫生命體征恢復正常后放回原籠。

圖1 雙能X線骨密度儀測量食蟹猴的骨密度和骨礦含量Figure 1 Bone mineral density（BMD）and bone mineral content（BMC）of cynomolgus monkeys were measured by dual-energy X-ray absorptiometry

1.4 數據統計及分析

2 結果

2.1 食蟹猴BMC和BMD不同年齡段測量結果和變化

通過骨密度儀對283只動物進行全身掃描，得出不同年齡段雄性和雌性食蟹猴全身總和的BMC和BMD，如表1所示。

雄性食蟹猴在1～12歲時，BMC值隨著年齡的增長而顯著升高。BMC由1～2歲的67.38 g增長到12歲的399.15 g，增長了5.92倍，平均年增長30.16 g；其中增長幅度最大的年齡是3～6歲，平均增長率為45.15 g/年。13歲以后的老年雄性食蟹猴BMC值呈下降趨勢，但下降不明顯；13～14歲的BMC值為368.37 g，≥15歲時維持在（367.51±7.17）g。1～8歲BMD逐年增長，從0.32 g/m2增加到0.57 g/m2；8～15歲的BMD相對穩定，維持在（0.57±0.05）～（0.56±0.06）g/m2。

雌性食蟹猴在1～10歲時，BMC值隨著年齡的增長而顯著升高。BMC由1～2歲的58.84 g增長到10歲的233.29 g，增長了3.96倍，平均增長率為19.38 g/年；10歲后BMC值呈下降趨勢，且下降顯著。11～12歲BMC值為208.05 g，13～14歲缺乏數據（從表1判斷，13～14歲BMC值大約為180 g左右），15歲后降到166.63 g，平均下降率為13.33 g/年，15歲后較10歲時的BMC下降了28.6%，平均每年下降5.72%。1～10歲BMD逐年增加，從0.31 g/m2增加到0.47 g/m2；10～15歲的BMD相對穩定，維持在（0.47±0.03）～（0.46±0.00）g/m2。

表1 雄性和雌性食蟹猴不同年齡的骨密度和骨礦含量Table 1 Bone mineral density(BMD)and bone mineral content(BMC)of male and female cynomolgus monkeys at different ages（±s）

表1 雄性和雌性食蟹猴不同年齡的骨密度和骨礦含量Table 1 Bone mineral density(BMD)and bone mineral content(BMC)of male and female cynomolgus monkeys at different ages（±s）

注：同性別與前一年齡段比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；同年齡段不同性別之間的比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note：Comparisons between same sex at different ages，★P＜0.05，★★P＜0.01.Comparisons between different sexes of the same age group，△P＜0.05，△△P＜0.01.BMC：Bone mineral content；BMD：Bone mineral density.

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雄性食蟹猴和雌性食蟹猴的BMC在每個年齡段都有顯著差異，在3歲后的每個年齡段都有極顯著差異。雌性食蟹猴進入中青年期后BMC比雄性的低，在骨量峰期（9～10歲）時雄性食蟹猴的全身BMC總和是雌性食蟹猴BMC總和的1.93倍，10歲以后，雌性食蟹猴的BMC下降速度比雄性食蟹猴快，15歲后老年雄性食蟹猴的BMC是雌性的2.25倍。1～4歲雄性食蟹猴和雌性食蟹猴的BMD無明顯差異，5歲后雄性食蟹猴每個年齡段的BMD都顯著高于雌性食蟹猴。

2.2 不同年齡食蟹猴各部位BMD隨年齡變化

2.2.1 雄性食蟹猴不同年齡不同部位BMD變化

雄性食蟹猴不同年齡不同部位BMD變化如表2所示。對不同年齡段各組雄性食蟹猴不同部位的BMD結果進行統計學分析，1～2歲組與3～4歲組間，3～4歲和5～6歲組間各部位BMD差異顯著（P＜0.01），即在1～6歲雄性食蟹猴全身各部位BMD均隨年齡增長而顯著增加，之后BMD變化不明顯。從不同部位的數據比較來看，BMD最高的是頭部，最低的是手臂：頭部＞脊柱＞骨盆＞手臂≈雙腿。

2.2.2 雌性食蟹猴不同年齡不同部位BMD變化

對不同年齡段各組雌性食蟹猴不同部位的BMD結果（暫缺13～14歲數據）進行統計學分析，1～2歲組與3～4歲組間各部位BMD差異顯著（P＜0.01），即在1～4歲雄性食蟹猴全身各部位BMD均隨年齡增長而顯著增加，之后BMD變化不明顯。從不同部位的數據比較來看，BMD最高的也是頭部，最低的也是手臂，頭部＞脊柱＞骨盆＞手臂≈雙腿。雌性食蟹猴不同年齡不同部位BMD變化詳見表2。

2.2.3 雄性和雌性食蟹猴不同部位BMD變化比較

在脊柱BMD方面，雄性和雌性食蟹猴脊柱BMD在5歲之前差異不顯著，在1～2歲的測量值都在0.39 g/cm2左右，在3～4歲的測量值都在0.52 g/cm2左右，從5歲開始，脊柱BMD在雄性和雌性之間開始有顯著差異，5～6歲雄性值在0.71 g/cm2左右，雌性值在0.55 g/cm2左右，雄性BMD顯著大于雌性，并在之后一直保持著顯著性差異（P＜0.01），詳見表2。

骨盆BMD的變化規律和脊柱BMD一致，雄性和雌性食蟹猴骨盆BMD在5歲之前差異不顯著，在1～2歲的測量值都在0.35 g/cm2左右，在3～4歲的測量值都在0.44 g/cm2左右，從5歲開始，骨盆BMD在雄性和雌性之間開始有顯著差異，5～6歲雄性值在0.53 g/cm2左右，雌性值在0.46 g/cm2左右，雄性BMD顯著大于雌性，并在之后一直保持著顯著性差異（P＜0.01），詳見表2。

表2 雄性和雌性食蟹猴不同年齡不同部位的骨密度變化Table 2 Changes in bone mineral density of different body parts in male and female cynomolgus monkeys at different ages（±s）

表2 雄性和雌性食蟹猴不同年齡不同部位的骨密度變化Table 2 Changes in bone mineral density of different body parts in male and female cynomolgus monkeys at different ages（±s）

注：同性別與前一年齡段比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；同年齡段不同性別之間的比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note：Comparisons between same sex at different ages，★P＜0.05，★★P＜0.01.Comparisons between different sexes of the same age group，△P＜0.05，△△P＜0.01.

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手臂BMD在5歲之前性別差異不顯著，在1～2歲的測量值都在0.2 g/cm2左右，在3～4歲的測量值都在0.3 g/cm2左右，5歲以后，雄性食蟹猴各年齡段手臂BMD都比雌性食蟹猴大（除雌性食蟹猴13～14歲數據缺乏外），差異顯著（P＜0.01），詳見表2。

雙腿BMD在5歲之前性別差異不顯著，在1～2歲的測量值都在0.26 g/cm2左右，在3～4歲的測量值都在0.34 g/cm2左右，5歲以后，雄性食蟹猴各年齡段雙腿BMD都比雌性食蟹猴大，差異顯著（P＜0.01），詳見表2。

頭骨BMD在7歲之前性別差異不顯著，在1～2歲的測量值都在0.61 g/cm2左右，在3～4歲的測量值都在0.97 g/cm2左右，在5～6歲的測量值都在1.15 g/cm2左右。6歲以后，雄性食蟹猴的各年齡段頭骨BMD都比雌性食蟹猴大，差異顯著（P＜0.01），詳見表2。

全身骨BMD變化和脊柱BMD、盆骨BMD值變化規律一致。雄性和雌性食蟹猴全身平均BMD在5歲之前差異不顯著，在1～2歲的平均值都在0.32 g/cm2左右，在3～4歲的測量值都在0.42 g/cm2左右，從5歲開始，骨盆BMD在雄性和雌性之間開始有顯著差異，5～6歲雄性值在0.53 g/cm2左右，雌性值在0.44 g/cm2左右，雄性BMD顯著大于雌性，并在之后一直保持著顯著性差異（P＜0.01），詳見表2。

3 討論

本實驗主要研究健康食蟹猴不同年齡段、不同性別骨骼發育特點。食蟹猴的壽命約30歲，4歲性成熟，絕經期一般在15歲后。根據食蟹猴的生理發育情況，為觀察未成年、成年后以及老年食蟹猴BMC和BMD的變化，本研究將不同性別的食蟹猴按不同年齡分組。實驗結果表明，雄性食蟹猴1～12歲是骨骼發育期，雌性食蟹猴1～10歲是骨骼發育期，其中1～6歲時的骨骼發育是以快速生長為主，這個時期是食蟹猴的成長期。之后骨骼繼續發育成熟，雄性食蟹猴BMC和BMD峰值出現在11～12歲，12～15歲骨吸收大于骨形成，骨量逐漸丟失。而雌性食蟹猴BMC和BMD峰值出現在9～10歲，10歲后BMC開始顯著下降。此結論與蔡敏的研究結果相似：小于10歲的雌性食蟹猴BMC和BMD與年齡呈正相關，大于10歲則呈負相關［8］。雌性食蟹猴的BMC峰值比雄性低很多，僅相當于雄性食蟹猴的58%，BMD峰值相當于雄性食蟹猴BMD峰值的80%，這與人類男性BMD高于女性BMD的現象一致。雌性食蟹猴BMC丟失要開始得更早，從10歲起雌性食蟹猴BMC開始顯著下降，之后每個年齡段BMC都顯著下降，這可能是因為進入衰老期的雌性食蟹猴BMC受雌激素降低的影響較大［9-10］。對比人體骨骼發育，有研究［11］表明人類BMC和BMD值在30歲以前呈增加趨勢，30～40歲的BMC和BMD達到一生的峰值期，此后隨年齡增加，骨量逐漸丟失，BMC和BMD呈現下降趨勢。BMD峰值期過后，破骨細胞相對活躍，開始出現生理性的骨量減少，骨質總量以每年0.2%～0.5%的速度遞減。和人類相比，食蟹猴的10歲骨骼狀態相當于人類的30歲骨骼狀態，10歲之后食蟹猴每年骨量丟失的速度約為人骨量丟失速度的10倍。

食蟹猴身體不同部位的BMD數值從大到小依次為頭部＞脊柱＞骨盆＞手臂≈雙腿，雄性和雌性規律一致，即頭部BMD最大，四肢最小，且雄性猴各部位的BMD均比雌性的高。Black等［12］研究發現不同年齡段雄性食蟹猴的BMD高于雌性。Cerroni等［13］對不同年齡段恒河猴的骨密度研究表明雄性的BMD高于雌性。本研究得到了相似的結果，即各年齡段的雄性食蟹猴的BMD高于雌性。本研究中年齡區間分得更小，對食蟹猴的BMD變化體現得更詳細。在不同部位的BMD中，頭骨的BMD隨著年齡的變化最明顯，這與王曉達等［14］的研究結果一致。其他部位的BMD在食蟹猴6歲后相對穩定，10歲左右進入衰老期后也未出現明顯下降，這和人類老年階段BMD自然減少的規律不一致，原因可能是頭骨面積比較穩定，當進入衰老期時，BMD隨著骨量丟失而降低，而其他部位雖然骨量丟失，但是骨面積也變小，表現為衰老期猴的體長變小等，所以BMD變化不大；或者可能與頭骨松質骨相對較多有關，因為松質骨積累和丟失的速度均快于皮質骨，具體原因需要改進方案延長選用猴的年齡段，測量其骨密度，更加完整地監測食蟹猴BMD的變化規律。

隨著年齡增長骨密度降低可能會導致骨質疏松癥的發生，食蟹猴BMC及BMD隨著年齡增長的變化和達到峰值骨量后的變化與人類的生理過程十分相似，因此食蟹猴是研究人類BMD、骨質疏松和骨質減少的良好模型。本研究測量的不同性別、不同年齡段的BMC和BMD變化，為以食蟹猴為模式動物的骨科疾病的研究提供了可供參考的基礎數據。

[醫學倫理聲明Medical Ethics Statement]

所有實驗操作均在廣西瑋美生物科技有限公司（擁有AAALAC完全認證）實驗部完成，實驗過程遵照中國實驗動物相關法律法規條例要求進行，包括《實驗動物管理條例》（2017年3月1日）和《關于善待實驗動物指導性意見》（2006年9月30日）。

All experimental operations were completed in the Experimental Department of Guangxi Weimei Bio-tech Co.,Ltd,which has been certified by AAALAC.All experimental procedures were performed in accordance with the requirements of laws and regulations in China related to experimental animals,includingAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal:Guidance on the Treatment of Experimental Animals(30/09/2006),and so on.

[作者貢獻Author Contribution]

韋祝梅負責文章的材料收集和整理，并結合實踐進行文章撰寫；申果負責文章摘要的翻譯以及材料整理；李振明、曾勇、季風對全文的數據準確性進行確認，并提出修改建議；楊繼紅對全文內容提供指導。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。