橫向主動脈縮窄術致兔心力衰竭模型的建立

羅慶祎,章體玲,丁云川,陳 劍,趙 麗,王慶慧

(1.昆明市延安醫院超聲醫學科,昆明 650200;2.云南省心血管疾病重點實驗室,昆明 650200;3.云南省心臟疾病臨床醫學中心,昆明 650200;4.昆明市延安醫院心內科,昆明650200）

心力衰竭是一種影響人類全身器官的復雜性臨床綜合征，是幾乎所有心血管疾病的最終階段，對人類健康產生極大威脅［1-2］。為深入研究人類心力衰竭的發生和發展機制，建立穩定可靠的動物模型顯得很有必要。既往研究多采用小型實驗動物建立心力衰竭模型，但由于小型動物體型較小，該類模型在一些實驗應用中受到了限制［3-5］。兔作為一種常用的醫學實驗動物，體型中等，其心力衰竭的病理過程與人類相似，因此可以作為研究人類心力衰竭的理想模型動物［6］。本研究通過橫向主動脈縮窄（transverse aortic constriction，TAC）術致使實驗兔主動脈弓縮窄，建立兔心力衰竭模型，然后使用超聲評估實驗兔的主動脈弓縮窄程度及心功能指標，并與分子生物學及病理學指標相印證，從而探討TAC術建立實驗兔心衰模型的可行性和有效性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級健康雄性日本大耳兔25只，體質量2.0～3.0 kg，由昆明醫科大學動物實驗中心［SCXK（滇）K2020-0004］提供，動物合格證編號為kmmu210012。實驗兔飼養于昆明市延安醫院中心實驗室動物房［SYXK（滇）K2020-0006］，在清潔環境下飼養，保證兔自由飲食，12 h明/暗循環。正常的動物飼料為協同生物出品實驗用兔維持飼料，動物飲用水為反滲透凈化水，飼料容器及飲水裝置經高溫高壓滅菌冷卻后使用。

本研究動物實驗經昆明市延安醫院實驗動物倫理委員會審查批準，受理編號為2020002，批準文號為2014117。所有動物實驗操作符合實驗動物3R原則及國內外相關的實驗動物福利倫理標準要求。

1.2 動物模型建立

隨機將實驗兔分為手術組（n=15）和假手術組（n=10）。參照既往研究方法改良進行操作，手術方法如下：以20%烏拉坦10 mL/kg腹腔麻醉動物后，取右側臥位，固定于手術臺上，通過呼吸機控制兔的呼吸頻率、潮氣量并維持其正常生命體征，常規連接并記錄標準導聯心電圖。備皮后，碘伏消毒胸部術區，在胸骨左緣第二肋間隙水平，剪開皮膚，鈍性分離肋間肌，胸腺和組織后暴露主動脈弓遠心端，用27 G針頭墊在左鎖骨下動脈下方約2 cm處，剝離主動脈鞘，以0-5絲線結扎主動脈弓遠心端，然后緩慢抽出針頭，逐層關閉胸腔，消毒切口，完成手術［7-9］。術前及術后使用卡洛芬進行鎮痛，術前2 h按4 mg/kg的劑量皮下注射給藥，術后視動物情況繼續給藥。術后3 d每天肌內注射100 000 U青霉素抗感染，觀察動物體征。假手術組除未結扎外，其余操作相同。手術結扎部位如圖1所示，術后正常飼養。

圖1 實驗兔橫向主動脈縮窄術結扎部位圖Figure 1 Sites of surgical ligation of the transverse aortic constriction(TAC)in rabbits

1.3 超聲評估心功能

采用美國GE公司Vivid E9彩色多普勒超聲診斷儀，并配有6 S探頭，頻率4.4～11.4 MHz。術后4周及8周，使用多普勒超聲檢測手術組和假手術組兔心功能指標。于術后8周使用多普勒超聲評估主動脈弓縮窄程度，以6 S探頭于胸骨上窩切面檢測實驗兔主動脈弓縮窄處血流速度以評估狹窄程度［10-11］。

取左胸骨旁的短軸切面，在二尖瓣腱索水平記錄M型超聲心動圖，分別測量升主動脈內徑（ascending aortic diameter，AAOd）、左房舒張末期內徑（left atrial end-diastolic diameter，LADd）、左室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDd）、左室收縮末期內徑（left ventricular end-systolic diameter，LVEDs）、左室舒張末期室間隔厚度（interventricular septal end-diastolic thickness，IVSd）、左室后壁舒張末期厚度（left ventricular posterior wall end-diastolic thickness，LVPWd），計算左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）。以上超聲數據均由兩位經驗豐富的超聲科醫師通過雙盲法在連續3個心動周期上測量完成，各指標取其平均值。

1.4 RNA檢測

術后8周完成超聲檢查后，麻醉后采用空氣栓塞法處死實驗兔，取心臟組織，使用TRIzol法提取左心室總RNA。應用實時熒光定量PCR法測定N-末端腦鈉肽前體（N-terminal pro B type natriuretic peptide，NTproBNP）和β-重鏈球蛋白（β-myosin heavy chain，β-MHC）的mRNA相對表達量（以管家基因GAPDH為內參）［12-13］。

1.5 病理組織學檢查

TAC術后8周，超聲檢查結束后，處死動物并開胸取出心臟。左心室經質量分數4%的甲醛溶液固定，常規脫水，組織采用石蠟包埋，切片，進行HE染色和Masson染色，光學顯微鏡下觀察病理變化。使用Olympus電子顯微鏡觀察和拍攝HE染色和Masson染色切片，同一切片攝取5個不同視野的照片。

1.6 統計方法

2 結果

2.1 實驗動物基本情況

實驗組2只兔在7周時因心力衰竭癥狀較重，搶救無效死亡。第8周時，共存活23只實驗兔，其中手術組13只，假手術組10只。13只存活手術組實驗兔在術后8周均有顯著的不同程度的心衰表現，主要表現為充血性心力衰竭。23只實驗兔在術后4周和8周時的超聲檢查中，透聲條件良好，均獲得了滿意的超聲結果。

2.2 降主動脈流速

TAC術后8周，于胸骨上窩切面探查顯示，手術組實驗兔降主動脈縮窄處探及高速湍流血流信號，該處平均流速為（2.20±0.56）m/s；而假手術組降主動脈平均流速為（0.20±0.03）m/s；手術組的降主動脈流速較假手術組顯著加快，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組實驗兔的降主動脈流速及對比如圖2所示。

圖2 多普勒超聲檢測實驗兔降主動脈流速Figure 2 Flow velocity of the descending aorta in rabbits

2.3 心臟彩超指標對比

TAC術后4周，與假手術組比較，實驗兔的心率、AAOd、LADd、LVEDd、LVEDs和LVEF未見明顯差異（P＞0.05），而IVSd和LVPWd顯著增加（P＜0.05）。TAC術后8周，與假手術組比較，實驗兔的心率、AAOd、LADd、LVEDd和LVEDs明顯增加，LVEF明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其中LVEDs增加最為明顯，假手術組LVEDs為（4.89±0.68）mm，手術組LVEDs為（8.83±0.72）mm；而IVSd和LVPWd在8周時兩組間差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 術后4周及8周實驗兔心臟彩超指標變化Table 1 Changes in cardiac ultrasound parameters at 4 and 8 weeks after operation（-x±s,n=5）

2.4 二維超聲心動圖對比

TAC術后4周，心尖四腔心切面顯示，較假手術組對比，手術組左心房、左心室內徑輕度增大，IVSd及LVPWd均明顯增加，呈向心性肥厚改變；術后8周手術組左心房、左心室內徑明顯增大，左室壁變薄，呈離心性肥厚改變。以上超聲聲像圖改變均能直觀反映手術組和假手術組兔因左心室負荷過重所引起的心臟結構變化（圖3）。

圖3 心臟彩超顯示各組實驗兔心尖四腔心切面圖Figure 3 Doppler echocardiography shows the apical four-chamber view of each group

2.5 左心室心衰標志物水平變化

TAC術后8周，通過實時熒光定量PCR檢測手術組和假手術組實驗兔左心室心衰標志物mRNA的轉錄水平。手術組NT-proBNP和β-MHC mRNA相對表達量分別為（1.33±0.15）和（1.02±0.07），假手術組分別為（0.65±0.04）和（0.38±0.03）。手術組和假手術組相比，NT-proBNP和β-MHC mRNA相對表達量均顯著升高（P＜0.05，圖4）。

圖4 橫向主動脈縮窄（TAC）術后8周實時熒光定量PCR測定實驗兔左心室心衰標志物水平變化Figure 4 Changes in the contents of left ventricular heart failure markets 8 weeks after TAC detected by realtime quantitative PCR

2.6 病理組織學結果

HE染色結果顯示，TAC術后8周，假手術組實驗兔的心肌細胞排列規則整齊，細胞大小正常，較少存在細胞外間質；手術組實驗兔的心肌細胞排列松散，細胞橫徑增加，間隙增寬（圖5A）。

同時，Masson染色結果顯示，假手術組實驗兔僅見少量膠原纖維存在于血管周圍和心肌細胞之間；手術組實驗兔心肌纖維疏松，膠原纖維含量增加，心肌大面積呈現藍色（圖5B）。

圖5 手術組及假手術組實驗兔心肌組織的HE染色與Masson染色Figure 5 HE staining and Masson staining of experimental rabbit myocardial tissues in the operation and sham-operation groups

3 討論

本實驗通過TAC術致兔主動脈弓縮窄，成功建立了兔心力衰竭模型。手術組實驗兔在TAC術后8周出現明顯的不可逆的充血性心力衰竭，符合臨床上后負荷增加所致充血性心力衰竭的病理表現［14-15］。應用心臟超聲檢測降主動脈縮窄處血流速度，發現手術組降主動脈流速較假手術組明顯升高，手術組實驗兔存在明顯的主動脈弓縮窄。通過超聲檢測證明，TAC術成功造成了實驗兔降主動脈縮窄，結果準確且重復性好。

通過超聲觀察到手術組的升主動脈弓內徑和室壁厚度相較于假手術組明顯增加，符合由于降主動脈縮窄所致心臟后負荷增加的病理生理改變。TAC術后4周及8周時的心臟超聲指標顯示，較假手術組相比，手術組實驗兔均表現出明顯的心臟擴大。具體表現在以下方面：衡量心臟功能的指標LADd、LVEDd、LVEDs均明顯升高，反映了實驗兔心力衰竭時存在心臟擴大。二維超聲心動圖也證實實驗兔心力衰竭中存在心臟擴大。手術組中反映心臟收縮功能的超聲指標LVEF則明顯下降，表明實驗兔存在心臟因后負荷過重導致的心功能下降。之前的研究中，通過結扎兔腹主動脈發現，8周時出現心肌肥厚和心力衰竭［16］。綜上所述，心臟超聲能夠完整準確地采集心力衰竭兔的心臟擴大指標和心功能指標，為診斷實驗兔心力衰竭提供了可靠的依據。

有研究通過兔腹主動脈縮窄聯合靜脈腎上腺素輸注，成功誘導了充血性心力衰竭模型，于術后8周觀察到手術組兔超聲心動圖發生明顯異常［17］。腹主動脈是主動脈弓血液的主要流出道，腹主動脈縮窄也能導致充血性心力衰竭的發生；這與本研究結果一致。有研究表明，小鼠主動脈縮窄所致的心力衰竭模型中，通過超聲觀察到的心力衰竭指標LVEDd僅在第18天以后出現明顯升高，而第9天并未出現明顯升高［18］，即在術后第3周左右開始出現明顯的心力衰竭改變。但在本研究中，術后4周時超聲心動圖指標改變不明顯，術后8周才出現明顯的心力衰竭改變；這或許與小鼠屬于小型動物，其心臟對后負荷耐受較差有關。

研究表明，NT-proBNP的來源主要是心室，心室擴張和壓力負荷的增加是促進NT-proBNP釋放的主要因素，因此NT-proBNP常被用作評價心功能不全的標志物，用于心力衰竭的臨床診斷及療效評價［19］。β-MHC表達的增加會加重心肌病理性重構，導致心力衰竭的進展［20］。本研究用NT-proBNP和β-MHC評價實驗兔主動脈弓縮窄所致心力衰竭的可靠性。結果顯示，相較于假手術組，手術組實驗兔的T-proBNP和β-MHC水平在手術后8周時明顯升高，證實部分TAC致實驗兔心力衰竭的模型是可靠的。同時，手術組實驗兔心臟病理學組織切片顯示：TAC術后8周心肌細胞橫徑增加，肌纖維疏松，膠原纖維含量增加，與超聲心動圖中心肌回聲增強、心腔呈離心性擴大的結果相一致，也進一步證實了TAC術能夠通過增加實驗兔心臟后負荷誘導其產生心力衰竭。

本研究的局限性在于未對兔主動脈弓縮窄程度做分級，也未采用不同的術式進行對比，故未能觀察到不同主動脈弓縮窄程度對疾病進展程度的影響。另外，實驗中超聲只觀察了術后4周及8周時（即心力衰竭中晚期）的心功能指標，未能完整地觀察到實驗兔從TAC術后到心力衰竭整個過程的變化。因此，后續的研究有必要觀察實驗兔TAC術后早期的指標（如1周、2周），并選擇不同程度的縮窄術式，以便更嚴謹地探討主動脈弓縮窄程度與心力衰竭發生的關系，明確TAC術建立兔心力衰竭模型的可行性及心臟超聲的評估作用。

常規TAC術式在無名動脈和左側頸總動脈之間結扎。本研究采用的TAC術式為非常規術式，即在主動脈弓向降主動脈延續的位置結扎。由于主動脈弓發出的分支血管較多，在分離血管時難度較大，雖然在預實驗時盡量分離主動脈鞘，但是最終實驗效果未達到預期。另外，在預實驗中發現，選擇在無名動脈和左側頸總動脈之間結扎的方式，兔的死亡率較高。因此，為了更好地剝離主動脈鞘和分離結扎血管，本研究選擇在主動脈弓向降主動脈延續的位置進行結扎。兩種結扎方式在兔心力衰竭模型構建中的差別，以及對結果有無影響，還需在后續研究中加以探討。

綜上所述，本研究應用TAC術建立實驗兔心力衰竭模型是有效且可行的，在TAC術后8周時兔心肌出現失代償反應，形成不可逆的心力衰竭。TAC術后通過心臟超聲評價實驗兔心功能及主動脈弓縮窄程度，可以準確判斷心力衰竭模型是否成功，并能觀察其發展過程中的心臟形態學及心功能變化。

[醫學倫理聲明Medical Ethics Statement]

本研究涉及的所有動物實驗均已通過昆明市延安醫院實驗動物倫理委員會審查批準（No.2014117）。所有實驗過程均遵照中國實驗動物相關法律法規條例要求進行。

All animal experiments involved in this study have been reviewed and approved by the Experimental Animal Ethics Committee of Kunming Yan'an Hospital(Approval Letter No.2014117).All experimental procedures were performed in accordance with the requirements of laws and regulations in China related to experimental animals,including the guidelines such asAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal:Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892-2018),and so on.

[作者貢獻Author Contribution]

羅慶祎負責實驗設計及論文寫作；章體玲參與動物實驗及數據采集；丁云川參與動物實驗及數據采集；陳劍參與數據采集與數據分析；趙麗參與動物實驗；王慶慧負責課題和本論文的審核及把關。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。