普通環境設施內微屏障籠具飼養和維持清潔級小鼠初探

任 琦,李艷東,孫 強

(中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心,上海 200031)

國家標準GB 14922.2—2011《實驗動物微生物學等級及監測》根據攜帶微生物情況，將實驗動物分為無菌、SPF級、清潔級和普通級動物四個等級標準［1］。這是一個從微生物防控角度來約束實驗動物質量的國家標準。業內在如何做到微生物符合清潔級以上標準時往往認為屏障設施是關鍵。如有關實驗動物設施的國家標準GB 14925—2010《實驗動物環境及設施》第3.6條款約定屏障環境須“符合動物居住要求、嚴格控制人員、物品和空氣的進出，適用于飼育清潔級和/或無特定病原體級實驗動物”［2］。然而這并不意味著屏障設施就是確保微生物等級的硬性指標和不可或缺的條件。因為一方面建設及維護屏障設施往往需要巨大投入，另一方面在科研實踐中屏障的存在也給使用者進出設施帶來諸多不便。那么是否有既可以實現對微生物的控制，又能夠做到使用者進出設施方便的替代系統呢？

本研究嘗試在普通設施環境中用微屏障籠具來維持清潔級小鼠的繁育及實驗研究。在兩年的使用過程中，實現了清潔級實驗小鼠的飼養和維持。該籠具不僅可節約設施的維護和運行成本，同時也給使用者帶來了諸多便利?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和動物實驗

實驗動物分別購自維通利華實驗動物技術有限公司［SCXK（浙）2019-0001、SCXK（滬）2022-0007］和上海靈暢實驗動物有限責任公司［SCXK（滬）2018-0003］。SPF級 小 鼠 品 系 包 括C57BL/6JNifdc、DBA/2和CD-1（ICR）。這些不同品系的小鼠主要用于B6D2F1小鼠的繁育、超數排卵、胚胎移植、轉基因和基因編輯小鼠繁育、腫瘤細胞接種和涉及不同實驗目的給藥及采血實驗。

1.2 設施

設施位于上海市松江區佘山鎮，總建筑面積203㎡，隸屬于中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心［SYXK（滬）2021-0003］。設施內設有顯微注射室（圖1黃色框），屏障飼養區（圖1紅色框），輔助功能區（圖1藍色框）和微屏障飼養區（圖1綠色框）。

1.2.1 屏障飼養區

屏障飼養區建筑總面積為69㎡，為清潔走道和污染走道分開的雙通道屏障系統，配備一更、二更、風淋室、清潔物品傳遞通道、內準備室、飼養室、胚胎移植室、退緩間。內準備室內配有雙開門高壓滅菌鍋，飼養室內配有換籠工作臺1臺，胚胎移植室內配有超凈臺1臺。飼養室面積為14㎡，內設3組小鼠獨立通風飼養籠盒（exhast ventilated closed system cage rack，EVC）籠架（蘇州猴皇HH-A-4Ⅱ2臺，HH-A-4 1臺），合計300個籠位；屏障飼養區采用全新風系統，飼養室環境溫度控制在22～26℃，相對濕度控制在40%～60%。

1.2.2 微屏障飼養區

微屏障飼養區建筑總面積為29㎡，房間內配有換籠工作臺1臺，并安裝合計400個籠位的4組小鼠微屏障籠具和合計126個籠位的3組大鼠微屏障籠具，大鼠微屏障籠具用來群養小鼠。微屏障籠具所在房間為普通環境，頂部設有一排風口，排風口處安裝濾網避免野鼠進入；空氣置換通過房間內一拖二中央空調進行，并由空調控制房間溫度，輔以加濕器和除濕機實現極端天氣下的濕度控制，全年溫度控制在20～26℃，濕度控制在40%～70%［2］。

1.2.3 輔助功能區

輔助功能區建筑總面積為77㎡，包含籠盒清洗區、飼料與墊料存儲間、解剖室和倉庫各1間（圖1藍色框），解剖室內配有超凈臺1臺。輔助功能區位于屏障飼養區和微屏障飼養區之間，可以同時為屏障區內動物飼養和微屏障區內動物飼養提供籠盒清洗、消毒、物料存儲和動物進出等服務。

圖1 設施平面圖Figure 1 Facility floor plan

1.3 微屏障籠具

微屏障籠具購自蘇州猴皇有限公司。如圖2所示，微屏障籠具是由透明玻璃邊框圍成的立方體。小鼠微屏障籠具長寬皆為116 cm，高213 cm；大鼠微屏障籠具長寬皆為122 cm，高223 cm。微屏障籠具內設可控的獨立照明系統，頂端安裝有風機，通過初效、中效和高效三重過濾裝置將室內空氣凈化后送入微屏障籠具內。微屏障籠具內所用籠盒為EVC，材質為聚亞苯基砜（polyphenylene sulfone resins，PPSU）材料，小鼠籠盒底板面積為0.058 7㎡，高度≥0.135 m；大鼠籠盒底板面積為0.100 5㎡，高度≥0.22 m?；\盒進排氣口結構為低進高排，并分別配置了一個高效低阻過濾器?；\盒耐高溫高壓和化學試劑消毒，可反復使用?；\具內凈化后的空氣在正壓的作用下進入每個EVC籠盒內。廢氣則經EVC籠盒排氣口排放到中間的排風管道，并經活性炭吸附等處理后排出室外?；\具正面配置7寸彩色觸摸屏及可編程邏輯控制系統（programmable logic controller，簡稱PLC），可調節換氣次數、照度、光照周期等，同時可實時顯示溫度、相對濕度和壓差，參數詳見表1［2］。

圖2 微屏障飼養區實物圖Figure 2 Picture of the micro-barrier breeding room

表1 大鼠、小鼠微屏障系統參數Table 1 Parameter of micro-barrier system for rats and mice

1.4 設施管理模式

1.4.1 進出流程

1.4.1.1 屏障飼養區

人員流向：外界→一更→二更→風淋室→前室→飼養室（實驗室）→退緩間→出屏障飼養區（圖1屏障飼養區紅色箭頭）。

人員進入屏障飼養區，先在一更脫去自己的衣物，并將隨身物品一同放入更衣柜中，換上無菌手術衣、手術褲后進入二更；在二更穿上無菌防靜電隔離服，并戴好口罩、帽子、手套；確認穿戴整齊后進入風淋室風淋20 s，結束后進入屏障飼養區。需要說明，設施剛啟用時，考慮為更好地降低由人帶入病原微生物而引發設施污染的風險，制定了需加換手術衣的這項規則；但實施下來發現其影響不大，因此后期的設施運行會對更換手術衣不做強制要求。

物品流向：清洗間→高壓滅菌器/或傳遞窗→內準備室→飼養室（實驗室）→退緩間→出屏障飼養區（圖1屏障飼養區藍色箭頭）。

動物流向：外購合格動物→傳遞窗（外包裝消毒）→檢疫觀察→飼養室；飼養室（實驗室）→退緩間→出屏障飼養區（圖1屏障飼養區綠色箭頭）。

1.4.1.2 微屏障飼養區

人員流向：外界→更衣區→走道→微屏障飼養區和（或）胚胎移植室→走道→更衣區→出微屏障飼養區（圖1微屏障飼養區紅色箭頭）。

人員進入微屏障飼養區，在更衣區脫去外衣并將隨身物品放入更衣柜中，換上無菌工作服、戴好口罩、帽子、手套，乙醇溶液消毒洗手后就可以進入微屏障飼養區。

物品流向：清洗間→高壓滅菌鍋→微屏障飼養區和（或）胚胎移植室→清洗間（圖1微屏障飼養區藍色箭頭）。即微屏障飼養區的籠具等需要高壓處理的物品在高壓完成后，從雙開門高壓鍋的輔助區門退出，進入微屏障飼養區。

動物流向：外購合格動物→消毒→檢疫觀察→微屏障飼養區；微屏障飼養區和（或）胚胎移植室→清洗間；胚胎移植室→微屏障飼養區（圖1微屏障飼養區綠色箭頭）。

1.4.2 飼養管理

小鼠飼料為上海普路騰生物科技有限公司生產的大鼠小鼠輻照滅菌繁殖料［滬飼證（2018）0401］。墊料為大廠回族自治縣陳府伊甸園墊料加工廠生產的玉米芯墊料［SCXK（冀）2021-008］。飲用水為經高壓滅菌的普通潔凈水。

根據GB 14925—2010《實驗動物環境及設施》中的相關規定，籠盒、籠蓋、食槽、墊料、飲用水在使用前需滅菌處理。設施采用的滅菌方式為高壓滅菌鍋121℃高壓滅菌20～30 min，設定籠盒、水瓶的更換頻率為一周1～2次，籠蓋、料槽每兩周更換1次，籠盒上的過濾器每3個月更換1次。根據GB 14925—2010對小鼠居所最小空間的規定：籠內高度要求為0.13 m；對于底板面積的要求，小鼠單養時，體質量小于20 g為0.006 7 m2/只，體質量大于20 g為0.009 2 m2/只，群養時0.042 m2/窩。結合設施內所用大小籠盒的實際大小，設定小籠盒單籠飼養密度≤5只，大籠盒單籠飼養小鼠密度≤15只；日常換籠工作在換籠工作臺內進行，小鼠實驗在超凈臺內進行。每日觀察實驗小鼠的健康狀況，觀察其精神、飲食、行為有無異常［2］。

1.4.3 微生物的控制

1.4.3.1 環境微生物控制

每日換籠工作結束后，對操作臺、地面擦拭消毒，夜間對整體環境采用紫外燈照射1 h，消殺環境中的各種細菌、病毒和芽孢；每周對飼養室內的籠架、天花板、墻壁、門，按從上到下的順序全面擦拭消毒，再對整體環境進行噴霧消毒。消毒液為1%的次氯酸鈉、75%的乙醇溶液、0.5%的過氧乙酸溶液，每周更換1次，避免產生耐藥菌［3］。

空氣落下菌是反映設施微生物污染程度的重要指標，在飼養室靜態運行時，通過檢測空氣落下菌監控飼養室及微屏障內的空氣質量。落下菌的檢測頻率是每季度不少于1次，選用血液瓊脂培養基平放在地面上，沉降0.5 h，在37℃培養箱內培養48 h后觀察菌落數。屏障飼養區每個房間對角放置2個檢測平皿；微屏障飼養區每個微屏障內放置1個檢測平皿，飼養間內放置4個檢測平皿（微屏障飼養區飼養間面積是屏障飼養區飼養間面積的2倍）［4-5］。

1.4.3.2 動物微生物控制

訂購動物前，核查動物供應商近期環境檢測報告及該品系實驗動物微生物檢測報告；接收動物時，檢查該批動物的實驗動物質量合格證、運輸包裝是否破損，對外包裝用0.5%的過氧乙酸噴霧消毒后接收至飼養室并進行觀察，實驗動物經適應期觀察并確認質量合格后方可開始動物實驗，質量不合格的實驗動物及時移出飼養室［3］。

長期飼養的小鼠，以一臺微屏障籠具為單位設置哨兵鼠，哨兵鼠采用臟墊料方式為主，輔以抽取實驗結束的小鼠相結合的方式，每季度送第三方檢測機構蘇州西山生物技術有限公司，按照國家標準SPF級要求進行微生物和寄生蟲檢測［1，6］。

2 結果

2.1 環境微生物檢測

根據GB 14925—2010《實驗動物環境及設施》的要求，屏障環境的最大平均落下菌數應控制在≤3個（CFU/0.5 h·φ90 mm平皿）［2］。屏障飼養區和微屏障飼養區分別進行了19次落下菌檢測，結果見圖3。圖中用○標示檢測出落下菌的區域，○內的數字表示該區域檢測出的落下菌落數，未有標示的說明未檢出。

圖3 落下菌檢測結果Figure 3 The results of airborne bacteria detection

屏障飼養區有4次檢測出落下菌，分別在一更、二更、傳遞室、飼養室及胚胎移植室；雖有檢出，但是符合屏障環境的落下菌數要求。微屏障飼養區有7次檢測出落下菌，分別在1號、3號、6號和7號微屏障籠具以及飼養間。微屏障飼養區檢出的次數明顯高于屏障飼養區，其落下菌主要出現在飼養間，最高一次檢測到5個菌落。由于微屏障飼養區的飼養間是普通環境，普通環境對落下菌并不做要求，而微屏障飼養區的各微屏障籠具內落下菌并沒有高于國家標準規定為3個的最大數值，說明微屏障籠具內的落下菌是可以控制在國家標準約定的落下菌要求數值內。

2.2 動物微生物檢測

根據GB 14922.1—2001《實驗動物寄生蟲學等級及監測》和GB 14922.2—2011《實驗動物微生物學等級及監測》的要求，清潔級小鼠必檢項目有10種，分別是仙臺病毒、鼠痘病毒、小鼠肝炎病毒、沙門菌、泰澤病原體、支原體、鼠棒狀桿菌、體外寄生蟲、腸道蠕蟲和弓形蟲［1，6］。

在2020年6月至2022年6月，設施內小鼠按照SPF標準檢測8次，結果詳見表2。表2中微生物檢測結果顯示：前期4次（2020年6月—2021年9月）檢測均未檢出任何SPF級約定所必須排除的微生物。但隨著設施使用時間的延長，在后4次檢測中屏障飼養區有2次檢出嗜肺巴斯德桿菌和綠膿桿菌；微屏障飼養區有4次檢出嗜肺巴斯德桿菌和1次檢出綠膿桿菌。嗜肺巴斯德桿菌在屏障飼養區的檢出率為25%，在微屏障的檢出率為50%；綠膿桿菌在屏障飼養區的檢出率為25%，在微屏障的檢出率為12.5%。這兩種病原菌并不在清潔級小鼠需排除列表中，說明設施內的小鼠符合清潔級指標要求。

表2 屏障飼養區和微屏障飼養區小鼠微生物檢測Table 2 Microbiological mornitoring of mice in barrier breeding area and micro-barrier breeding area

2.3 設施使用便捷度

設施自運行后，平均每天人員進出頻次約為10次。統計設施運行2年時間里使用屏障飼養區和微屏障飼養區的人員及其進出總次數見表3。由表3可知，平均每個季度使用屏障設施的人數約11人，而每個季度使用微屏障籠具的人數平均為37人；平均每個季度進入屏障設施的人員次數為92次，而每個季度進出微屏障的平均次數高達768次。上述結果說明使用和進入微屏障飼養區人員及次數明顯高于屏障飼養區。隨機記錄6位同時使用屏障和微屏障飼養區的實驗人員5次進入不同飼養區所需時間結果顯示：實驗人員進入屏障飼養區平均用時為（281±23）s，而進入微屏障飼養區平均用時僅為（74±4）s。進入屏障飼養區的耗時是微屏障飼養區4倍，說明進入微屏障飼養區更便捷。

表3 設施使用人員數及進出設施次數匯總Table 3 Summary of the number of laboratory personnel and times people came in and out

3 討論

業內習慣性地把屏障系統作為維持動物微生物等級不可或缺的基礎條件。屏障設施的建設成本和維持運行所需花費都比較高。同時，一旦屏障設施出現環境或動物微生物污染，往往隸屬于同一進排風系統的飼養單元都會被波及，且屏障設施復雜的進出要求也給使用者帶來了諸多不便。針對上述問題，本研究通過使用微屏障籠具在普通環境下進行清潔級小鼠的飼養和維持嘗試。

首先需要通過科學和規范化的管理來控制微屏障飼養區的環境。定期的環境落下菌檢測結果表明，通過合理規范的消毒、打掃和環境控制可以實現環境落下菌的可控。雖然，微屏障飼養區微屏障籠具所處的飼養間出現過環境落下菌超過國家標準規定數值范圍的情況，但微屏障籠具內的環境落下菌數始終是符合國家標準要求的（圖3）。

設施內動物攜帶微生物情況是區分普通級、清潔級和SPF級的核心指標。在連續兩年的不間斷動物飼養過程中，通過外送哨兵鼠或隨機抽取微屏障內的小鼠，按照每個季度檢測一次的8次檢測中，沒有檢出國家標準GB 14922.1—2001《實驗動物寄生蟲學等級及監測》和GB 14922.2—2011《實驗動物微生物學等級及監測》要求清潔級小鼠必須排除的10項病原微生物。送檢過程中，本研究還對國家標準SPF級約定必須排除的19項病原微生物進行檢測，結果分別檢出了嗜肺巴斯德桿菌和綠膿桿菌兩種病原微生物（表2）。由于尚未針對引進動物進行這兩種微生物抽檢，因此不排除引進時就攜帶的可能。嗜肺巴斯德桿菌和綠膿桿菌屬于條件致病菌，因其對多數科研實驗的結果無影響，美國和歐洲的實驗動物微生物質量標準中已經將其排除在SPF級小鼠必檢項目之外［7］。以上結果說明，結合科學有效的管理模式，從病原微生物防控角度看，普通環境下使用微屏障系統不僅可以維持清潔級小鼠的飼養，甚至可以實現SPF級小鼠的飼養。

另外，由于免除了各種復雜的工作服更換流程，實驗人員進出微屏障飼養區的時間要顯著低于屏障飼養區，因此使用者更愿意選擇在微屏障系統內開展動物實驗（表3）。此外，屏障飼養區使用的手術衣、褲、防靜電隔離服都是單次使用，會產生大量的清洗和消毒工作。微屏障飼養區僅需穿工作服進入，在不被污染的情況下可以一天一換或多天一換地重復使用，從而降低了輔助工作強度和工作量。

本研究證明，規范操作下的微屏障飼養體系可以輔助屏障設施降低實驗動物感染風險。屏障飼養區內飼養的動物會因實驗需求而從屏障飼養區里取出。多數情況下，取出后的動物就無法再返回屏障飼養區。在實踐中，多數動物設施都會準備一處普通環境作為暫養區繼續飼養這些動物，但這樣的操作也增加了動物被感染的風險。而使用微屏障籠具進行飼養可以在一定程度上解決這個問題。微屏障籠具的獨立性，可以將潛在的污染控制在一組籠具范圍內，有效地減少了病原微生物傳播的范圍和概率。

對于小規模的動物設施來說，微屏障系統在節能減排上也具有巨大優勢。以本實驗室兩處系統為例：建設屏障系統所需面積遠遠大于微屏障系統，但是屏障系統的飼養量卻低于微屏障系統；屏障開啟后，全新風系統需要24 h運行，其耗能要顯著高于只有空調和內置風機的微屏障籠具系統。

雖然有上述優勢，但本研究僅局限于小型動物設施，并用以開展小鼠輔助生殖和模型構建為主的教學和科研工作。該方法是否能夠在更大范圍的科學研究及教學和生產實踐中使用，還需進一步檢驗。需要強調，使用微屏障籠具飼養動物時，人員因素至關重要，要求管理者、動物看護人員和使用者嚴格按照SOP操作，以減少因操作不當帶來的污染風險。

[作者貢獻Author Contribution]

任琦負責實驗操作、數據收集整理、統計分析及論文寫作與修改；李艷東負責實驗操作、數據收集整理；孫強負責課題設計、論文寫作與修改。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。

[主編點評]

本文介紹的微屏障系統是一種空氣經過三級過濾的正壓屏障系統，配合EVC籠具、超凈臺等設備，可在普通環境下用于清潔級小鼠的飼養。研究結果為微屏障系統在某些特定場景下的應用提供了數據支撐。這是國內第一次介紹微屏障+EVC的小鼠飼養模式，具有一定的創新性。

總之，本文值得業內同行進一步交流與探討。