生物合成果膠酶的研究進展

朱孝霖，徐珂盼，羅雯，王怡，趙希岳，蔡志強*

常州大學藥學院（常州 213164）

果膠是一種天然復雜的糖類聚合物，在化學中，果膠被定義為是由α-1, 4共價鍵連接半乳糖醛酸單元組成的一種陰離子多糖。植物組織中的果膠常與纖維素或半纖維素等其他成分共價結合組成植物細胞壁，在植物的生長發育中發揮重要作用[1]。果膠常被用于酸奶制品、面包餡料，作為膠凝劑用于果醬、果凍。果膠按形態可劃分為3種，即果膠、原果膠和果膠酸[2]。

果膠酶屬于水解酶的一種，用于分解果膠物質，廣泛存在于高等植物和微生物中。在紡織、造紙、醫藥工業、廢水處理、動物飼料生產及原生質體融合等諸多領域應用廣泛[3]，特別地在果酒釀造中具有提高出汁率、加速澄清等重要作用，由于果膠酶進口較多，不僅增加生產成本，也使我國果酒生產技術受到制約，因此，自主研發出具有知識產權的果膠酶是目前各個行業中亟待解決的問題[4]。果膠酶分類方法較多，一般可以分為原果膠酶、果膠酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶[5]。Amin等[6]預計到2021年，果膠酶市場規?？蛇_3 550萬美元，而現有研究大多以微生物為主，也正是由于微生物生長條件簡單，生產酶周期短，而且具有產量高、效率高、酶活好等優點，因此也是工業產酶的首選。

隨著生物技術的進步，果膠酶的研究在工藝優化、分離純化、酶學性質、結構生物學和分子生物學等方面取得突破性進展[6]，也在盡可能滿足我們對果膠酶日益增長的需求量，因此，著重對產果膠酶菌株篩選、誘變、生物合成、固定化果膠酶內容進行綜述，對果膠酶廣闊前景進行展望，為商業規?；瘧?、拓展全新應用領域提供理論依據。

1 微生物果膠酶的研究

1.1 產果膠酶菌株的篩選

微生物是產果膠酶的重要來源，是否有高的果膠酶活，菌株的品質好壞是直接原因，因此近年來研究者在生產果膠酶的菌種選育方面也花費大量精力，其中從大自然篩選優質的野生菌株便是最常規的方法[7]。

Anju等[8]首次報道索諾芽孢桿菌生產果膠酶，從腐爛的水果和蔬菜中用碘液顯色方法從果膠瓊脂平板篩選出的7株果膠酶產生菌中，進一步確定索諾芽孢桿菌為最高效的菌株MPTD1，經液體深層發酵優化后最大酶活為2.43 U/mL。Akinyemi等[9]從尼日利亞拉各斯瀉湖中的腐爛木屑中分離出巨大芽孢桿菌、巴達維亞芽孢桿菌和擬芽孢桿菌，經深層發酵以果膠為底物，進行產果膠酶能力篩選，研究表明與其他2株篩選菌相比，擬芽孢桿菌產果膠酶活力最高。Saifur等[10]從韓國發酵食品泡菜中分離出產強堿的堿性果膠酶PNs31的枯草芽孢桿菌CBS31，使用碘-碘化鉀溶液染色、NaCl脫色方法進行篩選。羅群等[11]使用剛果紅染色、NaCl溶液脫色方法，篩選出透明圈/菌落直徑比值較大的高產果膠酶的黑曲霉。姜立春等[12]從腐爛水果中分離到1株產果膠酶的黃曲霉，使用果膠作為唯一碳源，結合盧戈氏碘液染色、生理鹽水脫色方法進行篩選。有研究通過溴酚藍法根據透明圈大小判定果膠酶活的大小，進而篩選出高產果膠酶的菌株；通過添加一定量CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），依據水解圈的大小來篩選高產果膠酶的菌株[5,11]。

1.2 產果膠酶菌株的常規育種

除了從大自然中篩選野生菌株生產果膠酶，將原始菌株經紫外誘變、化學誘變、脈沖等多種單一或者復合方法進行改變，獲得正向突變菌株，也是提高果膠酶酶活最常見的策略[12-13]。

車鑫[14]以Aspergillus terreusgxy12-2為出發菌株，通過紫外誘變中的輻射將能量傳遞到生物體內，使得生物體內各種分子發生電離、激發產生大量化學性質十分活躍的自由原子或自由基團，結合亞硝基胍誘變中烷化基團使DNA分子上的堿基及磷酸部分被烷化，導致DNA復制時堿基配對錯誤引起突變，從而篩選到A.terreusZH2-4和A.terreusZH2-11兩個正向突變菌株，與原始出發菌株相比，其誘變菌獲得的酸性果膠酶酶活分別提高到原來的1.45倍和1.02倍。張佰清等[15]通過脈沖方法誘變黑曲霉，獲取了高產果膠酶的正向突變菌株L9，與原始菌株相比，其果膠酶活力提高到182.22%±0.18%，可達192.67 U/mL。杜國軍等[16]也是采用復合誘變方法，即亞硝酸-紫外對黑曲霉HY-D3處理，獲得突變株HY-LL3，經過固態發酵優化，果膠酶酶活高達到3 124 U/g，與原始菌株相比，提高2.59倍。Rohena等[17]以黑曲霉YQ-13為出發菌株，結合紫外與氯化鋰復合誘變反復處理，使用碘液染色方法進行初篩，依據產酶能力進行復篩，最終獲得1株能夠穩定遺傳的正向突變菌株，其果膠酶活力為67.6 U/mL，比出發菌株提高2.44倍，經過響應面優化，果膠酶活力提高至92.1 U/mL。何海燕等[18]利用微波照射方法處理棘孢曲霉D80菌株，獲得1株正突變菌株DW75，與出發菌株D80相比，酶活提高2.47倍。由此可見菌株的常規誘變育種是一種有效提高果膠酶活力的普遍手段。

1.3 產果膠酶菌株的基因工程

除了通過常規的誘變菌株獲取正突變菌株來提高果膠酶生產，國內外研究學者還對果膠酶的分子生物學方面進行探究，從編碼果膠酶的基因入手，進行克隆、純化、高效表達等多種基因工程手段來進一步提高果膠酶酶活。

Rajulapati等[19]克隆耐熱梭狀芽孢桿菌來源的果膠甲酯酶基因至pET-28a，以大腸桿菌BL21為表達菌株，并添加異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷誘導重組蛋白表達，對其氨基酸序列進行分析，結果表明它與菊花歐文菌來源的果膠甲酯酶有38%同源性，而且重組Ct PME以可溶性蛋白形式表達，在SDS-PAGE凝膠上顯示1條分子量約35.2 kDa的單條帶，并結合最先進、最準確的方法MALDI-TOF MS分析其分子量，結果與凝膠顯示一致。劉曉肖等[20]以全基因合成的類芽孢桿菌來源的堿性果膠裂解酶基因為模版，設計引物經PCR擴增得到含預測的信號肽及不含預測信號肽的果膠酶基因，并在畢赤酵母GS115中分泌表達，自身預測信號肽PF的使用使得甲醇誘導144 h時酶活提高111.66%，又在PF信號肽基礎上對啟動子進行改造，使得酶活進一步提高51.47%，達到89.65 U/mL。Zhang等[21]克隆黑曲霉ZJ5果膠甲酯酶基因pME-zj5a，并成功在畢赤酵母中進行高效異源表達，且PMEZJ5A與CaCl2配合使用會提高菠蘿硬度。Zhong等[22]克隆篩選出的木質擬桿菌果膠甲基酯酶基因，并在大腸桿菌中進行異源表達，且PxPME與CaCl2復合使用會將菠蘿塊的硬度提高114%。何玉蘭等[23]從黑曲霉來源的果膠裂解酶基因（pelA、pelB、pelC、pelD、pelF）中成功篩選并克隆出2個高表達基因pelA和pelD，及相應黑曲霉轉化菌株SH2-PelA和SH2-PelD，并對轉化菌株進行發酵產酶工藝研究，結果表明在搖瓶發酵條件下最高酶活力分別為11 069.2和8 822.6 U/mL，在液體深層發酵條件下最高酶活力分別為65 148.8和35 670.0 U/mL，分別比搖瓶發酵酶活提高5.9倍和4.0倍，研究表明重組菌株的工業化大量生產酸性果膠裂解酶潛力。Sharma等[24]以農業廢棄物為底物，獲得堿性木聚糖酶活力415.22±18.50 IU/mL，堿性果膠酶活力為109.10±8.80 IU/mL，這也是首次提出在短發酵周期下，優化液體發酵條件，在接種物中利用木聚糖和果膠的粗提同時提高兩種堿性酶活性的方法。中國農業科學院飼料研究院首次報道從草酸青霉SX6中鑒定具有獨立催化結構域，新的28家族雙功能果膠酶，具有果膠甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶活性，與大多數真菌果膠甲酯酶相比，S6A對70% DM柑橘果膠具有較高的比活力（271.1 U/mg）[25-27]。綜上所述，基因工程改造是提高微生物所產果膠酶活的有效方法。

2 果膠酶固定化研究

生物酶一般都具有高催化活性、強底物專一性和對環境無污染的優點，如果果膠酶直接加入到工廠生產中，就很難再回收利用，所以在一定程度上提高生產成本。因此有研究通過探究固定化酶技術以提高回收利用率[28]。酶的固定化技術是通過物理或化學方法將游離酶和相應載體結合，從而增強酶的穩定性，加強保存運輸；同時又能將酶與底物分離，達到重復利用、降低成本的目的。常用的物理方法有吸附法、包埋法等；化學方法有共價鍵結合法、交聯法等。

Haneef等[29]為提高酶的催化性能，采用聚丙烯酰胺凝膠包埋的方法對果膠酶進行固定化，結果表明該方法不僅提高果膠酶的熱穩定性，而且也提高果膠酶在各行各業中重復利用的可能性，即使經過7次反應，果膠酶仍保持50%以上的初始活力。Saifur等[10]為提高分離菌株所產果膠酶應用的穩定性，將果膠酶

PNs31固定在海藻酸鈣珠中，且研究結果表明固定化酶在第2輪和第3輪的重復使用試驗中分別保持約83%和65%的相對活性。趙巖等經過掃描電鏡和紅外光譜驗證果膠裂解酶PpPel10a被成功固定化，研究采用殼聚糖-戊二醛交聯法對重組PpPel10a進行固定化，經過優化固定材料參數，確定殼聚糖濃度、戊二醛濃度及酶濃度分別為3%，4%和0.8 mg/g時，固定化酶的活性達到最高值，固定化率達87.3%，且結果表明固定化酶具有更寬的溫度和pH穩定性范圍。Papadaki等[28]固定化果膠酶的制備是通過包埋交聯法并結合超聲波作用，其研究結果表明在超聲波條件下果膠酶活性提高92.28%。漆丹萍等[30]研究發現在HPD-750樹脂上固定果膠酶后，仍得到相較游離果膠酶更廣泛的pH適用范圍和更好的熱穩定性，并且此固定化酶可以重復使用10次左右，提高酶的回收利用，降低生產成本。

3 結語與展望

生物類型催化劑是最綠色環保型的工業催化劑，而果膠酶因其良好性能而極具吸引力。自然界中的極端微生物因其廣泛的應用類別而非常適合工業應用，農用工業副產品是一個好的底物選擇[30]，固態發酵等發酵過程也是最可靠的。隨著生物技術的不斷進步，結合果膠酶研究現狀，對生物合成果膠酶方面進行深入探究，這無疑對工業生物技術領域來說是一個福音，因此仍需在以下幾點有所側重：

（1）如何通過有效的基因工程手段改造果膠酶的生產菌株。

（2）如何通過固定化技術高效結合果膠酶和載體，進而提高其回收利用率，并根據載體材料的不同，拓展果膠酶的全新應用領域。

（3）改進發酵工藝，高效提升果膠酶酶活，降低生產成本。

因此，我們應繼續深入研究果膠酶的一系列課題，為拓展其工業應用價值奠定基礎。