α-1-酸性糖蛋白1在肺癌中的表達及其生物學功能探究

王衛東,艾麗絲,詹 艷,王雪晴,孫 慧,龔永生,金艷霞*

(1.湖北師范大學生命科學學院食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室特色野菜良種繁育與綜合利用湖北省工程技術研究中心生物學國家級實驗教學示范中心,中國湖北 黃石 435002;2.武漢大學生命科學學院,中國湖北 武漢 430072;3.南京醫科大學附屬蘇州醫院,中國江蘇 蘇州 215008)

肺癌是較常見的原發性惡性腫瘤,發病率增長迅速,因其發病機制復雜、預防難、易轉移和復發,患者存活率很低。肺癌分為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中NSCLC占85%;根據組織亞型,NSCLC又分為肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)、肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)、大細胞癌 3 種類型[1～2]。LUAD 占肺癌病例的40%,來自于小的氣道上皮細胞和Ⅱ型肺泡細胞,具有侵襲性和快速致命性,總生存率低于5年,通常診斷為晚期時已擴散轉移;LUSC占肺癌病例的25%～30%,起源于肺中央支氣管上皮細胞中的早期鱗狀細胞;大細胞癌占肺癌病例的5%～15%[3]。雖然低劑量計算機斷層掃描(lowdose computed tomography,LDCT)用于肺癌篩查降低了肺癌患者死亡率,但晚期肺癌患者5年存活率仍不到15%[4]。研究表明,早期診斷可顯著提高肺癌患者5年存活率,腫瘤大小為21 mm的IA期肺癌患者術后5年生存率達92%[5]。但肺癌患者在早期階段無明顯癥狀,因而易漏診,發現時通常已為晚期,且其經治療后易復發,預后差。臨床上肺癌的治療藥物有順鉑及其衍生物、單抗藥物(如阿特珠單抗)、靶向藥物(如吉非替尼)等[6],但都有一定的副作用或低特異性,存在局限性。因此,肺癌的早診和治療仍是臨床迫切需要解決的重難點問題,早發現、早干預和早治療可有效降低死亡風險和改善預后。

前期研究中,我們運用定量蛋白質組學鑒定到α-1-酸性糖蛋白1(alpha-1-acid glycoprotein 1,AGP1)在早期NSCLC血清中表達下調,且能有效區分早期NSCLC和健康受試者,有望作為早診NSCLC的腫瘤標志物[7];將早期NSCLC患者外周血中的白細胞進行轉錄組測序,篩選到下調的AGP1蛋白,進一步研究發現早期NSCLC中AGP1表達下降受轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的調控,且 AGP 與 TGF-β 聯合診斷早期NSCLC的效果很好,曲線下面積(area under the curve,AUC)達到 0.985[8]。

AGP1又稱血清類黏蛋白1(orosomucoid 1,ORM1),是orosomucoid家族成員之一,該家族包括 ORM1(AGP1)和 ORM2(AGP2)[9]。AGP1 主要由肝臟合成并分泌到血液中,血液中的中性粒細胞也能分泌。AGP1含有201個氨基酸,相對分子質量為23.51 kD,其含有的多個糖鏈占總相對分子質量的45%[10],故在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)中AGP1蛋白的條帶大小約為44 kD。據報道,血清中AGP1有12～20種不同的糖型[11]。UniProt數據庫顯示,AGP1含有5個N-連接的GlcNAc 修飾位點,即 33、56、72、93 和 103 位點(https://www.uniprot.org/uniprot/P02763;2020-05-07)。AGP1是絲氨酸蛋白酶抑制劑,也是急性時相蛋白,是炎癥生物標記物之一,在炎癥或感染中AGP1血清濃度增加[12～13],AGP1與其他指標聯合可用于區分活動肺結核和潛伏肺結核感染[14]。Sumanth等[11]報道,血清中肝臟來源的AGP1(sAGP1)和中性粒細胞分泌的AGP1(nAGP1)肽段序列一致,但二者糖型不同,表現功能不同,sAGP1限制血小板反應性,nAGP1限制sAGP1的促炎作用。AGP1還是免疫調節蛋白,通過調節細胞因子發揮免疫調節功能[15]。Sumanth等[16]報道,AGP1上調巨噬細胞中MAPK信號。AGP1也可與納米粒子相互作用,既能保持蛋白質的天然活性,又可減少納米粒子的細胞毒性[17]。此外,AGP1可作為腫瘤的診斷和預后指標,例如用于早期乳腺癌的診斷[18]和胰腺癌的預后判斷[19]。Zhang等[20]用實時熒光定量PCR和酶聯免疫吸附測定發現,AGP1的表達水平在喉癌組明顯高于健康組,用于喉癌診斷的AUC值為0.92,靈敏度為78.80%,特異性為89.70%,并且其與喉癌進展相關,提示AGP1有潛力作為喉癌診斷的生物標志物。研究表明,AGP1的N-糖基化修飾在疾病中發生改變,具有很大的診斷和預后潛力,如用于Ⅱ型糖尿病的風險判斷[21]。Ayyub等[22]也報道,糖基化的AGP1可作為肺癌潛在的血清生物標志物。

然而,關于AGP1在肺癌中的研究報道較少。為進一步研究AGP1在肺癌的表達及其臨床意義,本研究通過生物信息技術分析AGP1在肺癌中的表達及與肺癌患者生存的關系,通過組織和血清樣本驗證AGP1在早期肺癌中的表達,最后通過分子細胞生物學技術探究過表達AGP1基因對肺癌細胞增殖的影響,以期為AGP1用于肺癌的生存評估或靶向AGP1的肺癌治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集和分離

所有患者及健康受試者樣本采集自南京醫科大學附屬蘇州醫院,收集的臨床樣本信息見表1。NSCLC患者通過LDCT和組織病理學分析確診,肺癌患者分期按照國際肺癌研究協會(International Association for the Study of Lung Cancer,IASLC)的第八版TNM分期系統進行分級。本實驗共收集了9例非腫瘤樣本(3例健康樣本和6例良性疾病患者)和6例NSCLC IA期患者的血清樣本?；颊哐逶谕饪剖中g前收集,采集的血液樣品于4℃400g離心20 min,隨后將血清按每管200 μL進行分裝,并立即凍存于-70℃備用。每份血清在使用前不超過兩次凍融。

表1 樣本信息Table 1 Sample information in this study

4對組織樣本在患者手術過程中收集,癌旁組織距離癌組織2 cm。組織樣本采集后液氮速凍,立即置于-70℃凍存備用。組織樣本先在6孔板中用滅菌的剪刀剪碎,加入含苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)(Sigma-Aldrich公司,德國)的RIPA裂解液和陶瓷珠,隨后在全自動樣品快速研磨儀中研磨60 s,共研磨5次。冰上放置30 min后,12 000 r/min離心10 min,收集的上清液即為組織勻漿的蛋白質提取物。

1.2 數據庫分析與統計

運用GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/;2020-05-07)分析AGP1基因在肺癌中的表達。運用cBioPortal數據庫(http://cbioportal.org/;2020-05-07)分析AGP1基因在肺癌中的DNA改變情況。用STRING數據庫(https://string-db.org/;2021-01-24)分析AGP1與其他蛋白質的相互作用關系,探究AGP1在肺癌中表達變化可能涉及的調控機制。運用蛋白質數據庫(Human Protein Atlas,HPA;https://www.proteinatlas.org/;2021-01-24)和SPSS軟件(v26.0)統計分析AGP1表達與早期肺癌患者生存的關系。運用Kaplan-Meier Plotter數據庫(https://kmplot.com/analysis/;2021-01-24)分析AGP1表達與肺癌患者生存的相關性。蛋白質印跡條帶經Image J軟件進行量化分析后,再用GraphPad Prism軟件(v8.0)中非配對的t檢驗進行統計分析,P＜0.05被認為有顯著差異。

1.3 目的基因AGP1的擴增

從人cDNA文庫中獲取AGP1的cDNA(cDNA模板由武漢大學生命科學學院孫慧教授贈送),以此為模板進行PCR擴增。上游引物為5′-TGTACCAGACTACGCTGGCCGGCCAGAATTCatggcgctgtcctgggttcttac-3′,下游引物為 5′-TCTACGTAATACGACTCACTATAGTTCTAGActaggattccccctcctcctg-3′,引物訂購于武漢擎科生物科技有限公司。上游引物中引入EcoRⅠ酶切位點(GAATTC),下游引物中引入XbaⅠ酶切位點(TCTAGA)。擴增條件:98℃預變性5 min,然后以98℃變性15 s、60℃復性15 s、72℃延伸30 s進行35個循環,最后72℃延伸5 min。

1.4 過表達載體的構建

采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增后的產物條帶,隨后切膠,用膠回收試劑盒(No.D2500-01-100T,OMEGA公司,美國)回收PCR產物;同時,將帶有HA標簽的空載質粒pCS2-HA用EcoRⅠ、XbaⅠ于37℃雙酶切過夜,回收酶切產物;雙酶切產物(空載體)和基因片段(AGP1基因)用重組克隆酶(2×MultiF Seamless Assembly Mix,武漢愛博泰克生物科技有限公司)在50℃連接15 min;連接產物轉化到DH5α感受態細胞中,挑取大小適宜、邊緣光滑的單菌落進行菌液PCR鑒定,篩選陽性克隆,并由武漢擎科生物科技有限公司測序。將測序比對正確的克隆擴大培養,用無內毒素質粒提取試劑盒(No.CW2105,北京康為世紀生物科技有限公司)提取過表達質粒,儲存于-20℃備用。

1.5 細胞培養及轉染

用含10%Gibco胎牛血清的DMEM培養基培養肺癌細胞 A549、H157、SK-LU-1、H1299 和H1975,以及其他細胞如293T細胞、肝癌細胞Hep G2、宮頸癌細胞HeLa和乳腺癌細胞MCF7,培養箱條件:37℃、5%CO2,用胰酶消化傳代。所有細胞均由武漢大學生命科學學院孫慧教授贈送。

收集處于對數生長期的A549細胞和H157細胞,分別重懸,A549細胞按每孔3.00×105個種植于6孔板中,H157細胞按每孔2.45×105個種植于6孔板中;待6孔板中細胞密度達到80%～90%時,用Highgene轉染試劑(No.RM09014,武漢愛博泰克生物科技有限公司)進行轉染。

1.6 Western-blot檢測

收集6孔板中轉染后的細胞,用預冷的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌兩次,加入含0.20 mmol/L PMSF的RIPA裂解液,冰上裂解30 min,隨后12 000 r/min離心10 min,吸取上清至新管中。用BCA試劑盒(Thermo Fisher公司,美國)于562 nm處測定蛋白質濃度。上樣的蛋白質樣品經15%SDS-PAGE電泳后,在300 mA電流下轉膜45 min;膠中蛋白質條帶轉移到聚偏氟乙烯[poly(1,1-difluoroethylene),PVDF]膜(Merck Millipore公司,德國)上后,用5%脫脂牛奶封閉過夜。洗膜3次,室溫孵育AGP1抗體(1∶2 000稀釋,武漢三鷹生物技術有限公司)和GAPDH抗體(1∶10 000稀釋,武漢三鷹生物技術有限公司)1 h;洗膜3次,室溫孵育羊抗兔HRP-IgG二抗(1∶5 000稀釋,武漢三鷹生物技術有限公司)或羊抗鼠HRP-IgG二抗(1∶5 000稀釋,武漢三鷹生物技術有限公司)1 h;洗膜3次后顯影,用Vilber FUSION FX7化學發光成像儀拍照。

1.7 CCK-8檢測細胞增殖實驗

取對數生長期的A549細胞和H157細胞,重懸成單細胞懸液,種植于96孔板中,A549細胞每孔種植5.00×103個,H157細胞每孔種植4.08×103個,過夜培養12 h后轉染過表達AGP1基因的質粒,繼續培養24 h,然后每孔加入10 μL CCK-8試劑(Dojindo),放在培養箱中孵育,每隔30 min用酶標儀檢測450 nm處的吸光度。將所測的值用Excel表按如下公式計算:細胞增殖率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%,并用GraphPad Prism軟件(v8.0)進行數據分析,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 AGP1在肺癌中的表達

采用GEPIA數據庫分析AGP1在肺腺癌(LUAD)和肺鱗癌(LUSC)中的表達,結果顯示,相對正常肺組織樣本,AGP1的mRNA表達水平在LUAD樣本(n=483)中無明顯差異,但在LUSC樣本(n=486)中顯著下調(圖1A)。進一步的臨床樣本Western-blot檢測結果顯示,與癌旁組織相比,NSCLC患者肺癌組織中AGP1蛋白的表達水平下降,但無顯著差異(P=0.08)(圖1B和1C);而相對于非腫瘤(non-tumor)樣品,早期NSCLC(stage IA)患者血清中AGP1蛋白的表達顯著下降(圖1D和1E)。

圖1 AGP1在肺癌中的表達水平(A)用GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析肺腺癌和肺鱗癌組織中AGP1 mRNA表達水平。紅色表示腫瘤組織(T),灰色表示正常組織(N)。TPM,transcripts per million。參數設置:|log2(變化倍數)|閾值:1;P值閾值:0.01;log scale:是,用log2(TPM+1)表示;Jitter大小:0.4;匹配正常數據:匹配TCGA數據庫中正常樣本和GTEx數據;(B)蛋白質印跡法檢測肺癌患者組織中AGP1蛋白表達水平。15 μg組織裂解液上樣到15%的SDS-PAGE中,轉膜后分別用AGP1和GAPDH一抗孵育,再用HRP-IgG二抗孵育,曝光時間5 s,最后顯示的條帶用Image J軟件進行分析。PN,患者癌旁組織;PT,患者腫瘤組織;(C)統計分析肺癌組織中AGP1表達水平;(D)蛋白質印跡法檢測肺癌患者血清中AGP1蛋白表達水平。5 μg血清蛋白上樣到15%SDS-PAGE中,轉膜后用AGP1一抗孵育,再用HRP-IgG二抗孵育,曝光時間5 s,最后顯示的條帶用Image J軟件進行分析;(E)統計分析AGP1在肺癌患者血清中的表達。數據用平均值±標準誤表示,*P＜0.05。Fig.1 The expression level of AGP1 in lung cancer(A)Analysis of the AGP1 mRNA expression levels in LUAD and LUSC tissues by GEPIA database(http://gepia.cancer-pku.cn/).Red represents tumor(T)tissues and gray represents normal(N)tissues.TPM,transcripts per million.Parameter settings:|log2(fold change)|cutoff:1;P-value cutoff:0.01;log scale:Yes,and the log2(TPM+1)was used for log-scale;Jitter size:0.4;Matched normal data:Match TCGA normal and GTEx data;(B)Detection of the AGP1 expression levels in tissues of lung cancer patients by Western-blot.The tissue lysates(15 μg)were loaded to 15%SDS-PAGE.After transferred onto the PVDF membrane,the blots were probed with anti-AGP1 and-GAPDH antibodies,and then incubated with HRP-IgG secondary antibody.The exposure time was 5 s.Band intensities were analyzed by Image J software.PN,paracancerous tissues in patient;PT,tumor tissues in patient;(C)Statistics analysis of AGP1 expression in lung tissues;(D)Detection of the AGP1 expression levels in sera of lung cancer patients by Western-blot.5 μg of proteins from sera were loaded to 15%SDS-PAGE and transferred onto the PVDF membrane.The blots were probed with anti-AGP1 antibody,and then incubated with HRP-IgG secondary antibody.The exposure time for blots was 5 s.Band intensities were analyzed by Image J software;(E)Statistics analysis of AGP1 expression in sera of lung cancer patients.The statistics data are expressed as mean± standard error.*P＜0.05.

2.2 AGP1表達與肺癌患者生存的相關性

利用HPA數據庫和SPSS統計分析AGP1表達與NSCLC生存的關系,結果顯示,AGP1低表達肺癌患者的存活時間要比AGP1高表達肺癌患者的存活時間更短。在肺癌發生早期(IA期),AGP1 mRNA表達水平的FPKM(fragments per kilobase million)臨界值(cutoff)為0.60,高于0.60的肺癌患者(n=150)生存時間長,低于0.60的肺癌患者(n=50)生存時間短,但兩者間沒有顯著差異(P=0.37)(圖2A)。進一步利用Kaplan-Meier Plotter數據庫分析AGP1表達與肺癌患者生存的關系,生存曲線顯示,AGP1低表達的肺癌患者(n=1 075)的中位生存時間為64.10個月,高表達AGP1的肺癌患者(n=850)的中位生存時間為72.33個月,差異具有顯著性(P=0.03)(圖2B),該結果同樣表明AGP1低表達的肺癌患者生存率更低。

圖2 肺癌中AGP1表達與生存的相關性分析(A)AGP1表達與早期肺癌患者生存的相關性分析。數據來源于HPA數據庫,用SPSS 26.0軟件進行數據分析;(B)AGP1表達與所有肺癌患者生存的相關性分析,數據來源于Kaplan-Meier Plotter數據庫。Fig.2 Correlation analysis of AGP1 expression and survival in lung cancer(A)Correlation analysis between AGP1 expression and the survival of early lung cancer patients.The data was derived from HPA database and analyzed by SPSS software(v26.0);(B)Correlation analysis between AGP1 expression and the survival of all lung cancer patients.The data was derived from Kaplan-Meier Plotter database.

2.3 肺癌細胞株中AGP1蛋白的表達

利用HPA數據庫分析AGP1在細胞水平的表達(https://www.proteinatlas.org/ENSG00000229314-ORM1/cell;2020-05-07),結果顯示,AGP1 mRNA在肺癌細胞株A431和A549中的表達水平較低。我們也檢測了培養的5種肺癌細胞株A549、SKLU-1、H1299、H157和H1975,以及 4種其他非肺癌細胞株如293T細胞、肝癌細胞Hep G2、宮頸癌細胞HeLa和乳腺癌細胞MCF7中AGP1的表達水平,結果表明AGP1蛋白在上述5種肺癌細胞株中的表達量也相對較低(圖3)。

圖3 蛋白質印跡法檢測細胞中AGP1的表達10 μg細胞裂解液和3 μg非腫瘤樣品的血清蛋白上樣到15%SDS-PAGE中,轉膜后分別用AGP1和GAPDH一抗孵育,再用HRP-IgG二抗孵育,曝光時間是30 s。Fig.3 Detection of AGP1 expression in cell lines by Western-blotThe cell lysates(10 μg)and sera(3 μg)from non-tumor samples were loaded to 15%SDS-PAGE.After transferred onto the PVDF membrane,the blots were probed with anti-AGP1 and-GAPDH antibodies,respectively,and then the blots were incubated with HRP-IgG secondary antibody.The exposure time was 30 s.

2.4 過表達AGP1基因對NSCLC細胞增殖的影響

將AGP1基因過表達載體pCS2-HA-AGP1分別轉染到LUAD細胞A549和LUSC細胞H157中,采用Western-blot檢測AGP1蛋白的表達。結果顯示,與空載對照組相比,過表達轉染組的AGP1蛋白表達量顯著增加,表明AGP1基因在NSCLC細胞中成功實現過表達(圖4A)。

運用CCK-8試劑檢測AGP1過表達對A549和H157細胞增殖的影響,結果顯示,過表達AGP1基因可顯著抑制A549和H157細胞的增殖(圖4B和4C)。

圖4 過表達AGP1基因后肺癌細胞A549和H157的增殖情況(A)蛋白質印跡法檢測肺癌細胞中AGP1的表達。10 μg細胞裂解液上樣用于蛋白質印跡檢測;(B)AGP1基因過表達24 h后CCK-8實驗檢測肺癌細胞A549和H157的增殖情況;(C)AGP1基因過表達48 h后CCK-8實驗檢測肺癌細胞A549和H157的增殖情況。采用非配對的t檢驗在GraphPad Prism(v8.0)中對數據進行統計分析,*P＜0.05。Fig.4 The proliferation of both A549 and H157 cells after overexpression of the AGP1 gene(A)Detection of AGP1 expression in lung cancer cells by Western-blot.10 μg of cell lysates were loaded to 15%SDS-PAGE and used for Western-blot detection;(B)Detection of proliferation in A549 and H157 cells after overexpression of AGP1 for 24 h with CCK-8 kits;(C)Detection of proliferation in A549 and H157 cells after overexpression of AGP1 for 48 h with CCK8 kits.The statistics data were analyzed by unpaired t-test using GraphPad Prism(v8.0).*P＜0.05.

2.5 生物信息學分析AGP1基因改變和AGP1互作蛋白質

運用cBioPortal數據庫中1 144例肺癌樣本分析NSCLC患者AGP1表達下降可能的原因,發現肺癌中AGP1基因總的改變率是1.10%,其中LUAD中的突變比例是0.91%,擴增比例是0.30%,缺失比例是0.30%;LUSC中的突變比例是0.41%,缺失比例是0.21%(圖5A)。因此,DNA水平的改變可能是AGP1表達水平降低的原因之一。

進一步的STRING網站分析顯示,AGP1蛋白可與多種蛋白質發生相互作用,包括白蛋白(albumin,ALB)、纖維蛋白原γ鏈(fibrinogen gamma chain,FGG)、α2-巨球蛋白(alpha-2-macroglobulin,A2M)、纖維蛋白原β鏈(fibrinogen beta chain,FGB)、纖維蛋白原α鏈(fibrinogen alpha chain,FGA)、富含組氨酸糖蛋白(histidine-rich glycoprotein,HRG)、胎球蛋白 A(human alpha-2-HS glycoprotein,AHSG)、絲氨酸蛋白酶抑制劑A1(serine protease inhibitor A1,SERPINA1)、血清類黏蛋白2(orosomucoid 2,ORM2)和觸珠蛋白(haptoglobin,HP)(圖 5B)。

圖5 AGP1基因改變和AGP1互作蛋白質分析(A)cBioPortal數據庫(http://cbioportal.org/)分析AGP1基因中DNA的改變頻率;(B)STRING數據庫(https://string-db.org/)分析與AGP1相互作用的蛋白質網絡。物種:人。Fig.5 Analysis of the AGP1 expression change and interaction protein with AGP1(A)Analysis of the DNA change in AGP1 gene in lung cancer by cBioPortal database(http://cbioportal.org/);(B)Analysis of the protein-protein network that interacts with AGP1 by STRING database(https://string-db.org/).Organism:Homo sapiens.

3 討論

本團隊前期經免疫組織化學和Western-blot實驗發現AGP1蛋白在早期NSCLC組織和血清中表達水平下降,提示AGP1有望作為新的血清腫瘤標志物用于NSCLC早期診斷[7～8],但AGP1在肺癌發生中的具體作用以及可否用于肺癌預后判斷還不清楚。本研究通過生物信息學分析發現,AGP1在LUSC中轉錄水平顯著下降,在LUAD中無明顯差異表達(圖1A);進一步的Western-blot分析也證實,AGP1在早期肺癌組織和血清中表達下降(圖1B～D)。文中cBioPortal數據庫的分析結果提示,AGP1在兩種肺癌中的表達水平不同可能是由于AGP1在LUAD和LUSC中的DNA改變頻率不同(圖5A),但這仍需臨床樣本進行實驗驗證。前期我們團隊還報道了AGP1蛋白在63例晚期NSCLC患者血清中的表達水平,發現晚期時AGP1表達水平恢復[8];肺癌動物模型中的實驗也證明AGP1蛋白在肺癌晚期表達水平回復[7～8],這些表明AGP1只在早期NSCLC較短的一個窗口期呈現表達水平下降,可能與腫瘤發生復雜的調控有關。此外,據研究報道,腺癌和鱗癌發展的細胞來源不同,且不同的基因通過調控不同的信號通路驅動腫瘤細胞發生[3];Li等[23]也報道,與LUAD預后相關的基因并不與LUSC預后相關,表明AGP1在LUAD和LUSC中表達變化不同可能與腺癌和鱗癌本身也有關。Luo等[10]報道,AGP1基因的表達主要受糖皮質激素、白細胞介素(interleukin,IL)-1、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-6等因子的綜合調控。我們通過蛋白質互作分析發現,AGP1蛋白與急性時相蛋白HP、ORM2和絲氨酸蛋白酶抑制劑SERPINA1有相互作用(圖5B),而HP蛋白β鏈被報道也可作為NSCLC的血清診斷標志物[24]。TGF-β通過誘導NSCLC的上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),促進腫瘤的侵襲和轉移[25]。Smad4是TGF-β信號通路的重要組成部分,在TGF-β誘導NSCLC的EMT中發揮重要作用[26]。我們前期研究也發現,肺癌患者血清中AGP1表達下降可能是TGF-β/Smad通路調控中性粒細胞中AGP1的表達導致[8]。因此,TGF-β/Smad通路及與HP蛋白的相互作用可能是AGP1參與肺癌發生的機制之一,但仍需更多的實驗驗證?？偟膩碇v,本研究結果為AGP1參與肺癌發生提供了參考依據。

Yokobori等[27]報道,巖藻糖基化修飾的AGP可作為肺癌患者經納武單抗免疫治療后的預后評價指標。有研究指出,血清AGP可作為NSCLC患者服用多烯紫杉醇后中性粒細胞減少的預測指標[28];Bruno等[29]也報道,AGP可作為多烯紫杉醇治療NSCLC患者的預后生存判斷指標,可作為療效的獨立預測因子。本研究發現,AGP1的表達與肺癌患者生存有關,低表達AGP1的肺癌患者其生存率更短(圖2),表明AGP1有作為肺癌預后判斷指標的潛力,具有重要臨床價值。

雖然肺癌的治療效果在臨床上已有較大改善,但肺癌總體生存率較低。當前,已有許多研究報道肺癌的治療策略和療效評價,如:血清中表面活性蛋白D(surfactant protein D,SFTPD)通過封閉配體與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的結合抑制EGFR信號通路,可用于臨床EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療效果的評估指標[30～31];galectin-3可作為肺癌治療的藥物靶標[32～33];β-糖可用于原發和轉移性肺癌的治療[34]。Wang等[35～36]報道,AGP1蛋白可分別與布加替尼(brigatinib)和塞立替尼(ceritinib)相互作用,用于漸變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)陽性的晚期NSCLC患者的治療。本研究發現,過表達AGP1基因可抑制NSCLC細胞的增殖(圖4),表明AGP1參與NSCLC的發生發展。

綜上所述,AGP1在LUSC中轉錄水平下降,在早期肺癌組織和血清中也表達下降,這可能是其DNA頻率改變或信號通路調控變化導致,但具體機制仍需進一步探究;AGP1的表達與肺癌患者生存有關,低表達AGP1的肺癌患者其生存率更短,表明AGP1有望作為肺癌預后判斷指標;過表達AGP1基因可抑制NSCLC細胞的增殖,暗示AGP1有望作為肺癌治療的一個靶點。本研究闡明了AGP1在肺癌中的表達改變、生物學功能和臨床意義,為AGP1可能用于肺癌診斷、生存評估和治療靶點提供了科學依據和數據支持。