植物免疫激酶AtCERK1的重組表達與結晶研究

牛成群,楊芷茜,林 潔,明振華

(廣西大學生命科學與技術學院亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室廣西甘蔗生物學重點實驗室,中國廣西 南寧 530004)

為抵御自然界病原微生物的侵染,植物在漫長進化過程中,形成了特有的兩道免疫防線[1]。第一道免疫防線是病原體相關分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)觸發的免疫反應(PAMP-triggered immunity,PTI)[2],該免疫反應一般是通過位于植物細胞表面的模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)識別PAMPs,并將免疫信號傳遞至細胞內[3～5],最終引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量上升、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的磷酸化、內質網膜上離子通道的激活、胼胝質的沉積、生長抑制和防御相關基因的表達等免疫相關反應[6];第二道免疫防線是病原微生物逃逸PTI過程中產生的效應因子所觸發的免疫反應(effectortriggered immunity,ETI)。觸發該免疫反應的是病原微生物向宿主植物細胞注入的毒力因子(virulence factors),也被稱為效應因子(effector molecules),這類毒力因子通過對PTI途徑的關鍵信號組分進行修飾、降解、結合或者活性調控,抑制植物的PTI[7]。毒力因子對宿主細胞的破壞作用如果被定位在植物細胞內的抗性蛋白(R蛋白)所感知,一般會引起劇烈的免疫防御反應(通常伴隨超敏反應)[8～9]。

CERK1(chitin elicitor receptor kinase 1)是植物細胞膜上存在的一種類受體激酶(receptor-like kinase,RLK),因其可以感知真菌細胞壁含有的幾丁質并磷酸化下游蛋白質引發免疫反應而被發現并命名,在植物感知并抵御真菌侵染方面有重要作用[10～13]。同時,CERK1在介導植物與共生真菌互作過程中發揮關鍵作用[14]。CERK1在擬南芥、水稻、人、小鼠等物種內廣泛存在,并具有較高的同源性[15]。CERK1識別的PAMPs或共生因子包括真菌幾丁質、細菌肽聚糖、真菌線性β-1,3-葡聚糖和菌根真菌的共生因子等微生物來源的N-乙酰葡萄糖胺多聚物[16～17]。根據蛋白質與細胞膜的相對位置,CERK1可分為3個組成部分:細胞外負責感知PAMPs的LysM結構域[18]、跨膜疏水性結構域、細胞內負責磷酸化下游蛋白質的絲氨酸/蘇氨酸激酶區(kinase domin,KD)結構域[19]。在擬南芥中,AtCERK1胞外結構域一般通過組成同源二聚體[20],或和LYK5胞外區組成異源二聚體來感知PAMPs[21]。AtCERK1胞外LysM結構域感知真菌幾丁質這一PAMP后[22],引發胞內KD區的自磷酸化及其對PBL27蛋白的轉磷酸化,隨后PBL27磷酸化MAPKKK5(MAPK kinase kinase 5),引起級聯免疫反應[23]。鑒于AtCERK1在識別和感知真菌幾丁質、將免疫信號傳遞至胞內并觸發PTI免疫反應中的重要性,一些病原菌通過分泌毒力因子攻擊AtCERK1途徑以實現免疫逃逸。例如,細菌Ⅲ型效應蛋白AvrPtoB可以特異識別并泛素化AtCERK1的KD區,進而靶向降解AtCERK1,使植物喪失由AtCERK1誘導引起PTI的能力[24]。目前,CERK1胞外感知幾丁質的機制已經比較清楚,但其如何發揮下游信號傳遞的功能及如何被AvrP-toB特異性修飾有待進一步探索,故CERK1胞內KD區的結構解析顯得尤為關鍵。

本課題旨在利用晶體學手段對AtCERK1胞內KD區進行晶體篩選以獲得高分辨率的蛋白質結構。實驗成功構建了AtCERK1的體外原核表達系統,并經純化獲得純度為95%以上的野生型及突變型蛋白質樣品,成功篩選到可以結晶的條件,經X射線檢測收集,獲得分辨率為3.2 ?的AtCERK1和ADP復合物的衍射數據,為該蛋白質進一步的結構與功能研究進行了實驗探索。

1 材料與方法

1.1 材料

AtCERK1胞內區原核表達載體pRSFDuet1-CERK1為實驗室構建;大腸桿菌BL21感受態購于北京全式金生物技術股份有限公司;LB培養基、卡那霉素(kanamycin,Kana)、誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)購于北京索萊寶科技有限公司;質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司;蛋白質純化相關試劑:鎳柱(Ni NTA beads)、陰離子交換柱(Capto Q)和Superdex75分子篩,購于GE Healthcare公司(美國);蛋白質結晶相關試劑:結晶試劑盒(包括 Index、Crystal screen1&2、Sa-ltRx1&2、Natrix1&2、PEGRx1&2 和 PEGion1&2)購于Hampton Research公司(美國),防凍液相關試劑乙二醇(ethylene glycol,EG)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)和NaCOOH購于Sigma公司(美國)。

1.2 溶液的配制

AtCERK1純化緩沖液:稱取2.423 g三羥甲基氨基甲烷(trihydroxymethyl aminomethane,Tris)、0.681 g咪唑和8.766 g NaCl于Ⅰ級水中,用HCl調節pH到8.0,隨后用Ⅰ級水定容至1 L,過濾除菌后4℃儲存備用(Buffer 1);稱取8.000 g NaCl、0.200 g KCl、1.440 g Na2HPO4、0.240 g KH2PO4和0.681 g咪唑,用HCl調節pH到8.0,隨后用Ⅰ級水定容至1 L(Buffer 2,即PBS緩沖液);稱取2.423 g Tris、20.424 g咪唑和8.766 g NaCl于Ⅰ級水中,用HCl調節pH到8.0,隨后用Ⅰ級水定容至1 L,過濾除菌后4℃儲存備用(Buffer 3,即洗脫緩沖液)。

AtCERK1離子交換緩沖液:稱取2.423 g Tris于Ⅰ級水中,用HCl調節pH到8.0,隨后用Ⅰ級水定容至1 L,過濾除菌后4℃儲存備用(Buffer A);稱取2.423 g Tris、58.440 g NaCl于Ⅰ級水中,用HCl調節pH到8.0,隨后用Ⅰ級水定容至1 L,過濾除菌后4℃儲存備用(Buffer B)。

AtCERK1凝膠過濾緩沖液:稱取2.423 g Tris、0.406 g MgSO4·12H2O 和 8.766 g NaCl于Ⅰ級水中,用HCl調節pH到8.0,隨后用Ⅰ級水定容至1 L,過濾除菌后4℃儲存備用(Buffer C)。

1.3 生物信息學分析

擬南芥CERK1(AtCERK1)蛋白的CDS序列(NP_566689.2)從NCBI上查找并下載得到。使用TMHMM Server v2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0;2020-09-11)在線網站對蛋白質的跨膜結構域進行預測以確定蛋白質邊界。使用Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index;2020-09-11)在線網站對AtCERK1的二級結構進行預測。利用ExPASy網站的在線工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/;2020-09-18)預測AtCERK1的等電點(isoelectric point,PI)、相對分子質量等理化性質。利用HHpred(https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred;2020-11-20)在線網站搜索PDB數據庫里已經解析出的同源性高的蛋白質結構用于分子置換結構解析。

1.4 AtCERK1的野生型及突變型構建

經由PCR獲得AtCERK1(301～599)的目的基因(引物序列見表1),PCR產物采用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳,隨后經膠回收分離純化出所需目的基因片段。用EcoRⅠ和XhoⅠ分別對目的基因和pRSFDuet1載體進行雙酶切,酶切產物采用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳,分別分離純化出酶切后具有相同黏性末端的AtCERK1(301～599)和pRSFDuet1片段。用T4 DNA連接酶于16℃進行連接,2 h后連接產物轉入DH5α感受態細胞中,冰上靜置30 min,經42℃熱激90 s后再次靜置于冰上5 min,37℃、210 r/min培養1 h后涂于含Kana抗性的LB固體平板上,倒置放入37℃恒溫培養箱,等待14～16 h。挑取單克隆于含Kana的LB液體培養基中,37℃培養6～8 h,用質粒小提試劑盒提取質粒,用EcoRⅠ和XhoⅠ快切酶進行雙酶切驗證,取陽性樣本送到廣州睿博生物科技有限公司進行測序。

表1 質粒構建所需的引物Table 1 Primers used for construction of plasmids

基于重疊延伸PCR技術進行點突變擴增,獲得未甲基化的突變重組質粒AtCERK1F460V和At-CERK1K349R。用DpnⅠ酶(北京全式金生物技術股份有限公司)消化后,轉入DMT感受態(北京全式金生物技術股份有限公司)中,14 h后在LB固體培養板上挑取單克隆,接入LB培養基中培養,提取質粒后送往廣州睿博生物科技有限公司進行測序。

1.5 SDS-PAGE檢測

配置SDS-PAGE膠,將所制備樣品加入上樣孔里,120 V恒壓電泳1 h,考馬斯亮藍染色15 min,脫色過夜后進行拍照分析。

1.6 野生型AtCERK1蛋白的表達及親和層析純化

pRSFDuet1-CERK1質粒轉化至感受態細胞E.coli BL21(DE3)后,挑取菌落接種至含Kana(50 μg/mL)的10 mL LB培養基中培養6～8 h(37 ℃、210 r/min),接入1 L含有Kana的LB培養基中,振蕩培養至OD600到0.8(37℃、210 r/min)。加入誘導劑IPTG(終濃度0.5 mmol/L),16℃誘導20 h后,蛋白質表達完成。4 000 r/min離心15 min收集菌體,用 Buffer 1(20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑,pH 8.0)重懸,高壓破碎后離心1 h(4℃、12 000 r/min);取上清與鎳柱結合進行親和層析,Buffer 1沖洗30 mL后,取柱上樣品R,采用咪唑對純化的蛋白質進行梯度洗脫(10～70 mmol/L咪唑),并收集梯度洗脫樣品E10～E70,再由含300 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液(Buffer 3)進行洗脫,同時收集洗脫樣品E300。所有樣品采用SDSPAGE進行分析。

緩沖液純化效果比較:蛋白質表達完成后,用Buffer 1和Buffer 2(PBS緩沖液,10 mmol/L咪唑,pH 8.0)分別重懸菌體,高壓破碎后離心1 h(4℃、12 000 r/min)。取上清與鎳柱結合進行親和層析,收集柱上樣品R,用提高了咪唑濃度(20 mmol/L)的Buffer 1及Buffer 2對鎳柱進行洗雜,收集洗下的樣品E20。采用SDS-PAGE對收集的樣品進行分析。

1.7 AtCERK1的深度純化

離子交換層析:將用20 mmol/L咪唑洗雜、300 mmol/L咪唑洗脫的初步純化的AtCERK1蛋白濃縮到2 mL,置于冰上備用。陰離子交換柱(Capto Q)用 Buffer A(20 mmol/L Tris,pH 8.0)、Buffer B(20 mmol/L Tris、1 mol/L NaCl,pH 8.0)平衡,平衡程序為7.5%Buffer B,即用75 mmol/L NaCl平衡。將2 mL濃縮蛋白質和2 mL Buffer A混合進行降鹽處理,4℃、12 000 r/min離心10 min,去沉淀后通過5 mL Loop環上樣,同時收集樣品,等UV(ultraviolet)峰走平后,逐漸升高鹽濃度(20 min內從75 mmol/L升高到600 mmol/L),停止收集。取收集的樣品進行SDS-PAGE分析。

凝膠過濾層析:將離子交換層析純化到的蛋白質樣品濃縮到1 mL以下,置于冰上備用。分子篩柱(Superdex75)用 Buffer C(20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl,pH 8.0)平衡。將1 mL濃縮蛋白質樣品在4℃、12 000 r/min條件下離心10 min,去沉淀后通過1 mL Loop環上樣,并收集樣品,待UV峰平穩后,停止收集。取收集的樣品進行SDSPAGE分析。將分離純化的蛋白質進行濃縮,利用Nanodrop One紫外分光光度計進行蛋白質濃度測定。

1.8 突變型AtCERK1蛋白的純化

AtCERK1突變型的純化方案參考野生型,用20 mmol/L咪唑競爭性洗雜純化后,采用含300 mmol/L咪唑的Tris-NaCl緩沖液進行充分洗脫,隨后將洗脫蛋白質用Superdex75分子篩純化柱進行凝膠過濾分選。SDS-PAGE分析后進行蛋白質濃縮。

1.9 AtCERK1野生型及突變型的結晶條件篩選

經純化得到的野生型及突變型蛋白質均濃縮到10 mg/mL,分別與終濃度為5 mmol/L的ADP或ATP冰上孵育1 h。對每種蛋白質的3種不同狀態:單獨蛋白質、與ADP的復合物、與ATP的復合物,進行蛋白質晶體初步篩選。晶體初篩采用氣象懸滴擴散法進行,采用Hampton Research公司的6×96種晶體學條件:Crystal screen1&2、Index、PEGRx1&2、PEGion1&2、SaltRx1&2、Natrix-1&2,在硅化玻片上加入1 μL蛋白質溶液和1 μL池液(即試劑盒溶液),并將其混合,瓊脂密封好后將晶體板放置于16℃,每隔24 h在光學顯微鏡下觀察晶體生長情況。

1.10 晶體優化

有晶體初步析出后,對析出晶體的條件進一步優化,優化方案包括:1)4∶1優化。即把初篩條件中的池液改為4/5的量,加入1/5份其他條件的池液,以研究不同溶質組分對晶體生長的影響;2)梯度對拉優化。即把初篩得到的池液條件中所含的某一溶質成分按照線性梯度進行溶液的配置;3)添加劑及去垢劑優化。將1 μL蛋白質溶液加入1 μL池液,再加入0.2 μL添加劑或去垢劑。優化后每隔24 h觀察晶體。

1.11 晶體衍射分析

將晶體在顯微鏡下用合適直徑的帶底座晶體環撈取后,放置于提前準備好的防凍液(由原池液基礎上添加20%的甘油配置)中,脫水后迅速放入液氮中凍存。在上海同步輻射光源中心(Shanghai Synchrotron Radiation Facility,SSRF)大分子線站BL17U1進行晶體衍射。收集數據后用XDS處理并用軟件CCP4以及Phenix進行分子置換以及結構解析。

2 結果

2.1 AtCERK1的生物信息學分析

在NCBI上查找到AtCERK1的CDS序列,在TMHMM Server v2.0在線網站上對序列進行跨膜區域分析,從圖1的分析結果可知胞內區邊界為255～617。結合Phyre2的二級結構預測結果(圖2),刪除一些可能影響蛋白質結晶的柔性結構域,確定克隆邊界為301～599。在ExPASy上預測蛋白質的基本理化性質,得到AtCERK1的基本信息:AtCERK1由299個氨基酸組成,預測相對分子質量為33 kD,pI為6.22,消光系數Abs(0.1%=1 g/L)為 0.802。

圖1 AtCERK1全長的跨膜區域預測結果Fig.1 Transmembrane domain prediction of AtCERK1

圖2 AtCERK1胞內區的二級結構預測結果Fig.2 Secondary structure prediction of AtCERK1 intracellular region

2.2 野生型AtCERK1蛋白的表達純化

pRSFDuet1載體的融合表達蛋白在其N端帶有6個His標簽,故使用鎳柱親和層析進行第1輪蛋白質純化。分別選用Tris-NaCl緩沖液(Buffer 1)以及PBS緩沖液(Buffer 2)對誘導表達的菌體進行重懸,隨后進行高壓破碎、鎳柱親和層析純化。取勻漿液中的上清樣品(S)、沉淀樣品(P),以及用含20 mmol/L咪唑的不同緩沖液洗下的樣品(E20)和洗雜后與鎳介質結合的樣品(R),進行SDSPAGE分析。從圖3的電泳結果可知:在PBS緩沖體系(Buffer 2)下純化出的AtCERK1與鎳柱結合得更牢,不會輕易被低濃度咪唑洗脫,但最后留在鎳柱上的雜蛋白很多;而Tris-NaCl緩沖體系(Buffer 1)下純化出的AtCERK1蛋白只有兩條主要的雜蛋白需要去除,且與PBS緩沖體系(Buffer 2)相比,最后留在鎳柱的AtCERK1蛋白含量相差不大。綜合分析后選用Tris-NaCl緩沖液(Buffer 1)進行后續的純化實驗。

圖3 不同緩沖體系對AtCERK1初步純化的影響M:蛋白質分子量標準;P:沉淀樣品;S:上清樣品;R:介質樣品;Ex:咪唑洗脫樣品(x為咪唑濃度)。Fig.3 Effects of different buffers on purification of AtCERK1M:Protein marker;P:Precipitation sample;S:Supernatant sample;R:Medium sample;Ex:Imidazole elution sample(x represents the concentration of imidazole).

確定蛋白質純化的緩沖體系之后,為進一步探索洗脫蛋白質的咪唑濃度,用不含咪唑的Tris-NaCl緩沖液對誘導表達的菌體進行重懸,并進行高壓破碎和離心,上清與鎳介質結合后取樣品(R),同時,依次用含10～70 mmol/L咪唑的Tris-NaCl溶液洗滌鎳柱并收集洗脫樣品(E10～E70)。對上述樣品進行SDS-PAGE分析,從圖4的電泳結果可知:用20 mmol/L咪唑可競爭性洗脫大量雜蛋白。故后期的初步純化方案為含20 mmol/L咪唑的Tris-NaCl緩沖液洗雜,含300 mmol/L咪唑的Tris-NaCl緩沖液洗脫,這樣即得到初步純化的AtCERK1。

圖4 不同咪唑濃度對AtCERK1的純化效果M:蛋白質分子量標準;R:介質樣品;Ex:咪唑洗脫樣品(x為咪唑濃度)。Fig.4 Effects of different imidazole concentrations on purification of AtCERK1M:Protein marker;R:Medium sample;Ex:Imidazole elution sample(x represents the concentration of imidazole).

使用離子交換和凝膠過濾層析方法對初步純化的蛋白質進行進一步純化。利用陰離子交換柱(Capto Q)進行離子交換層析,純化結果如圖5所示:隨著鹽濃度的升高(紅色曲線為電導值,可表示鹽濃度),AtCERK1蛋白先被洗脫下來,隨后25 kD左右的一條雜蛋白才被洗脫下來,故離子交換層析處理可去除25 kD的一條主要的雜蛋白。取離子交換層析洗脫的目的蛋白液,濃縮后用Superdex75分子篩進行凝膠過濾層析,分離純化結果如圖6所示:絕大多數的雜蛋白會先從分子篩上洗脫下來,而目的蛋白AtCERK1主帶在11.5 mL處才開始被洗脫下來,對稱的峰形說明蛋白質比較均一。收集并濃縮AtCERK1的蛋白質溶液,得到高濃度、高純度的目的蛋白,以用于后續結晶實驗。

圖5 AtCERK1的離子交換層析(A)離子交換色譜圖;(B)對應的蛋白質凝膠電泳圖。Fig.5 Ion exchange chromatography of AtCERK1(A)The ion exchange chromatogram;(B)The protein gel electrophoresis diagram.

圖6 AtCERK1的凝膠過濾層析(A)凝膠過濾色譜圖;(B)對應的蛋白質凝膠電泳圖。Fig.6 Size exclusion chromatography of AtCERK1(A)The size exclusion chromatogram;(B)The protein gel electrophoresis diagram.

2.3 AtCERK1突變型的表達純化

用親和層析、凝膠過濾層析手段純化出針對植物免疫激酶的ATP結合位點設計的兩個突變型AtCERK1K349R和AtCERK1F460V。純化結果如圖7所示,突變型AtCERK1K349R和AtCERK1F460V的純度已達到結晶要求,故將其濃縮到10 mg/mL待用。

圖7 AtCERK1K349R(A)和AtCERK1F460V(B)的純化結果Fig.7 Purification of AtCERK1K349R(A)and AtCERK1F460V(B)

2.4 AtCERK1野生型和突變型的晶體篩選

除了單獨的野生型或突變型蛋白質,At-CERK1、AtCERK1F460V和 AtCERK1K349R還分別與終濃度為5 mmol/L的ATP或ADP冰上孵育1 h,以制備復合體樣品。將一共9種樣品進行蛋白質晶體初步篩選,在16℃恒溫培養3 d后,于顯微鏡下觀察到突變型AtCERK1F460V與ADP的復合物在PEGion1試劑盒的3號條件(0.2 mol/L氟化銨、20%PEG3350)出現蛋白質結晶,晶體呈金剛石狀(圖 8)。

圖8 AtCERK1F460V與ADP復合物的晶體Fig.8 Crystals of the AtCERK1F460V-ADP complex

2.5 AtCERK1F460V復合物晶體的衍射分析

晶體X射線衍射獲得的最高衍射分辨率為3.2 ?(圖9),具體數據資料見表2。利用HHpred搜索PDB數據庫里同源性最高的結構模型作為分子置換模版,可以得到正確的解。但由于晶體衍射分辨率不高,電子密度不理想,未來還需要對晶體篩選條件進行進一步優化。

表2 AtCERK1F460V與ADP復合物的X射線衍射數據Table 2 X-ray diffraction data of AtCERK1F460V-ADP complex

圖9 AtCERK1F460V與ADP復合物的X射線衍射圖譜Fig.9 X-ray diffraction pattern of the AtCERK1F460VADP complex

3 討論

植物的固有免疫分為PTI和ETI兩種類型,對植物生長發育和抗性至關重要。CERK1作為能夠特異性識別幾丁質類多糖分子并向細胞內傳遞信號觸發PTI免疫反應的模式識別受體,對植物抵御致病真菌和細菌感染至關重要。在擬南芥中,AtCERK1通過胞外LysM區識別幾丁質來感知真菌的侵染,然后由胞內激酶區通過磷酸化下游蛋白質PBL27傳遞信號,再由PBL27磷酸化MAPKKK5引起級聯免疫反應[25]。區段交換與嵌合體設計實驗表明,胞外區感知信號和胞內區傳遞信號是兩個相對獨立的過程[26],但目前AtCERK1胞內信號傳遞結構域的作用機理尚不清楚,因此,解析AtCERK的胞內激酶區結構,深入分析其信號激活與信號傳遞的分子機理,十分必要。

為了解析AtCERK1胞內激酶區的三維結構,首先需要對該蛋白質片段進行晶體學研究。本實驗針對AtCERK1蛋白的KD區基因片段序列,構建了E.coli-pRSF表達系統和兩種關鍵突變型,最終獲得3種純度在95%以上的蛋白質樣品,并通過與ATP底物或ADP產物組裝復合體,最終使用氣象懸滴擴散法成功獲得可以產生X射線衍射的蛋白質晶體。在本研究中,野生型AtCERK1析出的晶體經X射線衍射分辨率很低,在8～10 ?之間。我們猜想可能是受野生型AtCERK1酶活力的影響,其每個分子空間結構間不能很有規律的排布。之后的實驗中我們根據激酶經典的ATP結合位點(K)及關鍵催化位點(F)[27]進行突變,最終成功提高了蛋白質晶體的分辨率。蛋白質晶體學研究的難點是獲得高質量蛋白質晶體。激酶發揮功能的過程中酶先與ATP結合,將ATP中γ位的磷酸基團轉移到底物的羥基,最后釋放ADP。反應涉及酶與ATP結合以及酶與ADP結合的兩種過渡態,不同狀態下樣品的結晶能力有所差別[28]。為了提高AtCERK1胞內激酶區結晶成功率,我們將野生型和突變型蛋白質與ATP或ADP組裝復合體,最終成功實現了復合體結晶。復合體結晶比單獨蛋白質的結晶更有意義,解析蛋白質與小分子相互作用的細節有助于之后的研究深入理解其工作機理[29]。

在0.2 mol/L氟化銨、20%PEG3350條件下,突變型AtCERK1F460V和ADP的復合物成功析出晶體,經X射線衍射得到的最高分辨率為3.2 ?。衍射圖像分析顯示,晶體屬于P62空間群;晶胞參數是:a=119.47 ?,b=119.47 ?,c=69.30 ?,α=90.0°,β=90.0°,γ=120.0°。根據蛋白質的氨基酸數目,計算得到該晶體最有可能的馬修斯系數為2.12,暗示一個不對稱單位中可能有兩個復合體分子。初步的結構解析顯示,蛋白質電子密度不太理想,對比以往的研究分析[30],原因可能有:1)晶體是由大量微觀物質單元按一定規律有序排列的結構,衍射時,X衍射也是通過晶體內部原子有規律的排列才出現衍射點,而本研究中所獲得的蛋白質晶體析出的速度比較快,晶體內部原子堆積排列可能不規律;2)晶體結晶的條件仍需要進一步優化,例如:改變鹽離子、緩沖液成分、沉淀劑以及pH值,或者添加一些其他可能促進晶體質量的元素,或者用添加劑、去垢劑試劑盒進行優化等;3)防凍液沒有配置適宜,晶體質量在液氮環境中發生了退化。雖然劉婷婷等[31]解析出了CERK1胞外區的三維結構,但CERK1胞內結構一直沒有得到解析研究。因此,實驗最終成功拿到中等衍射分辨率的蛋白質晶體,是向解析CERK1激酶區的空間結構邁出的關鍵一步,為后續AtCERK1結構解析提供了重要信息和寶貴經驗。在后續的實驗中,課題組將繼續優化AtCERK1激酶區的蛋白質晶體,并在解析出結構后對其關鍵氨基酸殘基定向改造,以獲得酶活力更高、熱穩定性更強的重組酶分子,從而強化植物免疫,提高植物存活率及生長質量。