BAIAP2L2在肝癌中的表達及臨床意義

屈才浩,馬騰達,王 瑞,李曉梅,李玉民*

(1.蘭州大學第二醫院普外科,中國甘肅 蘭州 730030;2.甘肅省消化系腫瘤重點實驗室,中國甘肅 蘭州 730030)

2020年全球癌癥報告顯示,肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,其在全球腫瘤中發病率位居第6位,死亡率位居第4位[1]。目前,中國的肝癌患者5年生存率約14.1%[2]。雖然手術切除被認為是早期肝癌患者最佳的治療手段,但是術后高復發率,使得肝癌患者的總體預后仍然欠佳[3～4]。因此,尋找對肝癌診斷、治療及預后有效的新型生物標志物至關重要。

腦特異性血管生成抑制劑1相關蛋白2樣2(brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 2-like 2,BAIAP2L2)屬于 I-BAR(inverse Bin-Amphiphysin-Rvs)結構蛋白家族,是一種上皮特異性BAR結構域蛋白,在調節和誘導肌動蛋白膜突起的形成、細胞遷移和膜絲狀體的生成中起重要作用[5～8]。BAIAP2L2 也被稱為 Pinkbar,位于染色體22q13.1[6,9]。越來越多的研究表明,BAIAP2L2在肺癌、胃癌、前列腺癌等腫瘤中表達上調[9～11]。Xu 等[9]研究表明,BAIAP2L2 在肺癌中高表達,它不僅可通過雌激素介導的S期途徑促進癌細胞增殖和集落形成,而且還可減少癌細胞凋亡。Liu等[10]指出,BAIAP2L2在胃癌中高表達,并通過AKT/mTOR和Wnt3a/β-catenin信號通路調節癌細胞的增殖和轉移。在前列腺癌中,BAIAP2L2通過血管內皮生長因子和細胞凋亡信號通路促進癌細胞的增殖和遷移,并且增加了癌細胞的侵襲和惡性程度[11]。然而,BAIAP2L2在肝癌中的相關研究尚未見報道。本研究通過生物信息學方法,分析了BAIAP2L2在肝癌中的表達水平、診斷和臨床預后價值以及其中潛在的作用機制,旨在為BAIAP2L2作為肝癌診斷指標、治療靶點及預后標志物提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 數據來源

從TCGA數據庫[12](https://portal.gdc.cancer.gov/)下載肝癌mRNA-seq數據(肝癌樣本:n=374;癌旁樣本:n=50)、miRNA-seq 數據(肝癌樣本:n=375;癌旁樣本:n=50)、DNA甲基化數據(430例)及肝癌患者臨床資料(438例),下載時間為2021年4月。從ICGC數據庫[13](https://dcc.icgc.org/)下載肝癌mR-NA-seq數據(肝癌樣本:n=232;癌旁樣本:n=199)和臨床資料(431例),用于表達和生存分析的驗證,下載時間為2021年4月。

1.2 BAIAP2L2在腫瘤中的表達差異分析

運用TIMER數據庫[14](https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析BAIAP2L2在不同腫瘤中的表達水平。采用Wilcoxon秩和檢驗比較TCGA數據庫中肝癌及癌旁樣本之間BAIAP2L2的表達差異,并分析其在50例配對肝癌及其癌旁樣本中的表達水平。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線判斷BAIAP2L2對肝癌的診斷價值,并計算曲線下面積(area under the curve,AUC)。使用ICGC數據庫中相關肝癌數據驗證以上結果。通過HPA數據庫[15](https://www.proteinatlas.org/)中抗體染色細胞比例和染色強度的綜合評估,分析BAIAP2L2蛋白在肝癌組織及癌旁組織中的表達。

1.3 BAIAP2L2表達量與臨床病理特征的相關性分析

使用Wilcoxon秩和檢驗或Kruskal-Wallis檢驗比較不同臨床病理特征組間BAIAP2L2表達水平的差異,臨床病理特征包括年齡、性別、腫瘤組織學分級、TNM分期、甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)及存活狀態等。

1.4 BAIAP2L2表達水平與肝癌患者的生存分析

使用R軟件(版本4.0.3)提取肝癌患者臨床數據,移除生存狀態信息不完整的樣本并與BAIAP2L2表達數據合并。以肝癌患者腫瘤組織中BAIAP2L2表達的中位數為截斷值,將患者分為高、低表達兩組,用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,采用log-rank檢驗比較兩組之間的生存差異。同時,利用Kaplan-Meier Plotter數據庫[16](https://kmplot.com/analysis/)和GEPIA數據庫[17](http://gepia.cancer-pku.cn/)進一步驗證BAIAP2L2表達與肝癌患者生存的關系。此外,使用單因素Cox回歸計算所研究變量的風險比(hazard ratio,HR),采用多因素Cox回歸探索BAIAP2L2作為預后因素的獨立性,納入的變量包括患者年齡、性別、TNM分期和組織學分級。

1.5 BAIAP2L2表達與其拷貝數變異、甲基化及miRNAs的相關性分析

通過cBioPortal數據庫[18](http://www.cbioportal.org/)分析BAIAP2L2表達與其拷貝數變異(copy number variation,CNV)的相關性。使用Pearson相關性分析肝癌DNA甲基化數據中BAIAP2L2甲基化水平與BAIAP2L2表達水平的關系。以肝癌患者中BAIAP2L2甲基化水平的中位數為截點,將肝癌患者分為高、低甲基化組,繪制生存曲線,并采用log-rank檢驗比較兩組間的生存差異。運用miRWalk數據庫[19](http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)預測調控BAIAP2L2表達的miRNAs,并與TCGA數據庫中篩選得到的下調miRNAs取交集,獲得共同的miRNAs,采用Pearson相關性分析它們與BAIAP2L2在肝癌中的關系。

1.6 BAIAP2L2表達水平與肝癌組織中免疫細胞浸潤水平的相關性分析

運用TIMER數據庫分析BAIAP2L2表達與肝癌組織中浸潤免疫細胞的相關性,免疫細胞包括CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞,并分析各種免疫細胞的浸潤水平與肝癌患者預后的關系。

1.7 基因富集分析

利用基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)軟件[20](4.1.0版)預測 BAIAP2L2在肝癌中涉及的相關通路?；贐AIAP2L2表達的中位數將肝癌樣本分為高、低表達組,運用GSEA軟件進行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析。選擇帶注釋的基因集(c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt)作為參考基因集,每個分析運行1 000次基因組排列。以P＜0.05和錯誤發現率(false discovery rate,FDR)＜0.25為顯著富集[20],用R軟件plyr包、ggplot2包、grid包和gridExtra包繪圖。

1.8 統計學處理

采用R軟件進行統計學分析和圖形可視化。假設檢驗采用雙邊檢驗,P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 BAIAP2L2在癌及癌旁組織中的表達差異

通過TIMER數據庫分析了BAIAP2L2在常見腫瘤中的表達水平,結果顯示,與正常組織相比,BAIAP2L2在肺癌、胃癌和肝癌等腫瘤中高表達(圖1A)。在TCGA數據庫中,與正常肝組織相比,BAIAP2L2在肝癌組織中的表達顯著上調(P＜0.001)(圖1B),且在50例配對樣本的肝癌組織中的表達也顯著上調(P＜0.001)(圖1C)。同樣地,ICGC數據庫的驗證結果顯示,BAIAP2L2在肝癌組織中的表達顯著上調(P＜0.001)(圖1D)。此外,我們進一步從HPA數據庫中獲取了BAIAP2L2蛋白的表達數據,結果顯示:BAIAP2L2在甲狀腺癌、乳腺癌、肝癌等癌組織中的蛋白質表達陽性率均較高(圖2A);在3個肝臟正常樣本中,BAIAP2L2的表達均為中等陽性(圖2B),而在12個肝癌樣本中,有8個樣本的表達為強陽性,4個為中等陽性(圖2C),且都主要在細胞質中表達。

圖1 不同數據庫分析BAIAP2L2在肝癌組織及癌旁組織中的表達水平(A)TIMER數據庫中BAIAP2L2在不同腫瘤組織和癌旁組織中的表達(**:P＜0.01,***:P＜0.001);(B)TCGA數據庫中BAIAP2L2在肝癌組織及癌旁組織中的表達水平;(C)TCGA數據庫中BAIAP2L2在配對肝癌及癌旁組織中的表達水平;(D)ICGC數據庫中BAIAP2L2在肝癌組織及癌旁組織中的表達水平。Fig.1 The expression levels of BAIAP2L2 in liver cancer and adjacent tissues analyzed by different databases(A)Overview of BAIAP2L2 expression in different tumor and adjacent normal tissues via the TIMER database(**:P＜0.01,***:P＜0.001);(B)The expression levels of BAIAP2L2 in liver cancer and adjacent normal tissues in TCGA database;(C)The expression levels of BAIAP2L2 in paired liver cancer and adjacent normal tissues in TCGA database;(D)The expression levels of BAIAP2L2 in liver cancer and adjacent normal tissues in ICGC database.

圖2 BAIAP2L2蛋白在肝癌組織及癌旁組織中的表達水平(A)BAIAP2L2蛋白在不同腫瘤中的表達水平;(B)BAIAP2L2蛋白在正常肝組織中的免疫組化染色;(C)BAIAP2L2蛋白在肝癌組織中的免疫組化染色。Fig.2 The expression levels of BAIAP2L2 protein in liver cancer and adjacent normal tissues(A)The expression levels of BAIAP2L2 protein in various tumor tissues;(B)Immunohistochemical staining of BAIAP2L2 protein in normal liver tissues;(C)Immunohistochemical staining of BAIAP2L2 protein in liver cancer tissues.

2.2 BAIAP2L2表達量與肝癌患者臨床病理特征的關系

進一步分析BAIAP2L2表達與肝癌患者臨床病理資料的關系,結果顯示:BAIAP2L2表達水平與患者臨床病理特征的性別(P=0.004)、T分期(P=0.015)、TNM 分期(P=0.041)、AFP(P＜0.001)及存活狀態(P=0.018)顯著相關,而與年齡(P=0.081)、組織學分級(P=0.108)、N分期(P=0.092)和M分期(P=0.972)無顯著相關性(圖3)。另外,通過ROC曲線分析可得,BAIAP2L2對肝癌具有顯著的診斷價值(AUC=0.891,P＜0.001)(圖4A),且相關性分析表明,BAIAP2L2與AFP具有顯著正相關(r=0.21,P＜0.001)(圖 4B)。

圖3 BAIAP2L2表達與肝癌患者臨床病理資料的相關性Fig.3 The association between BAIAP2L2 expression and clinicopathological characteristics in patients with liver cancer

圖4 BAIAP2L2在肝癌中的診斷價值及與AFP的相關性(A)BAIAP2L2診斷肝癌的ROC曲線;(B)BAIAP2L2與AFP的相關性。Fig.4 The diagnostic value of BAIAP2L2 and its correlation with AFP in liver cancer(A)The ROC curve for diagnosis of liver cancer with BAIAP2L2;(B)The association between BAIAP2L2 and AFP.

2.3 BAIAP2L2表達水平與肝癌患者預后的關系

比較TCGA數據庫中BAIAP2L2高、低表達組患者的生存差異,發現BAIAP2L2高表達組患者比低表達組患者的總生存率更差(P=0.028)(圖5A);ICGC數據庫中的驗證結果同樣顯示,BAIAP2L2高表達患者預后不良(P＜0.001)(圖5B)。此外,GEPIA和Kaplan-Meier Plotter在線數據庫的分析也獲得了相同的結果(圖5C、5D)。進一步的單因素和多因素Cox回歸分析顯示,BAIAP2L2是影響肝癌患者預后的獨立危險因素(HR=1.522,95%CI=1.044～2.219,P＜0.05)(表 1)。

表1 肝癌患者臨床病理特征與總生存率關聯的單因素及多因素相關性分析Table 1 Univariate and multivariate analysis of clinicopathological characteristics for overall survival in patients with liver cancer

圖5 BAIAP2L2表達與肝癌患者生存之間的關系(A)TCGA數據庫中不同BAIAP2L2表達組肝癌患者的生存曲線;(B)ICGC數據庫中不同BAIAP2L2表達組肝癌患者的生存曲線;(C)GEPIA在線數據庫中不同BAIAP2L2表達組肝癌患者的生存曲線;(D)Kaplan Meier-Plotter在線數據庫中不同BAIAP2L2表達組肝癌患者的生存曲線。Fig.5 The association between BAIAP2L2 expression and survival in patients with liver cancer(A)The survival curves of liver cancer patients with different BAIAP2L2 expression in TCGA database;(B)The survival curves of liver cancer patients with different BAIAP2L2 expression in ICGC database;(C)The survival curves of liver cancer patients with different BAIAP2L2 expression in GEPIA online database;(D)The survival curves of liver cancer patients with different BAIAP2L2 expression in Kaplan Meier-Plotter online database.

2.4 BAIAP2L2表達與其拷貝數變異、甲基化及miRNAs的關系

通過分析cBioPortal數據庫中BAIAP2L2表達與其CNV的關系,我們發現,有5名患者的BAIAP2L2拷貝數發生高水平擴增,53名患者的BAIAP2L2拷貝數增益(低水平擴增),且拷貝數增加組(Gain,n=53)與拷貝數正常組(Diploid,n=237)之間BAIAP2L2的表達有顯著差異(P＜0.05)(圖6A)。與此同時,我們分析了TCGA數據庫中肝癌樣本的DNA甲基化數據,結果顯示:BAIAP2L2甲基化水平與BAIAP2L2表達水平呈負相關(r=-0.41,P＜0.001)(圖6B);BAIAP2L2低甲基化患者的預后更差(P=0.030)(圖6C),且BAIAP2L2低甲基化及高表達的患者預后不良(P=0.012)(圖6D)。此外,調控因子預測發現,hsa-miR-99a-3p是調控BAIAP2L2表達的一個潛在miRNA,它與BAIAP2L2表達呈負相關(r=-0.37,P＜0.001)(圖7A)。與正常肝組織相比,hsa-miR-99a-3p在肝癌組織中的表達顯著下調(P＜0.001)(圖7B),且在49例配對樣本的肝癌組織中的表達也顯著下調(P＜0.001)(圖7C)。

圖6 BAIAP2L2表達與BAIAP2L2 CNV和甲基化的關系(A)BAIAP2L2在不同CNV組的表達水平;(B)BAIAP2L2甲基化與BAIAP2L2表達的相關性;(C)基于BAIAP2L2甲基化的生存分析;(D)基于BAIAP2L2甲基化聯合表達的生存分析。Fig.6 The association between BAIAP2L2 expression and its CNV and methylation(A)The expression levels of BAIAP2L2 in different CNV groups;(B)The correlation between BAIAP2L2 methylation and its expression;(C)Survival analysis based on BAIAP2L2 methylation;(D)Survival analysis based on both methylation and expression of BAIAP2L2.

圖7 肝癌組織中hsa-miR-99a-3p與BAIAP2L2的相關性(A)hsa-miR-99a-3p與BAIAP2L2表達之間的相關性;(B)hsa-miR-99a-3p在肝癌組織及癌旁組織中的表達水平;(C)hsamiR-99a-3p在配對肝癌組織及癌旁組織中的表達水平。Fig.7 The correlation between hsa-miR-99a-3p and BAIAP2L2 in liver cancer tissues(A)Correlation analysis of hsa-miR-99a-3p and BAIAP2L2 expression;(B)The hsa-miR-99a-3p expression levels in liver cancer and adjacent tissues;(C)The hsa-miR-99a-3p expression levels in paired liver cancer and adjacent tissues.

2.5 BAIAP2L2表達水平與肝癌組織中免疫細胞浸潤水平的關系

通過TIMER數據庫分析發現,BAIAP2L2表達水平與肝癌組織中B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突細胞的浸潤水平均呈正相關(P＜0.05)(圖8A),相關系數分別為 0.181、0.115、0.246、0.288、0.215、0.143。另外,巨噬細胞和中性粒細胞高浸潤性的肝癌患者預后不良(P＜0.05)(圖 8B)。

圖8 BAIAP2L2與肝癌組織中免疫細胞的關系(A)肝癌組織中免疫細胞浸潤水平與BAIAP2L2表達的相關性;(B)腫瘤浸潤免疫細胞在肝癌中的預后價值。Fig.8 The association between BAIAP2L2 expression and infiltrated immune cells in liver cancer tissues(A)The correlation between the abundance of infiltrated immune cells and BAIAP2L2 expression;(B)The prognostic value of the infiltrated immune cells in liver cancer.

2.6 BAIAP2L2的GSEA富集結果

通過GSEA預測BAIAP2L2在肝癌中參與調節的通路,發現BAIAP2L2高表達顯著富集于細胞周期、p53信號通路、DNA復制、堿基切除修復及同源重組等通路,而BAIAP2L2低表達顯著富集于補體和凝血級聯、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、色氨酸代謝、脂肪酸代謝及初級膽汁酸生物合成等通路(表2,圖9)。

表2 BAIAP2L2在肝癌中的基因富集分析Table 2 Gene set enrichment analysis based on BAIAP2L2 in liver cancer

圖9 GSEA預測BAIAP2L2在肝癌中參與調節的信號通路富集分數正值為BAIAP2L2高表達富集通路;富集分數負值為BAIAP2L2低表達富集通路。Fig.9 Prediction of BAIAP2L2 involved signaling pathways based on GSEA in liver cancerThe positive enrichment scores refer to the pathways enriched in the high expression of BAIAP2L2,and the negative enrichment scores refer to the pathways enriched in the low expression of BAIAP2L2.

3 討論

肝癌是一種常見且高死亡率的惡性腫瘤。盡管醫學發展迅速,但是肝癌的復發和轉移仍然無法解決,早期診斷和有效的治療可以延長患者的生存期[21]。因此,尋找可靠的生物標志物用于肝癌診斷、治療及預后評價至關重要。目前,已有研究報道BAIAP2L2在肺癌、胃癌、前列腺癌等腫瘤中高表達,且與患者預后不良有關[9～11],但是在肝癌中的相關研究尚不清楚。在本研究中,我們分析得出BAIAP2L2在肝癌中高表達(圖1),且對肝癌具有一定的診斷價值(圖4A),這預示著BAIAP2L2可作為肝癌分子和病理診斷的一種生物標志物。同時,BAIAP2L2是肝癌獨立預后的危險因素,其高表達患者的預后更差(圖5,表1),提示BAIAP-2L2可作為肝癌潛在的預后標志物。Liu等[10]研究表明,BAIAP2L2表達與胃癌患者的腫瘤直徑、TNM分期和淋巴結轉移相關。本研究得出了類似的結果,發現BAIAP2L2表達與肝癌患者性別、TNM分期、AFP及存活狀態顯著相關(圖3)。同時,AFP陽性患者中BAIAP2L2的表達水平顯著高于AFP陰性患者,且BAIAP2L2表達水平隨著腫瘤病理分期程度的增加而遞增,這提示BAIAP2L2可能與肝癌發生發展密切相關。目前,現有的肝癌血清生物標志物的診斷靈敏性和特異性相對不足[22]。雖然AFP是一種廣泛用于肝癌診斷的生物標志物,但是由于在早期腫瘤的診斷中假陰性率高,其診斷準確性受到限制[23]。Hou等[24]利用高爾基體蛋白73(Golgi protein 73,GP73)聯合AFP顯著提高了肝癌患者的診斷效率。本文發現,BAIAP2L2在肝癌中具有較好的診斷價值,且與AFP具有顯著正相關(圖4B)。因此,將BAIAP2L2獨立或聯合AFP用于肝癌早期無創篩查和早期診斷也許是未來的一種新策略。

本研究從DNA層面探討了肝癌中BAIAP2L2表達上調的潛在機制。首先,CNV會影響基因的轉錄或翻譯,進而在腫瘤發生發展過程起重要作用[25]。我們分析發現,在BAIAP2L2的CNV中共有58例(15.93%,n=364)肝癌患者發生低或高水平DNA擴增(圖6A),這與BAIAP2L2表達上調顯著相關。其次,DNA甲基化是一種常見表觀遺傳學修飾過程,DNA低甲基化導致染色體不穩定性和基因表達上調,進而在促進癌細胞增殖和轉移等方面發揮作用[26～27]。本研究發現,肝癌中BAIAP2L2表達與其DNA甲基化水平之間存在顯著的負相關(圖6B),這提示BAIAP2L2低甲基化也許是BAIAP2L2表達上調的原因之一。最后,miRNA能促進mRNA降解、改變或抑制基因表達,它的表達失調會引起腫瘤發生一系列病理過程[28～29]。有研究報道,miR-99a-3p在頭頸部癌和子宮內膜癌中的表達顯著下調[30～31]。本研究發現,miR-99a-3p在肝癌中表達下調,且與BAIAP2L2表達呈負相關(圖7),這可能是導致BAIAP2L2表達上調的另一種潛在機制。上述結果表明,在肝癌中BAIAP2L2的拷貝數增加、低甲基化以及調控因子miR-99a-3p的改變或許是BAIAP2L2表達上調的潛在機制。

另外,本研究發現,BAIAP2L2表達與肝癌組織中B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突細胞的浸潤水平呈正相關關系(圖8A),且巨噬細胞和中性粒細胞高水平浸潤的肝癌患者預后更差(圖8B)。大量研究證實,腫瘤微環境中浸潤免疫細胞與患者的預后密切相關[32～33]。腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophage,TAM)是腫瘤微環境的組成部分,它通過調節肝癌細胞免疫應答和分泌多種細胞因子,參與腫瘤的進展和轉移[34]。巨噬細胞大量浸潤肝癌微環境,常與肝癌患者預后不良有關[35],這與本研究結果一致。同時,我們發現,BAIAP2L2在肝癌中參與調節細胞周期、p53信號通路、同源重組等通路(圖9,表2)。其中,已有研究證實,BAIAP2L2在肺癌中參與調節細胞周期通路[9]。由此可見,BAIAP2L2可能通過多種機制參與腫瘤的發生發展并影響患者的預后。

綜上所述,BAIAP2L2在肝癌組織中的表達顯著上調,這可能與BAIAP2L2的CNV增加、低甲基化以及miR-99a-3p表達下調有關,且BAIAP2L2表達與肝癌患者生存顯著相關,因此其可作為肝癌診斷和預后的潛在標志物。然而,本文僅停留在生物信息學分析層面,后續仍需要進一步在基礎實驗上驗證BAIAP2L2在體內和體外的致癌作用機制,以及在動物實驗上驗證和評價BAIAP2L2作為肝癌靶點的免疫治療療效。