微囊藻毒素異構體產生的調控因子及其在自然水體中分布的研究進展

顧毓蓉，程晨，趙雁雁，薛慶舉，萬翔，張凱曄，謝麗強,*

1. 中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環境國家重點實驗室，南京 210008 2. 昆山經濟技術開發區安全生產監督管理和環境保護局，昆山 215300 3. 中國科學院大學，北京 100049 4. 生態環境部南京環境科學研究所國家環境保護農藥環境評價與污染控制重點實驗室，南京 210044

微囊藻毒素（MCs）是淡水水體中最常見、研究最多的一種藍藻毒素，可由微囊藻屬（Microcystis）、長胞藻屬（Dolichospermum）、浮絲藻屬（Planktothrix）、顫藻屬（Oscillatoria）、念珠藻屬（Nostoc）和束絲藻屬（Aphanizomenon）等藻類在細胞內合成[1-2]。MCs毒性效應嚴重[3]，能夠通過抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶活性、氧化應激、脂質過氧化作用、基因損傷和細胞凋亡等機制損傷肝細胞從而導致生物肝內出血甚至死亡[4]。1996年，巴西醫院發生因使用被藻毒素污染的水造成60例患者死亡的嚴重事故，引起了世界各國對有毒藍藻水華和MCs污染的進一步關注[5-6]。為了避免類似事件的發生，我國與世界衛生組織（WHO）均規定MC-LR在飲用水中的濃度限值為1 μg·L-1（生活飲用水水質衛生規范GB/T 5750—2001，地表水環境質量標準GB 3838—2002）。

MCs結構種類較多，得益于質譜技術的發展，近年來已知的MCs異構體數量迅速增加，現已報道了246種構型[7]。不同異構體的毒性存在較大差異，MC-LR的半數致死量（LD50）（小鼠腹腔注射）為50 μg·kg-1（以單位體質量計），與它在結構上僅一個L-氨基酸差異的MC-RR的LD50為500～800 μg·kg-1[8]，而[（6Z）-Adda5]MC-LR的LD50可高于1 200 μg·kg-1[9]。一般來說，自然水體中MCs由多種異構體組成[10-11]，僅憑總MCs或MC-LR濃度無法準確判斷一個區域的MCs實際毒性和污染情況，因此，了解不同MCs異構體在水體的分布特征對準確進行MCs毒性風險評價至關重要。

目前，國內外學者已對MCs異構體產生的調控機制進行了一系列探究，發現除遺傳因子調控外，溫度、光照、營養元素、風力和水力條件等環境因子也能不同程度影響藻類生長代謝，進而影響MCs的產生[10, 12-15]。但針對異構體的研究多集中于原位調查數據的統計分析，且分析結果在不同研究中常存在較大差異。因此，關于MCs異構體產生驅動機制尚無法確定，識別MCs異構體產生的關鍵影響因子、探究其調控機制仍是研究熱點。

綜上所述，針對MCs異構體研究的國內外現狀，本文主要從MCs的基本概況、異構體分布、遺傳因子和環境因子對MCs異構體調控的影響等幾個方面進行概述，重點介紹了MCs異構體合成的調控機制方面的重要研究，并對相關領域進行了展望。這對正確認識MCs異構體產生及轉化過程以及評價MCs綜合毒性和健康風險具有重要意義，并可為湖泊藍藻水華次生危害的防護與治理提供理論依據。

1 自然水MCs的基本概況（Basic profiles of MCs）

1.1 MCs的結構特征

MCs為單環七肽結構，多肽中2種可變L-氨基酸的替換形成了多種MCs異構體[7, 16]（圖1），其中最常見的是MC-LR、MC-RR和MC-YR[17]。環狀結構使得MCs化學性質穩定，純化的MCs具有耐熱性，加熱煮沸都不能將其毒素破壞，能夠抵抗極端pH（pH=1，T=40 ℃時開始分解）、陽光和常見酶[18]。所以過濾、混凝和沉淀等傳統水處理工藝對MCs的去除效果較低[19-20]，處理過程中還可能會破壞藻細胞，使細胞內的毒素釋放到水體中，反而增加了水中MCs濃度[21]。

1.2 產毒基因mcy及MCs合成過程

已有研究表明，并非所有微囊藻都能產毒，產毒菌株和無毒菌株差異是由一種或多種疑似微囊藻毒素合成酶基因（mcy）造成的[22]，歐洲9個國家分離出的所有無毒藍藻菌株均顯示丟失了90%的mcy基因簇[23]。2000年，Tillett等[4]在銅綠微囊藻（Microcystisaeruginosa）PCC 7806的染色體中分離出了mcy基因并進行了測序分析，發現mcy基因簇是一段55 kb的DNA，由mcyA-C和mcyD-J這2個轉錄操縱子組成（圖2（a））。中央啟動子位于mcyA和mcyD之間，而mcyE、mcyF、mcyG、mcyH、mcyI和mcyJ可能具有單獨的啟動子[24]。根據Tillett等[4]推測，Adda側鏈合成是形成MC-LR的第1步，mcyG首先啟動，活化苯丙素為底物，并在mcyG操縱子PKS模塊的作用下與丙二酰輔酶A（Malonyl-CoA）、還原性輔酶Ⅱ（NADPH）、H+和2個S-腺苷酸硫氨酸（SAM）進行反應，完成第1個丙二酰輔酶A延伸，生成中間產物①。由mcyD基因完成Adda合成的第2階段，在mcyG基因的合成產物上進行第2個丙二?；鶊F的延長和修飾，生成中間產物②；mcyE基因完成第3個丙二?；鶊F的添加、延長和修飾，并負責將D-谷氨酸結合到Adda鏈上，生成中間產物③（圖2（b））。在mcyE、mcyA、mcyB、mcyI和mcyC的作用下，Adda尾部依次延伸L-Glu、L-Ala、L-Ser、L-Leu、D-MeAs和L-Arg，逐步形成七肽，然后環化形成MC-LR。當mcyB和mcyC中A2、A4均激活氨基酸L-Arg時，在中間產物⑦和⑨上分別延伸L-Arg，在最終合成為MC-RR，當mcyB和mcyC中的A2、A4分別激活L-Try和L-Arg時，在中間產物⑦和⑨上分別延伸L-Try和L-Arg，最終合成MC-YR（圖2（c））。

1.3 MCs的檢測方法

MCs在自然水體中的濃度僅為μg·L-1，甚至ng·L-1級別，常規的化學方法往往難以快速、準確地對其進行檢測。高效液相色譜法（HPLC）是世界衛生組織所推薦的MCs檢測方法，也是最常用的方法，可以對多種構型的MCs進行同步檢測[26]。在傳統HPLC基礎上發展的UPLC/U-HPLC結合質譜提高了檢測MCs的靈敏度和速度[10, 27-28]。然而，目前仍有多種MCs異構體未分離純化出標準樣品，考慮到檢測效率、成本和實際樣品濃度，通常檢測MC-LR、MC-RR和MC-YR這3種含量較高且毒性較大的異構體[18, 29]。酶聯免疫法（ELISA）也是常見的檢測方法之一[30-32]，其試劑盒已經商品化。但酶聯反應干擾因素較多，容易出現假陽性的結果，而且此方法只針對MC-LR一種構型，對其他MCs異構體往往需要不同的標準品和試劑盒[33-34]。另外，分子生物學檢測法是建立在mcy基因和實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）基礎上的一種新興檢測方法，通過檢測產毒藻基因豐度表征MCs濃度。Via-Ordorika等[35]、Otten等[36]的研究證明產毒基因mcyA、mcyB、mcyE基因與MCs濃度有著顯著正相關關系。然而也有研究指出，產毒基因豐度與毒素濃度之間沒有明顯的相關性[37]。qPCR技術在自然水樣檢測過程中受諸多因素的影響，溫度、光照、營養鹽等都可能影響mcy表達?？梢?，產毒基因豐度與MCs濃度的關系還需進一步研究。

2 自然水體中MCs分布及其異構體組成（Distribution and congeners composition of MCs in natural water body）

據報道，MCs在世界范圍（除南極洲外）的水體中均有分布，257個國家和地區中有108個國家暴發過微囊藻水華，79個國家出現過MCs污染[9]。我國的太湖、巢湖、滇池和洱海等許多淡水湖泊也存在較為嚴重的藍藻水華和MCs污染問題。

綜合已有調查結果，各地區水域中MCs異構體的組成存在明顯差異（表1）。中國鄱陽湖[10]、日本Suwa湖[38]、土耳其Sapanca湖[39]中主要異構體為MC-RR，而德國Neukirchener湖[39]、希臘Zaravina湖[40]中主要異構體為MC-LR。2013—2014年太湖中檢出的MC-LR和MC-RR占比相近，分別占40%和39%[11]，這與法國一些湖泊的調查結果相似。MC-FR和MC-WR在我國水體中檢出較少，但它們卻是新西蘭的Horowhenua水體中的主要MCs異構體，濃度達13.86 μg·L-1和12.90 μg·L-1[41]。另外，水體中總MCs及異構體的組成和濃度往往會因采樣季節的不同而存在差異。從季節分布特征看，總MCs濃度通常表現出夏季最高，秋季降低，冬季最低，隨后春季又升高的變化趨勢[11-12, 42]。在以微囊藻為優勢產毒藍藻的希臘Pamvotis湖中，MC-LR表現出春夏升高、秋冬降低的變化趨勢，而MC-RR表現出秋冬占比上升（86%和71%），春夏占比下降（34%和47%）的趨勢，MC-YR僅在冬季檢出，占比為25%[40]。

表1 國內外MCs分布及其主要異構體類型Table 1 MCs distribution and the main microcystin congeners all over the world

續表1

實際環境中不同的異構體可由不同藍藻或同種藍藻的不同菌株產生，這些藻細胞的生物量隨生態位的變化而變化。因此，湖泊產毒藻類群落結構的差異可能造成MCs異構體組成不同。在微囊藻或長胞藻為優勢屬的水域中，MC-LR、MC-RR通常為主要MCs異構體[10, 40, 50]。在紅色浮絲藻為優勢種的水體中，dmMC-RR濃度通常較高[51-52]，意大利Garda湖中檢出的dmMC-RR占總MCs的90%以上。Stechlin湖[42]中以卷曲長孢藻和銅綠微囊藻為優勢種時，主要MCs異構體為MC-LL，而以水華束絲藻和紅色浮絲藻為優勢種時主要MCs異構體變為MC-LW?？梢?，MCs異構體組成與湖泊產毒藻群落結構有著直接關系，而藻類種群豐度又受地理位置、氣象條件、水體理化參數等多種因素影響，因此MCs異構體的調控機制涉及多種影響因子，具有一定復雜性，需要開展進一步深入探究。

3 遺傳因子對MCs異構體的調控（Regulation of genetics factor to microcystin congeners）

已有研究報道MCs結構的7個肽段均可發生變化，但最常見的是2號和4號位置處的2個可變L-氨基酸（X、Z）的替換以及3號和7號位置甲基化/去甲基化（圖1）。不同MCs異構體的出現是由產毒藍藻中mcy基因編碼的差異造成的[53]。

3.1 非特異性非核糖體肽合成酶的影響

微囊藻毒素合成基因mcy中非特異性的非核糖體肽合成酶（NRPSs）可能是造成出現多種MCs異構體的一個重要因素。mcy基因簇中各開放結構域以模塊化方式排列，其中每個非核糖體肽合成酶都至少含有一個腺苷酸化域（A域，adenylation domains）、硫酯域（T域，thiolation domain）、氨基酸縮合域（C域，condensation domains）和肽載體蛋白（PCPs，peptidyl carrier protein）。各合成階段中延長肽段所需的氨基酸底物經過腺苷酸化后被共價鍵合到磷酸泛肽基輔因子上，與相鄰的肽基載體蛋白結構域結合。這些結構域的順序、數量決定了所得聚酮化合物的結構[54]。遺傳序列的改變也可能影響這些結構域的功能，以A域為例，遺傳編碼影響了其對氨基酸的識別和激活。擬念珠藻（Nostochopsissp.）152菌株mcyB的第一個模塊（mcyB1）中D→Y單個氨基酸變化可能導致2號位L-Arg的引入向L-Hty轉移，mcyC中V→I單個氨基酸變化可能導致MCs合成過程4號位L-Arg的引入向L-Har轉移[55]。通常情況下NRPS酶的結構保守，但mcy基因簇中NRPS的酶特異性較弱。前文提到非特異性的腺苷酸化域能夠激活不同的氨基酸，而非特異性的肽載體蛋白則能將氨基酸以不同順序的組合[56]。例如，席藻（Phormidiumsp.）LP904c菌株mcyB1和mcyC中腺苷酸化域的多特異性，使其在MCs的2號和4號位處選擇引入Leu、Arg、Phe、Trp、Tyr、Met、Hph和Hty等多種氨基酸，產生至少16種MCs異構體。但該菌株的mcy基因簇不編碼Hph、Hty生物合成的酶，它們的出現可能是由于MCs合成過程中mcyB1和mcyC的腺苷酸化域激活了鳥嘌呤肽生物合成的一部分氨基酸[53]。類似的，微囊藻CAWBG11能夠產生至少47種MCs異構體，其中由于控制2號、3號和4號位的mcy底物非特異性產生的MCs異構體有27種，3號位的去甲基異構體的存在表明，mcyB2中A域能同時識別Masp和Asp，因此MCs中大約有2.5%的異構體在第3個位置包含Asp，而不是Masp[57]。

3.2 基因重組的影響

基因重組能使mcy基因簇中模塊之間發生片段交換，影響各點位氨基酸的特異性，從而產生不同的異構體。自然環境下，重組是微囊藻菌株中mcy基因變異的一種常見方式，微囊藻屬菌株的mcy基因簇中mcyA1、mcyA2、mcyB1和mcyC都易受其影響[54]。Tanabe等[58]確定了1株產自加拿大和10株產自亞洲的產毒微囊藻的mcyA、mcyD、mcyG和mcyJ的基因序列，分析發現mcyA有幾處潛在重組區域，但在mcyD、mcyG和mcyJ序列中未檢測到重組。Tooming-Klunderud等[59]在mcy的NMT結構域、側翼dnaN-mcyJ基因的間區中均檢測到多個重組事件，同時檢測到因重組導致的模塊mcyB1和mcyC中A域之間的片段交換。這2個結構域之間的重組可能是微囊藻菌株能夠合成MC-RR的關鍵。Bj?rg等[56]對比了11種微囊藻菌株mcyABC基因在序列水平的差異，系統遺傳學分析結果表明mcyB1模塊的腺苷酸化域有多個系統發育亞組。研究者將能夠激活Leu和Arg的mcyB1腺苷酸化域分別命名為mcyB1（B型）（以PCC 7806為例）和mcyB1（C型）（以HUB 5-2-4為例），并依此將實驗菌株分為B、C共2類。MCs異構體檢測結果表明，B型菌株均可合成MC-LR異構體，而C型菌株則不僅可以合成MC-RR異構型，還能合成出MC-LR和MC-RR混合的MCs。序列分析表明HUB 5-2-4的mcyB1與mcyC間出現明顯的基因重組，使mcyB1獲得了與mcyC高度相似的腺苷酸化域的序列與底物結合口袋，因此在2號和4號位均能夠激活識別Arg，產生MC-RR異構體。部分C型菌株能夠同時合成MC-LR可能是由于殘基Gly236所致。此后的研究多沿用這種分類[59-60]，Meyer等[60]發現能同時合成MC-LR、MC-RR和MC-YR的銅綠微囊藻NIES 843也屬于mcyB1（C型）菌株。然而，自然水體中還有產MC-LY、MC-LA等異構體的銅綠微囊藻，其基因型分類尚未建立。因此，異構體合成與基因多態性的研究仍需進行。

值得注意的是，盡管重組增加了mcy基因的多樣性，但也可能因此影響mcy基因簇的功能。Fewer等[55]的研究表明重組事件的發生和斷點都僅限于腺苷酸化域，mcyB1和mcyC中腺苷酸化域的交換和替換并沒有伴隨縮合域的轉移，不相容的腺苷酸化域和縮合域可能影響多肽組裝過程尤其是縮合反應的順序和時間，甚至導致菌株無法通過NRPS合成所需肽段。

3.3 基因突變的影響

當mcy基因中用于修飾氨基酸的其他結構域（例如差向異構、雜環化、氧化、還原、甲?；图谆龋┌l生位點突變、缺失和插入導致這些結構域激活或失活時，也會形成不同的MCs異構體[54]。Nishizawa等[61]從銅綠微囊藻K-139的染色體中分離出mcy基因簇，分析發現mcyA1的N-甲基轉移酶（NMT）結構域被不含NMT的腺苷酸化結構域取代時，該功能域失活產生了7號位去甲基的MC-LR異構體。

4 環境因子對MCs異構體的調控（Regulation of environmental factor to microcystin congeners）

次生代謝物是有機體在長期進化過程中發展出的，只在生命過程中的某一階段產生。MCs作為一種次生代謝物，從生物學功能來看，盡管它不是藻類生長所必需的，卻是它對生態環境適應的結果，可能與產毒藻抗逆性、信號傳導和適應性調節有關。已有的研究表明，光照、溫度和營養鹽濃度等環境因素都可能影響MCs及其異構體的含量，因此MCs的合成、代謝除了由遺傳特性決定外，還受環境條件的影響[62-65]。

4.1 光照的影響

光照是藍藻進行光合作用的必要條件，光照時間和強度顯著影響藻類的生長和代謝[66-67]。Deblois和Juneau[13]通過對比4種產毒和無毒菌株對光照的響應，發現產毒菌株在波動的光照環境中對高光強具有更高的耐受性，低光強/高光強循環誘導使產毒菌株生物量增加259%，無毒菌株減少22%，因此光照時間和強度通過影響藻類的生長、代謝和產毒/無毒菌株競爭，可能間接影響MCs的合成和釋放。從分子層面，光照強度通過影響產毒基因mcyA[68-69]、mcyB[70-71]和mcyD[70]的表達直接調控MCs的合成，對其機制的解釋主要有以下幾種觀點：（1）氧化應激。當光強度從7.53 μmol·m-2·s-1增加到45.15 μmol·m-2·s-1時，強光下光捕獲復合物的飽和可能導致自由基的產生，mcyB轉錄物增加，從而促進MCs的合成[71]。（2）mcy基因轉錄的光依賴性。根據光照條件的不同，微囊藻能夠選擇性啟用不同的mcy轉錄啟動子。銅綠微囊藻PCC7806菌株在31 μmol·m-2·s-1的恒定光下生長時，mcyA和mcyD之間中央啟動子區域的2個轉錄起始位點都能夠被檢測到；弱光條件（16 μmol·m-2·s-1）下，啟動的mcyA和mcyD的轉錄起始位點分別位于ORF起始密碼子上游254 bp和143 bp，產生較長的mcyABC轉錄物；在強光條件（68 μmol·m-2·s-1）下，啟動的mcyA和mcyD的轉錄起始位點分別位于ORF起始密碼子上游206 bp和342 bp，產生較長的mcyD-J轉錄物[24]。（3）通過光質直接調節或通過另一種調節因子調節。Kaebernick等[70]研究發現，紅光下銅綠微囊藻的mcyB和mcyD被上調，首次證明光質會對mcy基因產生影響。另外，他們發現mcy轉錄物的首次增加發生在弱光條件下，第2次增加發生在31～68 μmol·m-2·s-1之間，與低光強（2～40 μmol·m-2·s-1）時MCs含量的變化一致，因此他們認為影響銅綠微囊藻的光強度<40 μmol·m-2·s-1，同時提出假設：MCs在中低等光強度下合成，但僅在達到某個光照閾值強度時才釋放。

迄今為止，關于光照對MCs異構體影響的研究較少，且已有研究的結論各不相同。合成MC-LR與MC-D-（Asp3）-LR銅綠微囊藻PCC7806菌株與合成MC-RR、MC-LR和MC-YR的銅綠微囊藻NIES 843菌株在不同光照條件下各MCs異構體含量占比變化差異不大[60]。但光強能極大影響阿氏浮絲藻產MCs異構體的情況，強光能夠上調其mcy的表達，[Asp3]MC-RR的含量隨光強增加而減少，而[Asp3]MC-LR的含量則隨光強增加而增加[72]。高光強下[Asp3]MC-LR與RR濃度的比值增加了4倍[73]。研究者因此提出了2種假設：（1）光照通過改變結合位點結構直接影響異構體合成。mcyB第一個模塊的底物結合位點的因光照不同發生構象變化導致模塊的底物特異性的發生變化，引入不同氨基酸進行肽鏈的延長；（2）通過影響細胞代謝間接影響異構體合成。不同的光照條件引起了細胞內可利用的氨基酸組成的變化，高光照強度下增加光合作用可以提高細胞的C/N比，相對較少的氮可用于合成富氮的精氨酸分子，導致微囊藻毒素合成從[Asp3]MC-RR轉移到[Asp3]MC-LR[72]。但也有研究發現，高光強能夠促進阿氏浮絲藻毒素的產生，卻不能改變異構體的組成[74]。因此，針對光強對MCs異構體的調控機制有待進一步研究。

4.2 溫度的影響

自然水體中，MCs的濃度與產毒藻種類與生物量密切相關。溫度作為影響藍藻生長、代謝的重要環境因子，也能影響MCs的產生。多項野外調查結果表明，在中國太湖[75]、巢湖[12]、鄱陽湖[76]和韓國大韓水庫[77]，水溫與產毒微囊藻生物量、細胞內MCs濃度呈正相關。值得注意的是，室內實驗研究普遍表明MCs的最高釋放溫度要高于最佳生長溫度。銅綠微囊藻最佳生長溫度為25 ℃，但MC-LR釋放的最佳溫度為28 ℃[78]；阿氏浮絲藻的最佳生長溫度為19 ℃，但MCs釋放的最佳溫度在20～25 ℃[79]。研究者們認為這可能是由溫度引起的氧化應激所造成，MCs釋放對溫度響應機制可以防止不利生長條件對細胞的損害。Scherer等[80]發現20～30 ℃范圍內，隨著溫度的升高，銅綠微囊藻上調mcyB和mcyD基因，這說明產毒基因的表達受溫度影響，為溫度對MCs的調控進一步提供了分子水平上的證據。

然而，溫度對MCs異構體的影響至今未有一致的結論。余麗等[12]發現自然水域中水溫低于25 ℃時有利于藻類合成MC-LR，高于25 ℃時有利于合成MC-RR，但Xie等[81]在美國密歇根州中放置的浮游植物透析袋實驗表明水溫不是造成MCs異構體組成差異的原因。室內實驗中，銅綠微囊藻在20 ℃時更多合成MC-RR（占83.75%），在28 ℃時更多合成MC-LR（占95.27%）[82]；當溫度從28 ℃升高至36 ℃時，MC-LR與MC-LA濃度比值增加[83]；但Peng等[84]研究發現，當溫度從18 ℃升高至30 ℃時，MC-LR的占比下降，MC-RR和MC-YR的占比增加，但亮氨酸與精氨酸濃度的比值，酪氨酸與精氨酸濃度的比值均未改變；魚害微囊藻（Microcystisichthyoblabe）隨溫度升高，其產生的MC-LR和MC-RR的濃度比值增加，且比值>1，表明高溫可能導致毒性較強的MCs異構體（如MC-LR）占主導地位[85]。以上研究結果的差異可能是由不同物種和菌株對溫度的特異性響應造成的，也可能是由產毒藻類群落結構差異造成，但細胞因溫度升高而上調藻細胞MCs合成以及MCs異構體占比變化的原因目前尚不清楚。

4.3 營養元素的影響

氮是藻類生長的必需元素，在藻細胞物質能量代謝過程中起重要作用[86]。氮濃度1 mg·L-1時，銅綠微囊藻生長受到抑制，隨著氮濃度增加，銅綠微囊藻生物量和MC-LR產生量也顯著增加[92]。一方面，產毒藻生物量的增加意味著藻類群體具備更大產毒潛力；另一方面，合成MCs所用到的氨基酸均是由不同形式的氮通過一些轉化同化而成，氮濃度變化可能直接調控MCs的合成過程[93]。一些研究通過基因組學、轉錄組學的方法發現氮濃度影響mcy基因的表達，氮限制條件下銅綠微囊藻中參與MCs合成的酶基因被下調，而涉及剪裁和轉運的基因被上調[94-96]，但在氮脅迫下，所有涉及MCs合成的基因均被上調[97]，為氮對MCs的調控提供了直接證據。值得注意的是，mcy基因簇中的啟動子能與響應氮代謝環境和氧化還原變化的關鍵基因全局氮調控子（ntcA）結合，藻細胞通過調節氮同化基因和mcy基因的轉錄來響應氮濃度變化[94, 98-99]（圖3）。當細胞處于低氮水平時，pipX與磷酸化的PII蛋白分離并與ntcA-2-OG相互作用，從而影響氮同化相關基因的表達，伴隨細胞內2-OG含量升高，進一步增加ntcA和PmcyA/D啟動子的親和力[100]。已有研究顯示，MCs異構體組成受氮源可利用性差異的影響較大。由于不同氨基酸所含氮原子數目不同（如亮氨酸含有1個氮原子而精氨酸含有4個氮原子），藻細胞可能通過調節氮代謝過程，改變細胞內氨基酸組成和含量，進而影響MCs異構體的相對豐度。Qian等[101]通過同位素標記方法研究發現藻細胞對水中不同氮源利用的順序是不同的，在氮的脅迫下MC-LY會顯著增加。在培養基中添加亮氨酸時，阿氏浮絲藻產生的[Asp3]MC-LR/RR比率明顯增加；添加精氨酸時，2種異構體的比率減少[73]；而在長期缺氮的條件下，突然的氮富集會使阿氏浮絲藻細胞中的氮碳比、天冬氨酸和精氨酸迅速增加，[Asp3]MC-RR在氮脈沖后強烈增加，而[Asp3]MC-LR增加較少[102]。隨著培養基中硝酸鹽的消耗，含精氨酸的MCs異構體的相對豐度會降低[103]。

鋅、鐵是藻細胞生長過程中所必需的微量元素[104]。已有研究表明，水體中鋅、鐵的濃度不僅影響藻類的生長也可能影響其產毒[105-106]。過高濃度的鋅會影響藻類的光合作用、滲透平衡，甚至造成藻細胞的裂解死亡，這可能導致產毒藻胞內MCs隨細胞破裂而釋放到水環境中[106]。鐵離子可通過Fur與mcy啟動子區域結合，在mcy基因表達層面直接調節MC-LR的合成[105]，伴隨鐵離子濃度下降，銅綠微囊藻中mcyD基因顯著上調[107]。當鐵濃度<2.5 μmol·L-1時，藻類生長受到抑制，但MCs增加了20%～40%[108]。

參與細胞功能（例如膜運輸、pH調節、酶活性和基因表達等）的其他營養鹽對藻細胞生長和產毒的研究相對較少。Sandrini等[109]發現微囊藻對低濃度的鉀離子比對鈉、鋰等其他堿金屬陽離子更加敏感。12 mmol·L-1的鉀離子對銅綠微囊藻PCC 7005和NIES-843的生長速率影響極大，但PCC 7806及其無毒突變PCC 7806均不受其影響。由于該研究未分析它們產生的MCs含量和mcy基因表達的相關情況，因此無法判斷鉀離子對藻細胞產毒能力的影響。

圖3 產毒藻細胞中可能涉及的對MCs合成的調控機制（改自文獻[97, 103]）Fig. 3 Schematic diagram of potential pathways involved in the regulation of MCs biosynthesis in a microcystin-producing cyanobacterium （Modified from literature [97, 103]）

5 展望（Prospects）

經過多年的發展，MCs的相關研究已經獲得了很多重要成果，但大多是原位調查數據的統計分析結果，深入研究MCs異構體調控機理的較少。室內實驗由于選擇的產毒菌株不同，MCs異構體對環境因子的影響機制也存在較大爭議。未來應加強以下幾個方面的研究。

（1）進一步加強對微囊藻產毒驅動機制的研究。目前環境因子與MCs總量和異構體組成相關性研究存在結論不一致的現象，微囊藻對特定環境條件的分子反應尤其是特定溫度的反應機制在很大程度上是未知的，有待繼續深入研究。

（2）結合MCs的生物學功能研究其調控機制。目前不同異構體在藻細胞信號傳導和適應性調節的過程中起到的功能是否有所區別尚不清楚，MCs異構體含量變化是否會引起產毒藻內結合蛋白質靶標的構象變化和結合力變化，以促進或抑制蛋白質降解來應對環境變化還需要進一步驗證。

（3）加強組學技術的應用。環境脅迫下產毒藻細胞可能出現養分獲取、光合作用和MCs合成釋放等的交叉調節反應，傳統技術往往難以捕捉其關鍵變化，而組學和測序技術能夠在分子層面更加整體和精確地認識環境變化引起的藻細胞內各種表達水平。

（4）建立并完善以MCs異構體為區分標準的微囊藻分類。目前尚未有區分并量化產不同MCs異構型的微囊藻豐度的方法，存在一定的技術壁壘。因此，有必要加快識別不同亞型的微囊藻的分子生物學方法（如重測序、單細胞測序等技術）的建立和完善，為揭示產毒菌株細胞個體、群體差異，探究產毒細胞個體和群落產毒的規律提供技術手段。

（5）加強產生MCs藻類的系統性研究。魚害微囊藻、阿氏浮絲藻等其他藻種以及野外混合藻的產毒影響與單藻源微囊藻的結果相差迥異，且缺少對這些藻種系統性的研究，對于一些特定環境下的產毒規律值得進一步挖掘。

（6）加強對MCs構效關系的研究。MCs具有結構多樣性，異構體之間的結構差異使其具有不同的活性（親疏水性、毒性效應等）。由于MCs不同位點的取代復雜性，目前異構體構效關系的研究并不完善，亟需進一步加強，這對全面了解異構體環境歸趨、體內代謝、毒性效應及其降解特性等方面均有重要意義。