雌激素的3D-QSAR模型構建及其預測飼料與豬肉中雌激素對人體內分泌影響的應用

方菁，申哲民，袁濤，張徐祥

1. 上海交通大學環境科學與工程學院，國家環境保護新型污染物環境健康影響評價重點實驗室，上海 200240 2. 南京大學環境學院環境衛生研究中心，污染控制與資源再利用國家重點實驗室，南京 210023

在過去的幾十年里，人類內分泌（激素）相關疾病的高發病率和不斷增加的趨勢引發了人們對環境內分泌干擾物（environmental endocrine disruptors, EDCs）的關注。EDCs能夠干擾和改變內分泌系統的功能，引起人體內分泌紊亂[1]、引發兒童肥胖[2]等。雌激素就是一種典型的EDC，人體受雌激素的影響可以通過該物質對雌激素受體（estrogen receptor, ER）的激動作用來評估[3]。

對人類雌激素受體有激動作用的雌激素可以分為3類：天然雌激素（雌酮、雌二醇和雌三醇等），合成雌激素（雙酚A），以及植物雌激素（金雀異黃酮、β-谷甾醇和豆甾醇等）[4]。目前大量研究已從人體血液、尿液中檢測出了天然雌激素[5-7]、合成雌激素[8-9]以及植物雌激素[10-12]。還有研究檢測了人從水體環境接觸雌激素的風險[13]；從中草藥[14]、豆漿[15]等通過食用攝入雌激素的風險。

雌激素對ER的激動作用可以通過相對結合親和力（relative binding affinity, RBA）的數據來評估。有研究通過實驗確定了部分雌激素的雌激素受體相對結合親和力[16]。對于部分沒有實驗數據的物質，一些研究通過分子對接[17]或者使用QSAR建模[18]預測了雌激素受體相對結合親和力。

本研究對全國范圍內的豬飼料以及豬肉中含有的天然雌激素（雌酮、雌二醇和雌三醇等）、合成雌激素（雙酚A）、植物雌激素（金雀異黃酮、β-谷甾醇和豆甾醇等）進行了含量的檢測；并對雌激素從飼料到豬肉的生物富集進行了評估。本研究還對雌激素和雌激素類似物的雌激素受體相對結合親和力進行了QSAR計算，建立了q2=0.721，r2=0.925的CoMFA預測模型和q2=0.824，r2=0.961的CoMSIA預測模型。通過使用本研究預測得到的雌激素受體相對結合親和力以及農業農村部給出的人群豬肉攝入量，對測得的雌激素水平進行了對人體的影響評估。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 材料

β-谷甾醇標準品（≥99%）、柚皮素標準品（≥99%）、豆甾醇標準品（≥99%）和大豆苷標準品（≥99%）購自ANPEL公司；香豆素標準品購自Dr. Ehrenstorfer公司；香芹酚（≥95%）、麝香草酚（≥99%）購自CNW公司；金雀異黃酮（96.0%）購自TCI公司；8種激素類混標（≥99%）購自ANPEL公司；硅烷化試劑（V（BSTFA）∶V（TMCS）=99∶1）購自REGIS公司；SPE填料LC-C18（40～63 μm）、PSA（40～63 μm）購自CNW公司。

豬飼料樣品于各地購買后空運至實驗室，并于室溫下密封保存；豬肉樣品于各地購買后冷凍空運至實驗室，并于-40 ℃冰箱保存。豬飼料及豬肉樣品的采樣點設置在我國東北地區、華北地區、華中地區、華東地區、東南地區和西南地區具有代表性的城市，分別是哈爾濱、北京、西安、上海、廣州和成都。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

樣品經粉碎均勻后制成待測樣，于室溫下密封保存。稱取2.0 g待測樣品于50 mL聚乙烯離心管中，加入10 mL超純水，渦旋振蕩1 min后，加入10 mL 1%乙酸+乙酸乙酯，渦旋振蕩2 min后，搖床振蕩90 min，再加入4.0 g無水硫酸鈉和1.0 g氯化鈉，渦旋振蕩2 min。取上清液約8 mL置于裝有100 mg C18、50 mg PSA和200 mg無水硫酸鈉的15 mL離心管中，渦旋振蕩2 min，于4 ℃冰箱靜置過夜。取5 mL上清液至10 mL試管中，40 ℃氮吹至干，用1 mL甲醇復溶，經0.22 μm濾膜過濾后，上機測定[19]。

1.2.2 色譜條件

使用日本島津GCMS-QP2010氣相色譜質譜聯用儀進行分析，進樣器為島津AOC-6000多功能自動進樣器，使用的色譜柱是Rtx-5ms氣相色譜柱（30 m×0.25 mm, 0.25 μm）。進樣量為1 μL，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，進樣器溫度程序如下：初始溫度50 ℃，以8 ℃·s-1的速率升溫至220 ℃，保持2 min；之后以10 ℃·s-1的速率升溫至280 ℃，保持16 min。載氣流速1 mL·min-1，掃描模式為選擇離子（SIM）模式。

1.3 QSAR計算

相對結合親和力（relative binding affinity, RBA）是通過比較測試化學品與雌二醇的半數抑制濃度（IC50）來計算的。

在本研究中，使用相對結合親和力的負對數（pRBA）來衡量結合親和力，RBA活性數據來自美國EPA CompTox平臺[20]。物質結構數據來自PubChem[21]，經MarvinSketch軟件處理后導入Sybyl-X 2.1.1（Tripos）進行QSAR計算。

2 結果與討論（Results and discussion）

2.1 雌激素及其類似物的QSAR計算

本研究在PubChem中搜索了1 000多種雌激素結構相似化合物，最后篩選出了65種具有RBA實驗值的化合物。從這65種化合物中選取29個化合物進行3D-QSAR研究，以雌激素受體相對親和力（RBA）的對數表征生物活性，建立了CoMFA與CoMSIA模型。構建三維定量構效關系模型時，選用活性最好的分子作為模板分子，將全部分子的共有骨架作為固定結構，進行分子的疊合，使它們的立體場差別最小，29個化合物的分子疊合圖如圖1所示。

CoMFA和CoMSIA模型的各項統計學參數如表1所示。就CoMFA模型而言，交叉驗證相關系數（q2）和非交叉驗證相關系數（r2）分別是0.721和0.925，F檢驗值相對較低，僅為64.977，尚在可靠范圍內。上述參數均表明，CoMFA模型具有較好的預測能力。對測試集中分子進行活性預測，相關系數為0.991。CoMFA立體場（steric field, S）貢獻率為56.6%，靜電場（electrostatic filed, E）為43.4%，可見該類化合物周圍的立體場和靜電場二者對其發揮活性有重要的影響。CoMSIA模型的q2和r2分別是0.824和0.961，F檢驗值為113.157，尚在可靠范圍內。上述參數均表明，CoMSIA模型具有較好的預測能力。

圖1 訓練集中化合物的分子疊合Fig. 1 Molecular superposition of compounds in the training set

表1 CoMFA和CoMSIA模型的統計參數Table 1 Statistical parameters of CoMFA and CoMSIA models

基于CoMFA和CoMSIA模型預測得到的pRBA與通過實驗測定的活性值進行了相關性分析，二者相關性系數分別為0.991和0.989。優良的線性相關性（r2均>0.9）再次證明了這2種模型均具有良好的預測能力（圖2）。

圖2 CoMFA（a）和CoMSIA（b）模型預測logRBA值與實驗值的相關性注：RBA表示相對親和力。Fig. 2 CoMFA （a） and CoMSIA （b） models predict the correlation between the logRBA value and the experimental valueNote: RBA means relative binding affinity.

本研究使用該模型得到所檢測的13種雌激素的RBA預測值如表2所示。

由表2可知，該模型較適合用于預測RBA值較低的植物雌激素，后續評估具有RBA實驗值的雌激素使用實驗值；無RBA實驗值的雌激素使用CoMSIA預測值，β-谷甾醇使用CoMFA預測值。

表2 13種雌激素的RBA實驗值與預測值Table 2 RBA experimental and predicted values of 13 estrogens

2.2 豬飼料與豬肉中雌激素含量

在代表我國東北地區、華北地區、華中地區、華東地區、東南地區和西南地區的豬飼料以及豬肉樣品中均有不同程度檢出天然雌激素以及植物雌激素（圖3）。

其中植物雌激素在豬飼料和豬肉中檢出率較高，為75%和92%；天然雌激素在豬飼料和豬肉中檢出率較低，均為33%；合成雌激素在豬飼料中未檢出，在豬肉中檢出率為33%。利用飼料和肉中植物雌激素濃度計算得出，植物雌激素從豬飼料到豬肉中的生物富集系數（bioconcentration factor, BCF）為0.27～8.2。

2.3 豬肉雌激素效應評估

從《2020中國衛生健康統計年鑒》中的城鄉居民膳食結構以及城鄉居民每人每日食物攝入量得到豬肉的每日攝入量數據為89.6 g；參照標準人定義（體質量63 kg，年齡18～45歲，從事輕體力勞動的成年男性），算出各雌激素每日暴露量如表3所示[22]。

豬肉中雌激素的每日暴露量（E）=

圖3 我國各地區豬飼料（a）與豬肉（b）中雌激素檢出量Fig. 3 Concentration of estrogens in pig feed （a） and pork （b） in China

圖4 豬飼料（a）與豬肉（b）中各雌激素對雌激素當量（EEQ）的貢獻Fig. 4 Contribution of estrogen in pig feed and pork to total estrogen equivalence quotient （EEQ）

一般來說，雌激素的雌激素作用是由它的濃度和雌激素效力決定的，這可以用雌激素當量（estrogen equivalence quotient, EEQ）反映[23]，計算公式如下：

EEQ=RBAi×Ci

式中：RBAi表示某個雌激素的相對結合親和力，Ci是豬肉中該雌激素的濃度。各雌激素對總雌激素效應的貢獻EEQ如圖4所示。

由圖4可知，豬飼料中天然雌激素貢獻的總雌激素當量較高；豬肉中植物雌激素貢獻的總雌激素當量較高，因此植物雌激素的雌激素效應不可忽視，尤其是香芹酚、香豆素和β-谷甾醇貢獻的EEQ較高，應引起重視。

豬肉中雌激素風險指數的計算，參照食品中化學物質風險評估的原則和方法，對毒性效應有閾值的化學物質，選用毒理學上描述危害特征的毒性參數與膳食暴露量的估計值比較來進行風險評估，計算公式如下：

RI=E/ADI

式中：RI為環境雌激素的風險指數，E為環境雌激素的每日暴露量，ADI為環境雌激素的每日容許攝入量。若RI≤1，則說明該雌激素的暴露風險在可接受范圍內；若RI>1，則說明該雌激素有健康風險。

歐洲食品安全局（EPSA）以及世界衛生組織（WHO）給出了部分雌激素的ADI，17β-雌二醇為0.05 μg·kg-1·d-1，雙酚A為50 μg·kg-1·d-1。其他未給出ADI的物質可通過使用預測的RBA值進行估算。

通過計算得出各物質雌激素RI如表4所示?？梢姼鞯貐^豬肉中各物質RI均<1，可以安全食用，但有部分物質RI值接近于1，若豬肉攝入量高于平均值則仍有雌激素效應風險。

表3 各地區豬肉中雌激素每日暴露量Table 3 Daily exposure to estrogen in pork in various regions

表4 各地區豬肉中雌激素風險指數（RI）Table 4 Estrogen risk index （RI） in pork from different region