子宮內膜異位癥患者腹腔Th17細胞和Th17.1細胞檢測及致炎活性分析

汪 璐 蔣艷萍 彭亞琴 秦 健 譚愛麗 王淑君

固有免疫細胞和適應性免疫細胞共同參與子宮內膜異位癥的炎癥反應，其中中性粒細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞和T細胞通過分泌一系列生物活性介質促進子宮內膜異位細胞的增殖、侵襲以及病變組織的血管生成等[1, 2]。研究表明輔助性T細胞17(Th17)在子宮內膜異位癥的進展中可能發揮重要作用，其分泌的促炎性細胞因子白細胞介素-17A(IL-17A)是引起多種炎癥性疾病和自身免疫性疾病的關鍵因子。Th17細胞具有異質性，能在不同條件下被誘導分化為表達干擾素-γ(IFN-γ)的輔助性T細胞17.1(Th17.1)或表達白介素-10(IL-10)的一類適應性調節T細胞亞群(Tr1)，參與不同的病理生理進程[3]。子宮內膜異位癥患者血清中Th17細胞的比例增加，其水平與子宮內膜異位癥的嚴重程度有關[4,5]。然而子宮內膜異位癥患者腹腔Th17細胞的組成和功能特性尚未明確，是否存在Th17.1細胞和Tr1細胞仍待研究。本文全面分析子宮內膜異位癥患者腹腔沖洗液中Th17細胞及其相關亞群的活性和分子特征，并探討其在腹腔炎癥反應中的作用。

本研究根據CD4+T細胞表面趨化因子受體的差異性表達，識別具有Th17和Th17.1功能的細胞，成功從患者腹腔沖洗液中分選出Th17細胞和Th17.1細胞，并探討這兩種細胞對子宮內膜異位癥炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 患者

2018-06-2020-10在武漢大學人民醫院行手術治療的中重型子宮內膜異位癥患者(病例納入標準：符合1985年美國生育協會修訂的腹腔鏡診斷內異癥的評分系統，r-AFS 評分為Ⅲ-Ⅳ期)20例，收集術中腹腔沖洗液，患者資料見表1。病例納入標準：本研究納入的患者手術前無自身免疫性疾病，短期內無炎癥性疾病或生殖道感染病史，在手術前三個月內未使用任何抗炎藥物，術后組織病理學診斷均為子宮內膜異位癥。

1.2 試劑和儀器

人外周血淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司(P8610-200ml)。紅細胞裂解緩沖液、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA，ST1303-50g)、牛血清白蛋白(ST025-20g)、SYBR Green Quantitative RT-PCR試劑盒(D7190S)、佛波酯(PMA，S1819-1mg)、Ionomycin(S1672-250nmol)、Brefeldin A(S1536-5mg)、多聚甲醛(P0099-500ml)購自碧云天。Arcturus PicoPure RNA試劑盒(KIT0204)、胎牛血清(10100147)、RPMI1640培養基(11879020)購自ThermoFisher。Axcel RNA QC Kit v2.0(929104)購自Qiagen。PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis 試劑盒(6110A)購自Takara Bio。流式抗體購自BioLegend：APC/Cy7標記的CD3抗體(HIT3a)、FITC標記的CD4抗體(A161A1)、PE標記的CCR4抗體(L291H4)、PE/Cy7標記的CXCR3抗體(G025H7)、PerCP/Cy5.5標記的CCR6抗體(29-2L17)、APC標記的CCR10抗體(6588-5)、Pacific blue標記的IL-17A抗體(BL168)、Pacific blue標記的IFN-γ抗體(4S.B3)、APC標記的T-bet抗體(4B10)、Pacific blue標記的Ki67抗體(Ki-67)均購自BioLegend。FACSCelesta流式細胞儀和FACSAria III流式細胞儀購自BD Biosciences。CFX384 RT-PCR儀購自Bio-Rad。

表1 20例患者一般資料

1.3 腹腔沖洗液細胞的收集

患者在全麻狀態下進行腹腔鏡檢查，從Douglas腔收集不含血液的腹腔沖洗液。將腹腔沖洗液3.0 ml緩慢加入3.0ml人外周血淋巴細胞分離液中，室溫400g離心20min，收集腹腔沖洗液-淋巴細胞分離液分界面處的細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)離心洗滌一次。將細胞重懸于紅細胞裂解緩沖液200μl，室溫孵育15min裂解殘留的紅細胞。PBS緩沖液離心洗滌細胞一次，用含有2.0mM EDTA和0.5%牛血清白蛋白的PBS緩沖液重懸細胞以備流式細胞術檢測。

1.4 流式細胞術檢測細胞表面抗原和細胞因子

1.4.1 細胞表面抗原檢測：將1.3中分離所得的細胞用含有CD3抗體、CD4抗體、CCR6抗體、CCR10抗體、CCR4抗體、CXCR3抗體的溶液(每種抗體濃度為2μg/ml)于冰上孵育30min，1.0ml PBS緩沖液洗滌一次，重懸細胞于0.5ml PBS緩沖液中。使用FACSAria III流式細胞儀檢測細胞表面抗原如CD3、CCR6、CXCR3、CCR10和CCR4的表達，依據細胞表面抗原分選腹腔T細胞的不同亞群。

1.4.2 胞內抗原檢測(細胞因子或細胞核內蛋白)：經表面抗原染色后或分選培養后的細胞用200μl 2%多聚甲醛室溫固定20min；90%甲醇-PBS 1ml重懸細胞，冰上孵育30min；PBS緩沖液離心洗滌細胞一次；用含有IL-17A抗體、IFN-γ抗體、T-bet抗體和(或)Ki67抗體的溶液(每種抗體5μg/ml)室溫孵育細胞1h；PBS緩沖液離心洗滌一次，將細胞重懸于PBS緩沖液中，FACSCelesta流式細胞儀檢測。

1.4.3 RNA提取、cDNA合成和實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)：使用Arcturus PicoPure RNA試劑盒按說明書提取細胞RNA，QIAxcel RNA QC Kit v2.0測量RNA質量和濃度，PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis 試劑盒合成cDNA第一鏈。將RNA樣品與SYBR Green Quantitative RT-PCR試劑盒中的試劑按說明書混合，使用CFX384 RT-PCR儀進行PCR反應。PCR反應條件為50℃預熱2min、95℃預變性10min、95℃變性15s和60℃退火延伸30s，共40個循環，然后72℃反應10min。以β-肌動蛋白(β-actin)為參考基因,將靶基因的mRNA水平進行標準化，采用2-ΔΔCt法計算RORC、TNF、CSF2、IL1R1基因的相對表達量。PCR引物序列見表2。

表2 引物序列

1.5 體外細胞培養和活化

采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基將1.4中分選的T細胞調節濃度至1×105/ml，加入 20ng/ml佛波酯、1μg/ml Ionomycin和10μg/ml Brefeldin A刺激IL-17A的表達，37℃培養4h, 然后按1.4中的方法進行細胞因子染色和流式細胞術檢測。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 子宮內膜異位癥患者腹腔IL-17A+ T細胞的異質性

IL-17A+T細胞占總腹腔細胞的比例約為3.77%。IL-17A+T細胞可被分為兩個亞群：CCR6+CXCR3-細胞和CCR6+CXCR3+細胞。前者在IL-17A+T細胞所占比例顯著高于后者[(76.37±6.28)% vs(19.78±6.40)%，t=15.450，P<0.01]。這兩個亞群細胞表面均不表達水平CCR10，且CCR6+CXCR3-細胞CCR4表達水平高于CCR6+CXCR3+細胞[(20.22±2.73)% vs(14.12±1.32)%，t=4.924，P<0.01]。

2.2 CCR6和CCR10的表達識別活的IL-17A+ T細胞

上述結果提示趨化因子受體可能是腹腔IL-17A+T細胞及其亞群的表面標志，故可根據不同趨化因子受體的表達水平識別活的腹腔IL-17A+T細胞。結果顯示CD3+CD4+T細胞分為a亞群(CCR6+CCR10-)、b亞群(CCR6+CCR10+)、c亞群(CCR6-CCR10+)、d亞群(CCR6-CCR10-)四個亞群。各個亞群RORC mRNA 表達水平及IL-17A+細胞比例見表3。與其它亞群相比，a亞群RORC mRNA表達水平及IL-17A+細胞比例明顯升高(t均>3.540,P<0.05或P<0.01)，其余3個亞群RORC mRNA表達水平以及IL-17A+細胞比例差異無統計學意義(t均<1.880,P>0.05)。

表3 CD3+、CD4+ T細胞各亞群RORC mRNA及IL-17A+細胞水平

2.3 CCR4和CXCR3在IL-17A+ T細胞表面的差異性表達

上述的a亞群根據CCR4和CXCR3的表達進一步區分為兩個亞群：CCR4+CXCR3-/lo細胞和CCR4-CXCR3+細胞。前者有(81.53±4.50)%的細胞表達IL-17A，后者僅有(43.83±4.03)% 的細胞表達IL-17A，兩者表達差異有統計學意義(t=10.812，P<0.05)。

2.4 依據CCR4和CXCR3的表達差異區分Th17細胞和Th17.1細胞

CCR4+CXCR3-/loT細胞亞群較CCR4-CXCR3+T細胞亞群IFN-γ和T-bet表達明顯減少(P<0.01)，見表4。因此，可依據CCR4和CXCR3表達的差異區分Th17細胞和Th17.1細胞，子宮內膜異位癥患者腹腔沖洗液中Th17細胞和Th17.1細胞在CD4+T細胞中所占比例分別為(18.27±4.93)%和(5.99±2.29)%。

表4 CCR4+CXCR3-/lo細胞和CCR4-CXCR3+細胞亞群 IFN-γ和T-bet比較

2.5 腹腔Th17.1細胞具有更強的促炎活性

與CCR6+CCR10-CCR4+CXCR3-/loT細胞(Th17)相比，CCR6+CCR10-CCR4-CXCR3+T細胞(Th17.1)中TNF-α(基因名TNF)、GM-CSF(基因名CSF2)和IL-1R1(基因名IL1R1)表達水平更高(P<0.05或P<0.01)。Th17細胞和Th17.1細胞的Ki67染色結果無明顯差異(P>0.05)，見表5。

表5 Th17.1細胞炎癥相關基因和Ki67的表達

3 討 論

既往研究證明，在腫瘤、消化道感染、自身免疫性疾病和艾滋病中，T細胞可根據CXCR3、CCR4、CCR10和CCR6的差異性表達區分Th1、Th2、Th9和Th17細胞[6-9]，在多種疾病或病理模型中亦有Th17.1細胞的存在。Th17細胞與Th17.1細胞在表型和功能上存在一系列差異，最顯著的差異是Th17細胞表達RORγt但不表達T-bet和IFN-γ，表達CCR4但不表達CXCR3；而Th17.1細胞同時表達RORγt、T-bet和IFN-γ，表達CXCR3但不表達CCR4[3, 10]。相對于Th17細胞，Th17.1細胞可能具有更強烈的致病作用，原因在于Th17.1細胞不僅表達IFN-γ，也產生促炎細胞因子如TNF-α和GM-CSF[11]等。

基于趨化因子受體差異性表達來區分子宮內膜異位癥患者腹腔內Th17細胞和Th17.1細胞，目前尚未報道。本研究結果顯示，在患者腹腔沖洗液中，根據趨化因子受體的差異性表達來辨別Th17細胞和Th17.1細胞，Th17細胞的表型為CD3+CD4+CCR6+CCR10-CCR4+CXCR3-/lo， Th17.1細胞的表型為CD3+CD4+CCR6+CCR10-CCR4-CXCR3+，并且可以從活化的細胞中分選出Th17細胞和Th17.1細胞。目前對Th17細胞的檢測主要依靠流式細胞術分析T細胞內IL-17A的特異性染色，需要對T細胞進行固定和破膜，無法獲得存活的Th17細胞。本文研究結果有利于更深入探索Th17細胞和Th17.1細胞的功能特點、分子特征以及基因表達譜。

本研究顯示，子宮內膜異位癥患者腹腔沖洗液中的Th17細胞和Th17.1細胞均存在于表達RORγt的CD4+CCR6+CCR10-T細胞中。RORγt是決定Th17細胞分化和功能的關鍵轉錄因子，介導初始T細胞向Th17細胞的分化[12]。Th17細胞相比，Th17.1細胞上調IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-1R1的表達。IFN-γ、TNF-α和GM-CSF均為重要的炎癥性細胞因子。Th17細胞通過分泌IFN-γ、TNF-α和GM-CSF活化巨噬細胞、樹突細胞、T細胞，促使這些細胞產生更多炎癥性介質造成血管通透性升高、炎性細胞浸潤和組織破壞[13]。IL-1R1是IL-1的受體，與IL-1結合后活化MAPK p38和NF-κB等信號通路促進Th17細胞的功能[14]。Th17.1細胞上較高的IL-1R1表達說明其可能接受更多的IL-1刺激導致其促炎功能更強。這些因子的高表達提示腹腔Th17.1細胞相對于Th17細胞具有更高的致炎活性。

IL-1β、IL-12、IL-23、前列腺素E2和TNF-α均能誘導Th17細胞分化為Th17.1細胞[3, 15-17]，但是子宮內膜異位癥患者腹腔內Th17.1細胞的誘導因素目前尚未明確。子宮內膜異位癥病灶產生趨化因子，從而募集免疫細胞至病變組織，這些免疫細胞分泌IL-1β和TNF-α等多種炎性細胞因子[18]，可能誘導Th17.1細胞的產生。后續研究將進一步明確這些炎性細胞因子及其來源細胞是否在體內外有效誘導Th17.1細胞的出現，同時對腹腔Th17細胞和Th17.1細胞進行轉錄組測序，比較二者基因表達譜的差異，探索二者的特異性標志、代謝特點、信號分子和功能分子。條件允許時應建立子宮內膜異位癥小鼠模型，通過多種細胞和分子生物學手段，比如細胞過繼輸注、基因敲除、基因過表達等，明確Th17細胞和Th17.1細胞對子宮內膜異位癥病理發展的影響。

綜上所述，本研究依據趨化因子受體的差異性表達成功從子宮內膜異位癥患者腹腔沖洗液中識別和分選了Th17細胞和Th17.1細胞，初步檢測了二者的功能特征，為深入探討Th17細胞和Th17.1細胞在子宮內膜異位癥中的作用奠定了堅實基礎。

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本文第一作者簡介：

汪 璐(1986-)，女，漢族，博士，研究方向:婦科疾病