牛膝甾酮介導Notch通路影響成牙骨質細胞成骨效應*

韋 敏 顧春梅 王育新 管燕華

骨由來自細胞外基質(ECM)的鈣化基質和骨細胞(分化自成骨細胞)組成，細胞外基質是膠原蛋白、蛋白聚糖和糖蛋白的復雜復合體，為細胞的增殖、分化、衰老和凋亡提供了一個特殊的微環境，此外，通過成骨細胞中的成骨細胞信號傳導途徑，提供成骨細胞的基本信號傳導途徑[1]。而成牙骨質細胞在細胞特征及功能上與成骨細胞具有許多相似性，其功能受到多種成骨相關蛋白的調控[2]。人牙骨質主要由羥基磷灰石、膠原和非膠原蛋白構成，這些蛋白在牙齒的矯正及修復過程中具有重要作用[3]。Notch信號通路是一種高度保守的分子細胞信號通路，由Notch受體(1,2,3,4型)、Notch配體(DSL蛋白)和細胞內效應分子(CSL-DNA結合蛋白)組成，在多細胞生物的增殖、干細胞維持、細胞命運調控、分化和內環境穩定中發揮重要作用[4]。既往研究發現，Notch信號通路參與了成骨細胞分化過程，Notch信號通路被激活，可促進成骨細胞分化[5]。有研究發現，過表達的整合素金屬蛋白酶10可通過激活Notch信號通路相關蛋白的表達，從而促進牙周膜干細胞成骨分化[6]。牛膝具有補肝腎、強筋骨等功效，目前在臨床上主要用于骨質疏松癥的治療[7]。牛膝主要含有牛膝甾酮、蛻皮甾酮和香豆素等物質，已有研究報道顯示，牛膝甾酮對于骨形成具有一定的促進作用[8]。但是目前關于牛膝甾酮對成牙骨質細胞成骨效應的影響還未見報道，且牛膝甾酮對Notch信號通路相關蛋白表達的影響還不清楚。因此本研究分析了牛膝甾酮對成牙骨質細胞成骨效應的影響并探討其相關機制，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試藥與儀器

1.1.1 細胞：成牙骨質樣細胞株OCCM-30，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 試劑和藥物：DMEM培養液(批號：612456)、胎牛血清(批號：648412)、胰蛋白酶(批號：201645)購自美國Sigma公司；牛膝甾酮粉末(批號：549123)購自南京建成生物有限公司；RNA提取試劑盒(批號：865431)購自上海優寧維生物有限公司；RNA反轉錄試劑盒(批號：845615)購自上海優寧維生物有限公司；RT-qPCR試劑盒(批號：612334)購自上海優寧維生物有限公司；Notch1(批號：587254)、DSL(批號：254354)、CSL(批號：754245)和β-actin(批號：253341)蛋白抗體購自美國Abcam公司；二抗(山羊抗兔，批號：235687)購自于武漢三鷹生物有限公司。

1.1.3 儀器：BSC-1100IIB2-X生物安全柜(中國博科公司)；博科300LCO2細胞培養箱(中國博科公司)；5320R4℃離心機(德國徠卡公司)；伯樂Mini-PRO TEAN電泳儀(美國伯樂公司)；EVOS M7000倒置熒光顯微鏡(意大利賽默飛公司)；BKQ-B75高壓蒸汽滅菌鍋(中國博科公司)；LAS 4000成像系統(GE Health care公司，美國)。

1.2 細胞培養和分組

將細胞凍存管從液氮罐中取出，于37℃水浴鍋中解凍后，倒入裝有8ml培養基的15ml離心管中離心5min(1 000r/min)，棄上清，加入1ml培養基重懸細胞后倒入加有10ml培養基的培養皿中，輕微搖晃使細胞均勻分布在培養基中，然后放入CO2培養箱中培養(37℃)，細胞覆蓋率達到80%時進行傳代以及后續試驗。采用培養基將牛膝甾酮配置成10.0mg/L溶液，高劑量組直接使用即可，其余各組按比例稀釋。根據牛膝甾酮干預劑量的不同將細胞分為空白對照組(0mg/L)、牛膝甾酮低劑量組(2.5mg/L)、牛膝甾酮中劑量組(5.0mg/L)、牛膝甾酮高劑量組(10.0mg/L)[9]，各組均培養24h后進行后續試驗。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖水平

取各組對數生長期的OCCM-30細胞，在培養皿中加入1ml胰蛋白酶輕微吹打2min，使細胞完全懸浮。將懸浮的細胞轉移到1.5ml離心管中離心(2 000rpm，10min),棄上清液，加入1ml RPMI 1640培養基，并輕微吹打細胞，使細胞充分懸浮，將細胞懸液轉移到96孔板中，每孔100μl，在培養箱中培養24h，棄去96孔板中的培養基，再每孔中依次加入新的RPMI 1640培養基，各組6個復孔，培養24h，去除培養液。每孔加入100μl培養液和10μl CCK-8溶液，持續培養3h，使用Bio-Rad微孔板閱讀器讀取450nm處的吸光度，重復三次，通過吸光度計算細胞增殖率。

1.4 細胞內鈣離子檢測

采用Fluo-3 AM探針檢測細胞內鈣離子熒光強度：取對數生長期的OCCM-30，PBS沖洗三次，采用無鈣離子的培養基將細胞重懸，細胞涂片于病理玻片上，玻片放置于培養皿中，培養皿加入無鈣離子的培養基，在培養箱中培養24h，加入Hank’s平衡液清洗玻片三次，然后加入Fluo-3 AM工作液(1∶5稀釋)，避光孵育30min，采用中性樹脂封片，最后于倒置熒光顯微鏡下進行觀察，400倍視野下隨機選擇5個視野，并采用Image J軟件進行圖片分析，依據圖片中的熒光強度計算鈣離子熒光強度數值。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率

使用FITC凋亡試劑盒，將OCCM-30細胞(PBS)洗滌兩次，用1×結合緩沖液在1×106細胞/ml濃度下懸浮于400μl V-FITC溶液中，黑暗中室溫孵育15min，然后加入PI(10μl)，4°C避光孵育5min，立即用流式細胞儀分析細胞,重復6次。

1.6 RNA提取及RT-qPCR

取出培養皿放入無菌操作臺，棄去培養皿中的培養液。根據RNA提取試劑盒說明步驟提取細胞總RNA，并利用反轉錄試劑盒得到cDNA保存至-80℃備用。RT-qPCR體系：SYBR Green qPCR SuperMix 16.25μl，特異性引物2.0μl，模板cDNA 3.25μl，DEPC水補足至30μl。反應條件為：95℃，10min；95℃，10s；60℃，30s；70℃，30s；共40個循環。設置6個復孔，以GADPH為內參，根據公式(2-ΔΔCt法)計算Notch1、DSL、CSL mRNA表達。各引物序列表1。

表1 各基因引物序列

1.7 Western Bloting檢測細胞相關蛋白表達

取出培養皿放入無菌操作臺，棄去培養皿中的培養液，并加入1ml PBS和100μl蛋白酶K溶液，使細胞懸浮，超聲細胞破碎儀作用2min破碎細胞，3 000rpm 4℃離心20min，取上清于一支新的1.5ml EP管中，然后采用蛋白定量試劑盒檢測每個樣本吸光度(450nm波長)，根據標準曲線計算每個樣品的蛋白濃度，根據定量結果將每個樣品的蛋白濃度定量至3μg/μl，每孔上樣10μl，經SDS-PAGE電泳分離、轉模和封閉后用特異性抗體Notch1、DSL、CSL(1∶5 000)，在4℃條件下孵育12h，孵育后的條帶清洗三次(1%吐溫)，二抗(山羊抗兔，1∶1 000)孵育2h，LAS 4000成像并觀察結果，采用β-actin作為內參進行灰度值比較。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 牛膝甾酮對細胞增殖率的影響

四組細胞增殖率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與空白對照組比較，牛膝甾酮各劑量組OCCM-30細胞增殖率顯著升高，且牛膝甾酮各劑量組OCCM-30細胞增殖率呈低劑量組<中劑量組<高劑量組 (t均>5.018，P<0.05)，見表2。

表2 各組細胞增殖率比較

2.2 牛膝甾酮對細胞內鈣離子的影響

四組細胞內鈣離子熒光強度比較，差異有統計學意義(P<0.05)。牛膝甾酮各劑量組OCCM-30細胞內鈣離子熒光強度顯著高于空白對照組，且牛膝甾酮各劑量組OCCM-30細胞內鈣離子熒光強度呈低劑量組<中劑量組<高劑量組(t均>14.402，P<0.01)，見表3和圖1。

表3 各組細胞鈣離子檢測結果比較

圖1 各組細胞內鈣離子熒光強度(熒光顯微鏡，×400)

2.3 牛膝甾酮對細胞凋亡的影響

四組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義(P<0.01)。牛膝甾酮各劑量組OCCM-30細胞凋亡率顯著低于空白對照組，且牛膝甾酮各劑量組OCCM-30細胞凋亡率呈低劑量組>中劑量組>高劑量組(t均>14.584，P<0.01)，見圖2和表4。

2.4 牛膝甾酮對細胞Notch1、DSL、CSL mRNA表達的影響

四組細胞Notch1、DSL、CSL mRNA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與空白對照組比較，牛膝甾酮各劑量組OCCM-30細胞內Notch1、DSL、CSL mRNA表達水平均顯著升高，且牛膝甾酮各劑量組OCCM-30細胞內Notch1、DSL、CSL mRNA表達水平呈低劑量組<中劑量組<高劑量組(t均>3.315，均P<0.05)，見表5。

表4 各組細胞凋亡率結果比較

注：A，空白對照組 ；B，牛膝甾酮低劑量組； C，牛膝甾酮中劑量組； D，牛膝甾酮高劑量組

表5 各組細胞Notch1、DSL、CSL mRNA水平比較

2.5 牛膝甾酮對細胞Notch1、DSL、CSL蛋白表達的影響

四組細胞Notch1、DSL、CSL 蛋白表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.01)。與空白對照組比較，牛膝甾酮各劑量組OCCM-30細胞內Notch1、DSL、CSL蛋白表達水平均顯著升高，且牛膝甾酮各劑量組OCCM-30細胞內Notch1、DSL、CSL蛋白表達呈低劑量組<中劑量組<高劑量組(t均>6.790，均P<0.01)，見圖3和表6。

雖然覆蓋在牙齒根部表面的牙骨質是一種鈣化的牙齒成分，但它被歸類為牙周組織，因為它與牙周膜和牙槽骨有共同的起源。由于它在牙齒支抗系統中起著關鍵作用，因此了解成牙骨質細胞生成牙骨質對于再生功能性牙齒至關重要[10]。盡管牙骨質與骨有幾個方面的共同點，包括其生化成分，但其不同之處在于，牙骨質在組織學上沒有血管和神經，幾乎沒有重塑能力，而骨有組織良好的系統，可通過成骨細胞、骨細胞和破骨細胞進行再生[11]。體外和體內研究都表明，成牙骨質細胞合成非膠原蛋白，如堿性磷酸酶(ALP)、骨唾液蛋白(BSP)和骨鈣素(OCN)，在骨形態發生蛋白誘導的分化過程中，發現成牙骨質細胞的相關基因表達發生改變[12]。然而，關于成牙骨質細胞分化過程的詳細分子機制知之甚少。

表6 各組細胞Notch1、DSL、CSL蛋白水平比較

本文對永生化小鼠成牙骨質細胞系OCCM-30的相關研究顯示，牛膝甾酮的干預改變了成牙骨質細胞的分化。在中醫上牛膝是治療骨質疏松癥的常用藥物之一，主要分布在中國山西、陜西、山東等地，中醫上主要用于治療筋骨無力、頭痛及吐血等癥狀。其主要成分牛膝甾酮具有促進蛋白合成，降低血糖等作用，有研究發現，其對于骨形成具有一定的促進作用[13]。牛膝甾酮是牛膝的主要活性成分之一，具有促進骨樣細胞增殖的功效[14]。且在目前的臨床應用當中，未見明顯副作用，安全性較高。本研究采用不同濃度的牛膝甾酮作用于OCCM-30細胞，結果顯示，牛膝甾酮可有效促進OCCM-30細胞增殖，同時降低OCCM-30細胞凋亡，且隨著牛膝甾酮的干預劑量增加，OCCM-30細胞增殖率越高，凋亡率越低，提示牛膝甾酮可有效促進OCCM-30細胞的生長，并減少其凋亡，具有促進骨樣細胞增殖的功效。細胞內鈣離子水平可反映細胞成骨細胞分化水平[15]。本文通過Fluo-3 AM探針技術檢測了細胞內鈣離子水平，結果發現牛膝甾酮干預可以顯著增加OCCM-30細胞內鈣離子水平，且具有量效關系，表明牛膝甾酮可能通過激活細胞鈣離子通道，提高細胞鈣離子水平，從而促進細胞成骨分化。

Notch信號通路在牙周組織的修復和改建過程中具有重要作用。有研究顯示，當大鼠牙髓和牙周組織受損時，在組織的修復過程中Notch信號通路被激活，提示Notch信號通路的激活可能與牙周組織的修復過程密切相關[16]。在干細胞骨分化的過程中，Notch信號通路同樣起到了重要作用，有研究發現，在體外培養的骨髓干細胞中，通過激活Notch信號通路，可以使骨髓干細胞分化水平增加，促進細胞成骨分化[17]。既往研究顯示，當采用抑制劑抑制Notch信號通路相關蛋白的表達時，骨髓干細胞成骨能力顯著下降[18]。結合牛膝甾酮促進骨樣細胞增殖的功效，提示牛膝甾酮可能對Notch信號通路相關蛋白的表達具有一定的影響，從而影響OCCM-30細胞成骨效應。為了探討Notch信號通路對成牙骨質細胞成骨分化的影響，本研究檢測了Notch信號通路相關蛋白Notch1、DSL、CSL的表達水平，結果發現隨著牛膝甾酮干預劑量的增加，Notch1、DSL、CSL的表達水平均顯著升高，同時結合OCCM-30細胞增殖、凋亡及鈣離子水平的結果，提示Notch信號通路相關蛋白的表達水平與OCCM-30細胞成骨效應密切相關，其機制可能是牛膝甾酮可激活Notch信號通路相關蛋白的表達水平，從而調節細胞增殖、凋亡及鈣離子水平，使得OCCM-30細胞成骨效應增強。

綜上所述，牛膝甾酮可激活Notch信號通路相關蛋白表達，促進OCCM-30細胞增殖和鈣離子水平，并抑制OCCM-30細胞凋亡，從而促進成牙骨質細胞成骨效應。

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本文第一作者簡介：

韋 敏(1987-)，女，漢族，研究方向：口腔疾病的診斷和治療