聯合糞便微小染色體維持蛋白2檢測和多靶點糞便 FIT-DNA 聯合檢測技術在篩查結直腸癌的意義＊

何柏霖 袁宇林 劉敏 張健 程書榜△

（1.深圳市龍華區人民醫院胃腸外科，廣東 深圳 518000）

（2.廣東醫科大學研究生院，廣東 湛江 524000）

結直腸癌是作為全球第三大常見癌癥，是消化系統的常見惡性腫瘤，也是導致癌癥死亡的第二大主要原因[1]，嚴重危害著人類健康。若能對結直腸癌進行早期篩查、早發現、早治療，結直腸癌患者的五年生存率可達80%以上[2]。發達國家得益于對人群結直腸癌篩查項目和危險因素控制開展較早，其結直腸癌發病率以及死亡率均持續下降[1-2]。常見的篩查方式包括：糞便隱血，免疫法糞便隱血試驗（FIT）-DNA檢測；腸鏡；問卷評估等。腸鏡獲取病理診斷是篩查的金標準，但中國人口基數大，完成腸鏡篩查所需周期長，病變檢出率低，受檢人群不夠濃縮。加上腸道準備麻煩痛苦，且為侵入性檢查，人群接受度低。為了提高篩查的準確度、人群的接受度，濃縮接受腸鏡檢查的人群。本研究擬聯合糞便微小染色體維持蛋白2檢測和多靶點糞便 FIT-DNA 聯合檢測技術對亞太結直腸癌篩查評分系統（APCS）評分大于2分的人群進行篩查，探討聯合兩種篩查技術對結直腸癌篩查的效能。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究為前瞻性、觀察性研究。連續性納入2020年3月至2021年12月于深圳市龍華區人民醫院胃腸外科門診就診且APCS評分大于2分患者，共600例。

納入標準：（1）年齡40～74歲；（2）有輕微腸道癥狀人群，如排便習慣改變、便血、腹脹腹痛、便秘等；（3）有腸癌家族史人群；（4）有既往病史人群，如腸道慢性炎癥疾??；（5）腸鏡不依從人群；（6）做腸鏡有風險人群，如嚴重糖尿病患者。

排除標準：（1）既往結直腸癌相關手術史；（2）存在腸鏡檢查的禁忌癥，不能耐受腸鏡檢查者；（3）不愿提供糞便樣本；（4）入選前 3 個月內曾經參加過任何藥物試驗者；（5）有酗酒，吸毒或藥物濫用史；（6）研究者認為不適宜參加本臨床試驗者。共提供600個常衛清檢測試劑盒免費篩查。本研究通過深圳市龍華區人民醫院倫理委員會審核批準[KY2019106]。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 篩查方法

1.2.1 多靶點糞便FIT-DNA聯合檢測

本研究采用諾輝健康科技有限公司提供的多靶點糞便 FIT-DNA 聯合檢測技術試劑盒（常衛清）。入組人員在專業技術人員指導下學習試劑盒附帶的糞便采樣視頻，并嚴格按照視頻提示標準采樣，然后由快遞人員上門收取標本送至廣州諾輝醫學檢驗實驗室進行檢測，并出具檢測報告，陽性人群建議行全結腸鏡檢查以確診，并再次收集糞便標本，檢測糞便中微小染色體維持蛋白2（MCM2）的表達量。

多靶點糞便FIT-DNA聯合檢測技術的工作原理是通過KRAS基因突變、BMP3/NDRG4基因甲基化和血紅蛋白的多組學檢測手段，經已獲得專利且被藥監局批準的邏輯回歸模型算法進行計算綜合評分，得出送檢樣本結直腸癌風險評估結果。檢測評分的分值大于等于165分是陽性結果，分數小于165分是陰性結果。

1.2.2 糞便MCM2表達量的檢測

分析結直腸腺瘤患者及腺癌患者糞便中MCM2 mRNA的表達差異（采用William E.Bennett Jr方法在糞便中提取微量MCM2 mRNA）。

（1）100 mg凍存糞便加入1 mL的RNA Bee（美國Tel-Test公司）；（2）離心后的上清液加入酸化的玻璃微球，蛋白核酸提取儀離心（美國Thermo公司提供Fast Prep FP120）；（3）提取液使用德國Qiagen公司提供RNeasy spin column柱子微量提取RNA；（4）實時熒光定量逆轉錄PCR分析正常人群、結直腸腺瘤患者及腺癌患者糞便中MCM2 mRNA的表達差異。

1.3 統計學分析

使用SPSS 18.0對收集的一般資料和臨床資料進行統計學匯總與梳理。計量資料用（x±s）表示，進行t檢驗；計數資料用[n（%）]表示，進行χ2檢驗。多個樣本均數講的比較用SNK-q檢驗。約登指數=敏感度+特異度-1。約登指數：是評價篩查試驗真實性的方法，假設其假陰性（漏診率）和假陽性（誤診率）的危害性同等意義時，即可應用約登指數。表示篩檢方法發現真正的患者與非患者的總能力，指數越大說明篩查實驗的效果越好，真實性越大。以P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 各檢測技術單獨檢測結果

多靶點糞便 FIT-DNA聯合檢測技術試劑盒初篩陽性結果80例，初篩陽性患者在進行腸鏡檢查的同時，再留取糞便標本進行MCM2檢測。病理結果提示陽性（結直腸癌）8例，陰性72例，見表1。

表1 各檢測技術單獨檢測結果

2.2 不同檢測方法的診斷價值比較

病理學金標準診斷80例經過FIT-DNA初篩陽性中8例為結直腸癌。經MCM2單獨檢測，80例初篩陽性中，陽性33例，陰性47例；兩種方法聯合檢測，80例初篩陽性患者中陽性19例，陰性61例。MCM2檢測與 病理學診斷比較，有差異（P＜0.05，表2）；聯合檢測與病理學診斷比較，有差異（χ2=9.091，P＜0.05，表3）；兩種篩查技術聯合檢測與MCM2檢測比較，有統計學意義（χ2=3.84，P＜0.05，表4）。聯合檢測的約登指數為84.72%，見表5。

表2 MCM2檢測單獨檢測的診斷價值[n（%）]

表3 聯合檢測的診斷價值[n（%）]

表4 MCM2單獨檢測和聯合檢測

表5 不同檢測方法的診斷價值比較

2.3 MCM2在不同組織的表達量

熒光定量逆轉錄PCR檢測結果示：MCM2在正常結直腸黏膜、腺瘤、結直腸癌糞便中的表達量分別為（1.103±0.901）、（17.150±4.125）、（47.070±4.551），結果顯示任意兩組間總體均數差異有統計學意義（P=0.026，見表6）。

表6 MCM2在不同組織的表達量

3 討論

隨著社會經濟的發展，人們的生活方式發生了變化，且人口老齡化逐漸增大，全球每年新增的惡性腫瘤，大約有1/10為結直腸癌，位居世界癌癥第三位。2016 年中國癌癥統計數據顯示：中國新發的癌癥約406萬例，其中結直腸癌占比40.8%，位居第二位[3]。因此結直腸癌的防治工作刻不容緩。當前，世界衛生組織已把結直腸癌列為最適合進行早期篩查和預防的癌癥之一，如何強化早期篩查、防治已成為社會各界的共識。在早期預防措施中，早診篩查的作用特別重要，是抑制結直腸癌高發的重要手段。世界各發達國家已做了相關的工作并取得了明顯的效果[4-6]。

近幾年多靶點糞便FIT-DNA聯合檢測逐步發展成熟，將糞便 DNA分子技術和免疫法糞便FIT結合起來，不但使FIT對結直腸癌篩查的敏感度得到進一步的提升，同時也對結直腸發展期腺瘤篩查的敏感度也有了很大的提升。美國的研究表明，多靶點糞便FITDNA聯合檢測對進展期腺瘤敏感性高達42%[7-8]。多項研究表明[9-10]，常規體檢人群篩查中，陽性率在10%左右。我們對亞太結直腸癌篩查評分系統（APCS）[11]評分大于2分的人群進行篩查發現，陽性率為13.3%。然而篩查陽性的這80例患者中，經過腸鏡檢查，病理確診為結直腸癌的僅8例。腸鏡檢查的順應性差，腸道準備較麻煩，且是侵入性操作，患者的接受度低，這些均會成為腸鏡篩查的障礙，且增加患者的痛苦。能否通過進一步的無創篩查，濃縮接受腸鏡檢查的人群成為我們研究的重點。

目前已有的研究表明，MCM2是細胞周期階段的特異性標記，在進入細胞周期的細胞中都存在表達，但是在分化成熟的細胞和靜止期（G0期）細胞中，MCM2不表達[12-15]。因此，MCM2能作為細胞增殖標記物來標記增殖發育細胞中產生的異常和突變，其特異性能比常規增殖標記物 PCNA和 ki-67更好，并且多項研究證實，MCM2的細胞表達陽性與細胞發育異常的嚴重性相關，MCM2在結直腸腺瘤的腺上皮組織中也有高表達，盡管MCM2在結直腸腺瘤和腺癌組織中的表達部位沒有顯著的差別，但是二者在MCM2表達量上存在著統計學差異[16-20]。這就為通過定量檢測結直腸癌患者及結直腸腺瘤患者糞便中MCM2的表達差異提供了可能。

我們對多靶點糞便FIT-DNA聯合檢測的患者再次留取糞便，檢測糞便中的MCM2 mRNA在正常人群、腺瘤及結直腸癌中的表達差異，實驗證明表達量差異有統計學意義。以往的研究顯示，MCM2在分化成熟、靜止階段的細胞中沒有表達[21-22]。MCM2在胃癌的研究中顯示[23-24]，微小染色體維持蛋白對病人的預后有一定的影響，而在胃部腺瘤和腺癌中，其表達存在著差異性[25-26]。大腸中關于MCM2在大腸正常上皮組織、大腸腺瘤和大腸癌組織的表達狀況進行了探討，發現腺瘤中MCM2的表達量比正常組織要高，但比癌組織要低[27]。

我們的實驗表明，在多靶點糞便FIT-DNA聯合檢測初篩陽性的患者，再進行糞便MCM2檢測，對結直腸癌篩查的敏感度可達100%，特異度為84.72%。多靶點糞便 FIT-DNA 聯合檢測技術以及糞便微小染色體維持蛋白2檢測應用于結直腸癌患者的初篩具有一定的臨床價值，兩種方法均具有重復性強、客觀性高、簡便易行的優勢。將兩者聯合檢測可提升篩查的敏感度、特異度和約登指數，可作為篩查、診斷結直腸癌的重要輔助手段，能讓接受腸鏡檢查的患者更加濃縮，減少患者的痛苦，節約有限的醫療資源。相對于結腸鏡來說，在多靶點糞便FIT-DNA聯合檢測初篩陽性的患者，再進行糞便MCM2檢測，受檢者痛苦小，居家取樣方便，不但節省了醫療資源，還增加了人們的依從性，同時大幅度減小了腸鏡檢查所造成的出血、穿孔等并發癥的發生。