3株酵母菌的分離鑒定及發酵液除草潛力的研究

施生姣，宋維敏，程 亮，魏有海

（1.青海大學, 青海 西寧 810016；2.青海省農林科學院, 青海 西寧 810016；3.青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室, 青海 西寧 810016；4.農業農村部西寧作物有害生物科學觀測實驗站, 青海 西寧 810016；5.青藏高原生物技術教育部重點實驗室, 青海 西寧 810016）

0 引言

【研究意義】豬殃殃、密花香薷、藜等雜草是我國農田的重要惡性雜草，繁殖能力強，蔓延擴散快，危害損失重[1-3]，生產中依賴化學除草劑控制其危害。由于化學除草劑長期連續使用及不合理使用同種或同類除草劑，導致農田雜草群落演變加速、抗藥性雜草生物型數量和程度明顯增加、作物藥害發生頻繁、農產品質量安全以及環境污染加劇等問題凸顯[4-5]，雜草防治難度不斷加大，農藥使用量呈上升趨勢。雜草生物防控已引起全球環保與植保工程科技人員的高度重視。微生物除草劑具有制作原料來源豐富、開發費用相對較低、對環境和非靶標生物安全等顯著優勢，其高效利用模式研發及應用對于實現農藥減量使用，遏制雜草加重發生的態勢，進而實現可持續的現代農業發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】自然界中的致病菌是微生物除草劑的來源之一[6]，目前已有多個屬的真菌被研發或登記成為微生物除草劑，用于多種雜草的生物防治。目前世界范圍內商品化的微生物除草劑產品有20余種[7]。我國已成功建立多個病原菌與雜草之間的致病體系[8-9]，且研發出具有自主知識產權的微生物除草劑產品，例如魯寶一號[10]。朱海霞等[11]研究發現鐮刀菌GD-5對密花香薷及藜的致病性較強，其鮮重防效可達65%以上。鏈格孢HZ-1粉劑對密花香薷及藜在田間環境下抑制作用顯著[12]。程亮[13]研究發現生防菌PA-2可通過影響豬殃殃的細胞膜透性導致其死亡而達到生物防除的目的，針對豬殃殃、密花香薷和藜等3種雜草的生防菌主要為真菌，可通過孢子直接侵入或產生代謝產物以達到控制雜草的目的?！颈狙芯壳腥朦c】酵母菌的次生代謝物生物活性廣泛，主要用于食品發酵等[14-16]，但目前應用酵母菌進行雜草防除方面的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過3株酵母菌對豬殃殃、密花香薷和藜等3個青海省農田優勢雜草的生物活性測定及其對青海主要農作物的安全性評價并采用形態學觀察結合ITS序列及26S rDNA序列分析明確3株酵母菌的分類地位，豐富了可用于雜草防控的微生物菌種資源，為該菌株在雜草防控中的研發與應用提供基礎，可有效減少化學除草劑的使用量，延緩雜草抗藥性生物型的產生和發展。

1 材料與方法

1.1 供試材料

雜草：豬殃殃（Galium spuriumL.）、密花香薷（Elsholtzia densaBenth.）、藜（Chenopodium albumL.）種子，于2020年采于青海省農林科學院試驗田（36.724 458oN，101.750 661oE）。

作物：燕麥（加燕2號）、小麥（青春38號）、蠶豆（青海13號）、青稞（柴青1號）、油菜（青雜11號）、豌豆（草原26號）和馬鈴薯（青薯9號）。

酵母菌培養采用酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD）：酵母膏 10.0 g·L-1，蛋白胨 20.0 g·L-1，葡萄糖 20.0 g·L-1，瓊脂20.0 g·L-1；酵母菌發酵采用YPD液體培養基。

1.2 土壤酵母菌分離

采用稀釋涂布法分離西寧市湟中區溫室辣椒根際土壤酵母菌[17]。取90 mL無菌水加入10 g土樣，制備成土壤懸浮液后將其稀釋至10-3、10-4，吸取200 μL土壤稀釋液涂布于YPD培養基平板上，每個處理設置3個重復。于28 ℃培養3～5 d后挑取顏色形態不同的單菌落，在YPD平板上純化培養并4 ℃保存。

1.3 具有除草潛力酵母菌菌株篩選

將純化的菌株培養7 d，打取菌餅（直徑0.5 cm）接種至YPD液體培養基中（每250 mL三角瓶100 mL YPD），于 25 ℃、180 r·min-1培養 7 d，發酵液真空抽濾后經0.22 μm微孔濾膜過濾備用。將雜草幼苗培育至1葉1心時，選取整齊一致的健壯幼苗移栽至43 cm×25 cm×12 cm花盆中，每盆20株，在溫度25 ℃、光照周期12 L/12 D，環境相對濕度60%～70%的條件下培養。待雜草幼苗長至7～10葉期時，取100 mL發酵濾液倒入小噴壺中，加入0.5%吐溫-80，將濾液以250 mL·m-2噴施于雜草植株上，噴霧處理后的雜草植株置于上述條件的溫室中培養。每處理重復4次，以只噴無菌加等量吐溫-80的YPD培養液的植株作為對照。于處理7 d后觀察雜草發病情況，參考文獻[18]記錄密花香薷、藜、豬殃殃的傷害程度。7 d后按下式計算傷害率和鮮重抑制率。

1.4 酵母菌分離菌株對主栽作物安全性測定

將酵母菌株發酵濾液以250 mL·m-2分別噴霧于3～4葉期的馬鈴薯、青稞、豌豆、小麥、燕麥、蠶豆和油菜上，培養方法同方法1.3。以只接YPD培養液植株為對照，每處理重復4次。7 d后調查作物受害情況，測定株高和鮮重，計算株高抑制率和鮮重抑制率。參考程亮等[19]的方法記載作物受害程度。

1.5 菌株16-8發酵液與氯氟吡氧乙酸混用對豬殃殃的除草活性測定

20%氯氟吡氧乙酸乳油（美國陶氏益農公司）按推薦劑量750、375、187.5 mL·hm-2設置3個單用及和16-8菌株發酵液250 mL·m-2混用處理，以菌株16-8發酵液單用為對照，另設等量清水為空白對照，共計8個處理，每處理10株，每個處理3次重復，隨機排列。于豬殃殃3～4葉期進行噴霧處理，記錄豬殃殃受害癥狀，7、14 d后調查鮮重防效。

1.6 菌株鑒定

1.6.1 形態學鑒定 取在YPD平板上培養7 d的酵母菌菌落的孢子，制成臨時玻片，顯微鏡下觀察孢子形態并拍照。

1.6.2 分子生物學鑒定 DNA提取采用Ezup柱式提取試劑盒[生工工程（上海）股份有限公司]。用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增 ITS 基因序列， 用NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和 NL4 (5′-GGTCCGTGT-TTCAAGACGG-3′)擴增26S rDNA基因序列。PCR反應體系（25 μL）：10×PCR buffer（含 Mg2+） 2.5 μL， 模 板 DNA 0.5 μL，dNTPs 1.0 μL，上、下游引物各 0.5 μL（10 μmol·L-1），5 U·μL-1Taq酶 0.2 μL，ddH2O 補足至 25 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，送至由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序所得序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對，采用MEGA 7.0軟件以鄰近法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹。

1.7 數據分析

試驗數據采用DPS 15.10軟件進行統計分析，顯著性檢驗采用鄧肯氏法（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 酵母菌分離及其除草潛力

共獲得8株不同形態和顏色的酵母菌，對雜草生長的抑制作用程度不同，其中16-8發酵液對豬殃殃、密花香薷和藜的傷害率分別為90.17%、66.67%和95.00%，鮮重抑制率分別為88.63%、56.90%和78.77%，3種雜草的鮮重均低于對照組，差異顯著（P＜0.05）（表1）；12-6菌株對豬殃殃、密花香薷和藜的傷害率分別為87.50%、75.00%和43.33%，對豬殃殃的鮮重抑制率達75.80%，密花香薷和藜的鮮重抑制率分別為62.72%和43.25%，3種雜草的鮮重與對照組相比，均差異顯著（P＜0.05）；6-3菌株對豬殃殃、密花香薷和藜的傷害率分別為0%、36.67%和41.67%，對3種雜草的鮮重抑制率為9.41%、46.29%和43.46%，豬殃殃和藜的鮮重與對照相比，均差異不顯著（P＞0.05），但密花香薷鮮重低于對照組，差異顯著（P＜0.05），從各個分離菌株看，16-8菌株發酵液對豬殃殃和藜幼苗生長的抑制作用要高于12-6和6-3菌株發酵液，但12-6菌株發酵液對密花香薷幼苗生長抑制作用要高于16-8和6-3菌株發酵液。

表1 3株酵母菌菌株發酵液對雜草幼苗生長的抑制作用Table 1 Inhibition effect of yeast fermentation broths on growth of weed seedlings

16-8處理后豬殃殃表現癥狀為植株矮小、葉片輕微失綠、發黃葉片明顯萎蔫，而12-6處理后，豬殃殃植株表現為矮小、葉片輕微失綠發黃、萎蔫、植株莖干變細、分蘗數變少。6-3發酵液處理7 d后，豬殃殃除表現植株葉片輕微萎蔫之外無其他明顯癥狀，10 d以后傷害癥狀沒有恢復，繼續加重（圖1-A）。12-6處理條件下的密花香薷植株矮小，葉緣干枯新生葉片向內卷曲嚴重，花苞明顯枯焦發黃、葉面積窄小，10 d后病情持續加重。16-8處理對密花香薷表現癥狀與12-6相似但傷害較輕。6-3處理的植物略微矮小，花苞枯焦發黃較12-6、16-8處理較輕，10 d以后傷害癥狀沒有恢復，且繼續加重（圖1-B）。12-6處理藜表現為1/2葉片有輕微青枯癥狀，1/4葉片邊緣發黃干枯。16-8處理藜表現為植物矮小、3/4葉片青枯，1/2葉片萎蔫失綠發黃。6-3處理藜表現為植株略微矮小，葉片邊緣有輕微發黃，10 d以后傷害癥狀沒有恢復，繼續加重（圖1-C）

圖1 3株酵母菌發酵液對多種雜草幼苗生長的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of yeast fermentation broths on growth of weed seedlings

2.2 酵母菌菌株對主栽作物的安全性測定

由表2可知，接種酵母菌發酵液7 d后，16-8、12-6菌株對燕麥、小麥、青稞、蠶豆、豌豆、油菜和馬鈴薯均沒有傷害，對作物鮮重與株高影響很小，表現對作物安全。6-3菌株對燕麥、小麥、青稞和油菜4種青海主栽作物無傷害，對株高與鮮重無影響，但對蠶豆及豌豆表現出對株高和鮮重有明顯抑制，對蠶豆的株高和鮮重抑制率分別為12.73%和14.73%，對豌豆的株高和鮮重抑制率為10.69%和22.61%（表3）。

表2 3株酵母菌株發酵液對不同作物的安全性比較Table 2 Effect of yeast fermentation broths on crop safety

表3 3株酵母菌株發酵液對不同作物抑制作用Table 3 Inhibition effect of yeast fermentation broths on crops （單位：%）

2.3 分離菌株16-8發酵液與氯氟吡氧乙酸混用對豬殃殃的除草活性測定

16-8菌株發酵液與化學除草劑氯氟吡氧乙酸混用噴施48 h后，豬殃殃葉片出現萎蔫和部分枯死癥狀，72 h時植株全部枯死；單用發酵液噴施處理48 h后，豬殃殃植株開始出現萎蔫癥狀，60 h時部分葉片出現枯死，72 h豬殃殃植株全部枯死；如圖2所示，單用化學除草劑750 mL·hm-2時，7 d時萎蔫癥狀明顯，16-8菌株發酵液與氯氟吡氧乙酸混用處理較其化學除草劑單用處理相比，豬殃殃葉片萎蔫嚴重，出現死亡植株，14 d時抑制程度加重，21 d時豬殃殃已全部枯死。由此可見，16-8菌株發酵液與氯氟吡氧乙酸混用處理較其發酵液單用處理相比，豬殃殃葉片枯死癥狀出現早12 h，比單用化學除草劑早5 d。從鮮重抑制率來看，接種20%氯氟吡氧乙酸乳油7 d后，在其供試劑量下對豬殃殃的鮮重抑制率均在65%以下，單用16-8菌株發酵液處理，鮮重抑制率為85.19%，50%和25%推薦劑量化學除草劑+16-8菌株發酵液混用的鮮重抑制率分別為85.65%和83.05%；接種后14 d，20%氯氟吡氧乙酸乳油在推薦劑量（750 mL·hm-2）處理時對豬殃殃的鮮重抑制率僅為79.42%，而單用16-8菌株發酵液處理，鮮重抑制率為89.65%，50%和25%推薦劑量化學除草劑+16-8菌株發酵液混用的鮮重抑制率分別為91.61%和88.60%，對鮮重進行方差分析可知，單用化學除草劑與混用以及單用16-8菌株發酵液之間比較，存在顯著性差異，但單用16-8菌株發酵液與混用處理之間比較，差異不顯著（表4）。

表4 氯氟吡氧乙酸與16-8菌株發酵液混用對豬殃殃的防效Table 4 Efficacy of 16-8 fermentation broth per se or in combination with fluroxypyr on controlling G.aparine

圖2 除草劑和16-8菌株混用后7 d的除草效果Fig.2 Efficacy of herbicide, 16-8 or herbicide+16-8 on weeds 7 d after treatment

2.4 菌株的鑒定

2.4.1 形態學鑒定 菌株16-8在YPD培養基上以單菌落出現，菌落邊緣整齊，表面干燥，中間凸起，圓形，顏色為灰白色（圖3-L）。鏡檢結果發現菌體呈現為圓形、卵圓形（圖3-O）。菌株12-6在YPD培養基上以單菌落出現，菌落邊緣不規則，表面凸起顏色呈現乳白色（圖3-M）。顯微鏡下觀察發現該菌呈現圓形、橢圓形初步鑒定為酵母菌（圖3-P）。菌株6-3在YPD培養基上其菌落乳白色，菌落邊緣規則不透明，極容易被挑起（圖3-N）。鏡檢結果發現該菌形態為圓形、橢圓形（圖3-Q）。

圖3 分離菌株菌落形態及其孢子顯微觀察Fig.3 Colony morphology and microscopic images of 6-3, 12-6, and 16-8 spores

2.4.2 分子生物學鑒定 以16-8、12-6和6-3菌株基因組為模板，對分離菌株的ITS及26S rDNA基因片段進行PCR擴增與測序。進一步聯合ITS、26S rDNA基因序列構建系統發育樹，結果顯示（圖4），菌株16-8與Pichia kudriavzevii處于系統發育樹的同一最小分支，菌株12-6與Kluyveromyces marxianus處于系統發育樹的同一最小分支，菌株6-3與Meyerozyma guilliermondii處于系統發育樹的同一最小分支。將16-8、12-6和6-3序列在NCBI上BLAST進行同源對比，并結合形態學分析結果將16-8鑒定為庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），12-6與馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）6-3與季也蒙邁耶氏酵母（Meyerozyma guilliermondii）。

圖4 3個菌株（16-8、12-6和6-3）基于ITS及26S rDNA基因構建的鄰接法系統發育樹Fig.4 Phylogenic NJ trees based on ITS rDNA and 26S rDNA sequences of Strains 16-8, 12-6, and 6-3

3 討論與結論

近年來，微生物的次生代謝產物被開發為除草劑的研究廣受關注，有研究表明，微生物毒素具有開發為除草劑的巨大潛力[20-22]。姜述君等[23]研究表明，來源于畫眉草彎孢霉發酵液中的化合物α, βdehydrocurvularin會影響馬唐葉片新陳代謝繼而導致葉片壞死。Chen等[24]研究結果表明，灰黃青霉的次級代謝產物能有效抑制列當種子的萌發，從而達到防除惡性寄生性雜草列當的目的。本研究發現3株酵母菌發酵液對供試雜草的株高和鮮重有明顯的抑制作用，噴霧處理7 d后，16-8菌株對豬殃殃、密花香薷和藜的傷害率分別為90.17%、66.67%和95.00%，鮮重抑制率分別為88.63%、56.90%和78.77%，因此該菌株的發酵液有較好的開發為微生物除草劑的潛力。但目前對發酵液中的具體除草活性物質尚不清楚，有待進一步研究。

在微生物除草劑的篩選過程中首要考慮就是安全性問題[25-26]。本研究結果表明，6-3和12-6菌株發酵液對測試的作物安全，無不良影響。16-8菌株發酵液除對蠶豆和豌豆株高和鮮重有輕微的影響外，對其他5種作物表現為安全。為全面評價這些菌株的安全性，還應進一步加大其他作物的安全性評價。

微生物在雜草綜合治理中可以有多種不同的應用方式。由于大多數微生物菌株只針對一種雜草，所以將其與化學除草劑結合使用在理論上是可行的。微生物菌株Myrothecium verrucaria與化學除草劑共同使用可以有效地提高其活性[27]。Song等[28]采用Pyricularia setariae與1/10推薦劑量的烯禾啶混用可以更有效地防治狗尾草。同樣，Phoma proboscis與亞致死劑量的2,4-D混用可以更有效地防治Comvolvulus arvensis[29]。與單獨使用相比，Colletotrichum coccodes與噻苯隆混用可以提高真菌的侵染和苘麻的防除效果[30]。許多化學除草劑僅對剛剛出苗的圓葉錦葵有效，而如果Colletotrichum gloeosporioidsf.sp.malvae與除草劑結合使用，防效可持續至第4～5片真葉期。與單獨使用真菌或嗪草酮或咪唑乙煙酸相比，二者混用可以極大地提高防治效果，并減少所需藥量[31]。本研究發現：當16-8菌株發酵液與25%～50%推薦劑量的氯氟吡氧乙酸混用時，對豬殃殃的鮮重抑制率仍高達88.60%～91.61%，與單獨使用16-8菌株發酵液的鮮重抑制率相當，表明混用能夠提高單獨使用除草劑或菌株發酵液的防除效果。因此，可選用微生物菌株與化學農藥的復配用于雜草的防除，但在田間的防治效果有待進一步試驗，包括使用劑量、使用方法及最佳使用時間等。同時通過探索與農業防治等其他措施的配合來實現持續、高效的除草目的。

通過對這3株菌株進行平板上菌落形態、顯微鏡下孢子形態觀察，結合分子鑒定，確定這3個分離菌株均為酵母菌。近年來，關于酵母菌生物活性的報道越來越多。Pichia kudriavzeviiOT38接入土壤15 d以后提高了土壤生物炭、脫氫酶活性以及膠體多糖等含量，可以作為土壤改良劑利用[32]。Kluyveromyces marxianusHP-10菌株懸浮液通過營養和空間的競爭以及誘導抗病性相關酶的活性，較好地抑制了柑橘采后綠霉病菌，保證了果實的品質[33]。采后用Meyerozyma guilliermondiiSQUCC-33Y處理草莓果實可以顯著降低由Alternaria alternata引起的果實腐爛病斑，該拮抗酵母菌可作為一種生物殺菌劑用于防治A.alternata引起的草莓采后果實腐爛病[34]。有研究發現，酵母菌的次生代謝物生物活性廣泛，但目前尚未見其在除草方面的報道。本研究首次報道酵母菌發酵液具有優異除草潛力，今后可加深對菌株16-8的研究，分析其代謝產物中具有除草潛力的活性成分。本研究拓展了具有除草潛力的微生物資源，為微生物除草劑的開發利用提供菌株資源。