紅纖維蝦形草(Phyllospadix iwatensis)種子形態及內部特征

韓通, 李晶晶, 劉正一, 劉凱, 張金浩, 秦松, 鐘志海

1. 河海大學海洋學院, 江蘇 南京 210098;

2. 中國科學院煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003;

3. 東營市海洋發展和漁業局, 山東 東營 257091;

4. 煙臺市海洋經濟研究院, 山東 煙臺 264034

海洋植物的繁育方式具有高度多樣性, 而延續海洋植物繁衍的遺傳信息載體, 即生殖細胞或果實、種子等生殖器官是海洋植物發育生物學、遺傳學研究的重要內容(徐少春, 2017; Iurmanov et al,2021)。目前對藻類等海洋低等植物的生殖過程研究相對較多, 如大型藻類的有性繁殖、營養繁殖等, 而關于海洋高等沉水植物海草繁殖過程研究則主要集中在繁殖器官如花、果實、種子及種子萌發相關內容。另外由于海草本身是較為稀少的海洋植物類群,全球分布的海草種類僅有74 種, 隸屬于6 科13 屬(Short et al, 2011), 相關研究數量遠少于對于藻類生殖過程相關研究, 但海草對于海洋生態環境穩定、碳中和增匯和漁業資源維護有著重要意義(Orth et al,2006; 楊頂田 等, 2013; 陳啟明 等, 2020), 同時海草床生態系統也作為捕獲大氣中CO2的藍碳生態系統而受到更多關注(李捷 等, 2019), 而對于海草床生態系統的保護和修復勢必需要對于種子等繁育載體進行更加深入的研究。

蝦形草屬于鰻草科(Zosteraceae)、蝦形草屬(Phyllospadix), 有異名蝦形藻、蝦海草等, 于2014年“第十一次國際海草生物學研討會”(The 11th International Seagrass Biology Workshop)期間統一中文名為蝦形草(黃小平 等, 2016)。在全球范圍內, 蝦形草屬(Phyllospadix)有5 種, 在中國僅有2 種, 分別為紅纖維蝦形草和黑纖維蝦形草。蝦形草通常生長于潮間帶和潮下帶的巖石質海底, 能夠為魚類提供產卵、育幼和索餌場所。目前幾乎所有的蝦形草海草床都處于衰退狀態, 山東半島沿岸曾經十分豐富的蝦海草資源也幾乎消失殆盡(馬瑞 等, 2019)。對于海草床的修復工作, 有賴于海草的繁殖載體——種子。海草作為高等植物, 果實和種子承載著其生活史中繁育階段的主要任務, 同時也常被應用于海草床修復工作中, 具有與較高研究價值(于碩 等,2019)。目前, 我國對蝦形草的研究尚少, 關于蝦形草果實、種子的描述更為稀少。我國國內學者近年來對蝦海草種子的研究只有曹政飛等對山東威海雙島灣的紅纖維蝦海草的形態特征及其對海洋環境的適應性進行了研究, 對其植株、根狀莖、根、葉、花、果實和種子的形態進行了描述(曹政飛 等,2015), 但也仍未能具體對重要的繁育載體種子進行描述。

本研究從中國山東省煙臺市南長山島采集到蝦形草植株和果序, 通過DNA 分子鑒定, 確定采集到的蝦形草為紅纖維蝦形草(Phyllospadix iwatensis)。對紅須根蝦形草的果實、種子等蝦形草主要繁育載體相關內容的詳盡描述, 包括生長環境、種子外部特征、內部結構以及萌發幼苗等。希望為蝦形草種質庫保護與海草床修復, 以及海洋高等沉水植物的種子研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 采集區域

本研究所用材料采集自中國山東省煙臺市蓬萊區長島海洋生態文明綜合試驗區南長山島孫家村海岸潮間帶(37°55'16.56"N, 120°45'33.02"E), 位于黃海和渤海交匯處(圖1)。采集時間為2021 年7—8 月,水溫為23～25 ℃, 鹽度為31.5‰～33.5‰。采樣地點研究區域為沿岸線2km 的潮間帶, 蝦形草海草床分布非連續分散隨機, 在2km 范圍內的潮間帶各處散布, 取樣時盡最大可能分散隨機。共設計采樣位點3處, 彼此距離超過50m, 為不同群體樣本, 就局地物種特征而言具有一定代表性。

圖1 山東省煙臺市南長山島的蝦形草采樣位點Fig. 1 The sampling sites for Phyllospadix iwatensis on the Southern Changshan Island, Yantai, Shangdong

1.2 植株分子鑒定

將蝦形草植株葉片樣本帶回實驗室后液氮低溫研磨, 使用一步法多糖多酚植物基因組DNA 抽提試劑盒(北京諾貝萊生物科技有限公司)對其進行凝膠提取DNA, 設計引物完成PCR擴增與膠回收, 產物進行測序。引物合成與測序工作由青島睿博興科生物技術有限公司完成。用于擴增18s rRNA 和ITS-1 的寡核苷酸如下: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG(ITS1F); 5′-GC TGCGTTCTTCATCGATGC (ITS1R), 5′-CAACCTGGTT GATCCTGCCAGT (18SF); 5′-CTGATCCTTCTGCAGG TTCACCTAC (18SR) (Choi, 2010)。

1.3 種子的采集與保存

摘取果序, 內包被有種子, 置于海水中暫存,低溫保存帶回實驗室。參考潘金華(2015)的海草種子保存辦法, 除去果序外其他雜物, 將種子帶莢保存于沙濾海水中, 鹽度31‰, 保存溫度為21 ℃, 并向海水中充入空氣, 每5d 更換一次海水。

1.4 果實種子外觀描述與測量

對果序、果實、種子各部分的長度、寬度、厚度及直徑等進行測量, 并拍照。其中以果序尖端至莢柄處距離作為長度, 果序左右兩側之間距離作為寬度, 腹面與背面之間距離作為厚度, 另測量莢柄長度。果實呈翅果, 測量兩翅長, 除兩翅外整體正面近似圓形, 故直接測得直徑作為正面數據; 果實平放時上下面之間距離作為厚度。剝皮后種子整體近球體, 僅測定球體直徑。

1.5 種子切片鑒定

采用組織原形態、番紅固綠染色和糖原PAS 染色法對種子內部組織進行染色。實驗材料經多聚甲醛固定劑(上海阿拉丁生化科技)固定, 用輪轉式石蠟切片機(Leica RM 2245)進行切片, 染色切片分別使用番紅-固綠染色液(Solarbio G1375)、糖原PAS染色液(Solarbio G1281)進行番紅固綠染色和糖原PAS 染色, 其中番紅染料能顯示植物木質化、木栓化和角質化組織, 固綠染料能夠對纖維素細胞組織進行染色; 糖原PAS 染色液常用來顯示糖原和其他多糖、中性黏液性物質和某些酸性物質, 以及色素、淀粉樣物質等。切片和染色完成后在Leica DM1000 LED 生物顯微鏡下觀察并拍攝。

1.6 蝦形草種子萌發

將蝦形草種子分別置于小燒瓶中, 設置鹽度梯度4 個水平(5‰、10‰、15‰、20‰), 每個水平3個重復, 每個小燒瓶中各10 粒蝦形草種子, 共計12組。充分鋪開種子, 便于觀察。每天觀察記錄每個組中種子的萌發情況。小燒瓶用封口膜進行密封以隔絕空氣維持低含氧水平, 使用海水為天然海水和純凈水配置。培養箱內溫度為 15 ℃, 光照強度為50μmol photons·m–2·s–1, 光暗周期設置12h。子葉長度超過1cm 的種子被認為成功萌發。

2 結果與分析

2.1 DNA 鑒定結果

結合形態學檢索表和分子生物學手段, 與紅纖維蝦形草相關分子研究論文進行序列比對, 結果表明, 采集樣本與參考文獻(Kim et al, 2010)中ITS-1和18s rRNA 序列相似度分別為99.46%和99.43%,可以鑒定為同一物種, 即紅纖維蝦形草(Phyllospadix iwatensis)。

2.2 蝦形草生長環境及形態

蝦形草主要分布于風浪較大的開闊海域, 少數分布在封閉海域, 通常生長于潮間帶和潮下帶的巖石質基底上, 低潮時, 分布在較高位置的蝦形草會露出部分, 在高潮位時植株完全淹沒(圖2a、b)。

植株本身根莖較為粗短(圖2c、d), 匍匐, 莖直徑4～5mm, 較短, 每節1 枚葉。在植株的基部位置常纏結有紅棕色毛狀纖維(圖2c); 根系發達。葉互生, 具有葉鞘; 葉呈線形, 常 5 脈, 成熟葉寬1.0～1.4mm, 長80～130cm, 葉邊緣有時呈鋸齒狀。繁殖期植株具果序 1 枚, 位于植株靠下接近根莖部的位置; 果序柄扁平, 果序由佛焰苞發育而成,整體呈彎蝦形。

圖2 紅纖維蝦形草生長環境及植株形態Fig. 2 The growing environment and shoot morphology of the surfgrass Phyllospadix iwatensis

2.3 果序形態

繁育期的紅纖維蝦形草在開花結果后具有明顯的果序(圖3、表1), 繁殖枝生長在接近蝦形草根部的區域, 上有由單雌蕊發育而成的果序, 每株蝦形草一般會形成1 個果序, 內含果實4～8 顆, 兩排緊密交錯組成, 外部包被有一個較大鞘狀苞片, 果實占據果室內大部分空間。紅纖維蝦形草成熟果序呈深棕近黑色, 整體呈紡錘形, 中部膨大, 另有果序柄與植株莖部相連, 果序鞘長為2.6～4.0cm, 平均約3.4cm;鞘寬為0.5～0.7cm, 平均約0.6cm; 鞘厚0.3～0.5cm, 平均約0.4cm; 果序柄長1.9～4.2cm, 平均約2.8cm。

圖3 紅纖維蝦形草(Phyllospadix iwatensis)果序形態Fig. 3 The shape of Phyllospadix iwatensis involucre

表1 23 粒紅纖維蝦形草果序外觀描述數據統計結果Tab. 1 The statistical results of involucre shape

2.4 蝦形草果實與種子形態

果實類型為小堅果, 較扁, 馬掌形, 長2～3mm,寬達4～5mm, 具有短喙和中脊, 每邊各有1 近軸的背溝, 從中間到側邊有極彎的剛毛, 果實成熟后可從殘存的花序軸上脫落。果實前端具兩翅, 翅內側具有密生的長鬃毛, 能夠輔助錨定在固著物上(圖4a、b)。

圖4 紅纖維蝦形草(Phyllospadix iwatensis)果實及種子整體形態Fig. 4 The overall shape of the fruit and seed of Phyllospadix iwatensis

蝦形草果實果皮與種子緊密貼合, 當剝去蝦形草果實果皮后, 種子露出, 整體呈灰色, 形狀近扁球狀,原本果實兩翅結構著生處僅余殘留痕跡(圖4c)。

2.5 蝦形草果實種子內部結構

通過組織原形態切片(圖5a—c)、番紅固綠染色(圖5d—f)和糖原PAS 染色(圖5g—i)對種子內部組織進行染色, 其中番紅染料能顯示植物木質化、木栓化和角質化組織, 固綠染料能夠對纖維素細胞組織進行染色; 糖原PAS 染色液常用來顯示糖原和其他多糖、中性黏液性物質和某些酸性物質, 以及色素、淀粉樣物質等, 可將蝦形草種子內部結構分為種皮、胚、胚乳三部分。圖5a、d、g 為沿兩翅根部連線從果實腹面至背面的橫向切面圖; b、e、h 為從短喙尖至翅根部方向的縱向切面圖; c、f、i 為經過種子中軸線兩翅中間面方向的冠向切片圖, 其中最大截面為縱切面, 截面積平均約12.5mm2。具體包括種皮、胚和胚乳等部分, 分述如下。

圖5 紅纖維蝦形草(Phyllospadix iwatensis)果實切片染色結構Fig. 5 The sliced and dyed structure of the Phyllospadix iwatensis fruit

2.5.1 種皮

蝦形草種子的種皮部分包被著種子的整個表面,厚度大致相同, 厚度平均約0.2mm, 腹面部分較厚。種皮部分自外而內, 可以分成角質透明層, 木質厚壁細胞層, 薄壁細胞層, 角質化細胞層。

2.5.2 胚

胚包括胚芽、胚軸、胚根和子葉等部分, 是蝦形草作為單子葉種子植物所具有的種子重要組成部分。蝦形草種子中胚為位于核心的染色結構, 具有細胞較小、細胞質濃厚、核大的特點, 其分裂能力較強。在糖原PAS 染色和番紅固綠染色下均呈較深色, 即紫色和深紫色, 位于種臍附近, 子葉沿平行與種皮的方向展開包被胚芽、胚軸與胚根, 胚芽頂部較尖, 與另一端的胚根部分之間由伸長的胚軸相連接。

2.5.3 胚乳

蝦形草種子的胚乳用于儲存營養物質, 主要包括碳水化合物、蛋白質、半纖維素和脂質等貯藏物質, 占據了種子內的大部分空間。胚乳在糖原PAS染色下呈粉色, 在番紅固綠染色下呈淡紫色。胚乳所占縱切面截面面積約1.5mm2, 估算胚乳占種子內全部物質的88%。

各部分具體結構如圖6 所示。

圖6 果實切片各部分結構圖Fig. 6 The structure of each part on the fruit slices

2.6 蝦形草種子萌發形態

在溫度15℃和鹽度15‰條件下培養30d 后, 蝦形草種子的真葉從兩翅之間種子尖端開口伸出(圖7a);44d 后, 真葉伸長, 葉鞘明顯(圖7b), 此時果皮仍未自然脫去, 從生長出真葉的方向向內可以看到種子(圖7c)。剝去果皮后, 露出萌發有真葉的種子外部形態(圖7d—f), 種子整體呈灰白色, 葉鞘部分較長(圖7d), 底部有臍狀結構(圖7e), 真葉從頂種子端破開種子長出(圖7f)。其他處理條件下的蝦形草種子均未萌發。

圖7 紅纖維蝦形草(Phyllospadix iwatensis)種子發芽發育Fig. 7 The sprout and development of the Phyllospadix iwatensis seeds

3 討論

本研究通過對紅纖維蝦形草繁育期的生長環境、植株形態、果實種子解剖研究以及DNA 分析,認為紅纖維蝦形草種子的特殊結構具有以下特點和意義。

3.1 果實種子外部形態的特點與意義

蝦形草通常分布于風浪較大的開闊海域, 低潮位時在較高位置的蝦形草會部分露出。據報道, 1977年蝦形草在我國的主要分布范圍是遼東半島南端、河北秦皇島和山東半島沿岸, 其中在山東半島沿岸分布最廣, 從北部的萊州灣、煙臺、威海到青島膠南沿岸均有發現(楊宗岱, 1979)。上述海域的岸線風浪較大, 而蝦形草繁育期植株的果序和葉鞘的保護使蝦形草果實得以安全發育(圖2b、c), 并且蝦形草果實獨特的翅狀結構和兩翅內側的長鬃毛(圖2d、e)很好地完成了果實的固著及隨固著物漂浮的基礎準備, 使得蝦形草果實能夠完成海洋沉水高等植物的獨特繁殖過程。關于蝦形草果實的外部形態, Kuo 等(1990)在有關黑纖維蝦形草(Phyllospadix japonica)的研究中將其描述為呈深褐色的菱形果實, 其特征是兩臂帶有堅硬的彎曲刷毛, 可以作為錨定系統,這樣的結構特征是普遍存在的; 該研究中未給出具體測量數據, 但通過研究圖片和比例尺可判斷果實直徑為2～3mm, 與本研究中測得的大致范圍一致。Stephens 等(2019)對蝦形草屬的海草獨特的硬底質生存環境, 即退潮時殘留在巖石低洼處的潮水形成的潮間帶水洼進行了研究, 描述了蝦形草根莖對于錨定在底質的作用, 但其研究尚未涉及果實種子外部形態的錨定效應。翅狀結構和內側鬃毛使得蝦形草在生活史初期即具有附著在漂浮物上傳播, 后續遇到較穩定環境后固定于硬質巖石基底的能力, 二者為可能存在的根部分泌物質(Stephens et al,2019)、莖部團簇纖維(馬瑞 等, 2019)等適應特征提供初始固定基礎。

同時, Stephens 等(2019)發現托利蝦形草(Phyllospadix torreyi)生長在加拿大不列顛哥倫比亞省、美國華盛頓以及美國加利福尼亞州的沉積物中。一般來說, 沙質生態型的蝦形草生長在以較粗和壓實的沉積物為特征的地點(固結砂, 有時帶有卵石、礫石或鵝卵石), 并且可能受到較強的水動力影響,產生對應的結構特點。本研究中的蝦形草果實外部形態同樣有利于更好地適應其生長環境。

3.2 果實種子內部結構的特點與意義

蝦形草種子的內部結構中, 胚乳占據空間較大(圖4), 且通過2.6 中種子萌發實驗可知蝦形草種子極易進入休眠期, 這兩點為長期的附著傳播過程提供了營養物質基礎。另外, 關于紅纖維蝦形草的植株組織解剖研究指出, 蝦形草須根外皮層內側機械組織形成區域, 此處有多層厚角細胞, 而表皮細胞的細胞壁同樣具有類似六面加厚的情形(曹政飛,2015); 在本研究中所進行的果實種子切片也發現了類似的情形(圖4), 果皮外部堅硬, 內部出現排列致密、細胞壁明顯加厚的組織細胞, 同樣為蝦形草適應大風浪等惡劣生存環境所進化而來的特征。同時,對比幾種陸地生長的高等植物種子內部結構(房麗寧 等, 1997; Castillo et al, 2020; Yang et al, 2020),發現紅纖維蝦形草果實、種子的內部結構更為復雜,僅果皮(圖5)就分化為不均勻增厚的單層外果皮、多層中果皮和單層內果皮(Bobrov et al, 2019), 這樣復雜的內部結構有利于蝦形草適應相較于陸地環境更加復雜多變的海岸帶潮間帶環境。另外, Belzunce等(2005)研究了地中海地區的海草優勢種大洋波喜蕩草(Posidonia oceanica)的果實種子結構后發現,富含碳水化合物的胚乳將能夠保證海草幼苗短期發育所需的充足營養供應。本研究的對象紅纖維蝦形草同為海草, 其種子中的胚乳占比較大, 可達約88%, 表明其幼苗期發育的營養儲備也較為充足,有利于應對復雜多變的海洋環境, 為尋找適宜環境延長耐受時間。但本研究未能對胚乳的成分物質做定量分析, 這可作為后續對蝦形草及其他海草種子深入研究的方向。

3.3 蝦形草種子作為潮間帶生態修復工具種的意義

基于以上特點, 蝦形草果實種子具有外形結構特殊、易于附著、內部結構抗逆性強的優勢, 可以作為潮間帶生態修復的有效工具種, 并且可以結合能夠提供附著基底的人工潮間帶水洼和人造礁石等進行修復工程使用(Park et al, 2014)。

同時, 相比于已經投入海草床修復建設的外形類似米粒、僅有一層較薄果皮和種皮的鰻草種子(潘金華,2015), 蝦形草果實有著果皮厚實、外皮結構復雜、抗逆性強的潛在優勢, 有望成為新的海草資源修復工具種。Iurmanov 等(2021)對比蝦形草屬和鰻草屬后指出,二者的果實為兩種不同的類型, 能夠適應不同環境。正是由于二者生存底質的差異, 蝦形草修復的區域更偏向于巖石岸線和靠近潮上帶部分, 而鰻草等海草更偏向泥沙質岸線和靠近潮下帶區域(Blanchette et al,1999; Shelton, 2010), 二者的結合使用將有利于互相補足海岸帶區域修復的整體性和協調性。

目前已經有將蝦形草種子用于修復工程的研究實例, Park 等(2014)開發了一種使用人工造礁恢復黑纖維蝦形草的播種方法, 在韓國東海岸種植了黑纖維蝦形草種子, 密集地埋在人工魚礁頂部的凹面上, 然后將人造礁安裝在裸露的巖石海岸上, 2 年內幼苗/枝條的密度和枝條的形態特征表現良好。但海草床修復生態工程應用方面需解決蝦形草種子休眠問題, 例如本研究后期室內培養的蝦形草種子萌發率較低, 推測應是因種子進入休眠期。Pan 等(2012)的研究表明, 對鰻草種子外部環境條件的控制有助于打破休眠, 提高萌發率, 同樣可以考慮應用于蝦形草種子的萌發。

4 結論

本研究通過對紅纖維蝦形草繁育期環境、植株、果實、種子的全方位描述, 結合果實種子解剖結果與DNA 分子比對定種, 主要得出以下結論: 蝦形草繁育果實種子及外部形態對于其生長環境適應有著較大貢獻, 主要體現在保護器官和翅等獨特結構的適應性; 蝦形草果實種子的內部結構對于海洋高等植物繁育有著重要意義, 保護組織和營養組織保證了種子在脫離植株后到合適環境發芽這一過程中的生命維持; 基于蝦形草果實種子的特殊結構, 將其作為潮間帶生態修復工具種，可與目前主要工具種鰻草種子本身較脆弱、要求泥沙底質等特點互補,可用于修復不同的底質環境。蝦形草的上述形態特征與內部結構具有重要的生態修復應用價值。