海洋酸化和低氧及其節律性變化對海蜇碟狀幼體的影響

吳鐘啟悅, 王雷, 陳立飛, 李秀保, 董志軍

1. 海南大學海洋學院, 海南 ?？?570228;

2. 海南大學, 南海海洋資源利用國家重點實驗室, 海南 ?？?570228;

3. 中國科學院煙臺海岸帶研究所, 牟平海岸帶環境綜合試驗站, 山東 煙臺 264003;

4. 江蘇省鹽城市射陽縣金洋水產原種場, 江蘇 鹽城 224351

化石燃料資源過度開發和利用等人類生產活動導致大氣中pCO2升高, 海洋對CO2的吸收使得海洋自身的碳酸鹽化學失衡, 造成海水酸度增加。自工業革命以來, 全球表層海水pH 已下降了0.1, 預計2100 年前表層海水pH 將下降0.3～0.4(Orr et al,2005)。20 世紀50 年代后, 河口和近岸海域的低氧問題也愈發嚴重。陸源營養鹽入海通量增加導致的富營養化是近岸海域低氧區擴大的重要原因(Breitburg et al, 2018)。缺氧現象通常發生在夏季,由于水體和沉積物中微生物的礦化分解作用, 導致海水底層缺氧, 并通常伴隨著局部pH 降低的酸化過程。目前, 在渤海、黃海、長江口、珠江口和南海部分海域觀測到海水酸化與低氧的耦合現象(韋欽勝 等, 2017; 宋金明 等, 2021)。同時, 海水pH值和溶解氧又呈現出明顯的晝夜變化特征, 白天光合作用強導致較高的溶解氧水平和pH, 而晚上呼吸作用的增強則導致較低的溶解氧水平和pH(Baumann et al, 2015, 2018; Gobler et al, 2016;Gedan et al, 2017)。

海洋酸化和低氧從多方面影響著不同營養級海洋生物, 是近岸海洋生態系統的重要環境威脅。酸化和低氧對海月水母(Aurelia aurita)螅狀幼體的研究顯示, 低溶解氧(dissolved oxygen, DO)可使螅狀幼體的無性出芽減少～50%, 酸化對無性生殖和有氧呼吸均無顯著影響(Treible et al, 2018)。脅迫因素的晝夜節律變化對生物體產生的效應并不完全一致,因波動的周期、幅度和生物體等的不同而異。研究顯示, DO 劇烈波動增加了美洲牡蠣(Crassostrea virginica)對病原體的感染率和致病性, 影響甚至會遺留至次年, 而pH 波動和雙因素波動聯合對感染都無顯著影響, DO 和pH 單獨波動及聯合波動都會刺激血細胞活性, 但這種活性刺激可能無法有效預防病原體感染, 劇烈波動利于寄生物感染附近種群,擴大感染區阻礙牡蠣恢復(Keppel et al, 2015)。同樣,三種雙殼類幼體暴露于酸化和低氧實驗顯示, 海灣扇貝(Argopecten irradians)幼體在恒定酸化或低氧下存活率降低、生長和發育延緩; 硬殼蛤(Mercenaria mercenaria)幼體在恒定酸化下存活率降低、在恒定低氧下發育延緩; 美洲牡蠣(Crassostrea virginica)幼體在恒定酸化下存活率降低、生長減緩, 且復合因素暴露相較單因素暴露表現出更大的負面影響; 該研究中晝夜波動的CO2和DO 未完全減輕雙殼類幼體受低氧和酸化的影響,無法為其存活、生長和變態發育提供充分緩和(Clark et al, 2016)。但也有研究表明, 晝夜波動間歇性應激能在一定程度上緩解負面效應, 未來持續性的海洋酸化和缺氧對厚殼貽貝(Mytilus coruscus)的危害比波動性酸化和缺氧更嚴重。但如果貽貝無法獲得外界能量的供應和補償, 其酸化和缺氧會影響貽貝種群的生存和發育(Shang et al, 2020)。有關月銀漢魚(Menidia menidia)研究顯示, 恒定低氧嚴重降低了胚胎存活率、幼魚存活率、種群半孵化耗時、孵化時大小和孵化后幼魚生長速率, 而恒定酸化對大多數性狀并無影響。然而, 實驗證實酸化和低氧的晝夜波動降低了這些恒定條件對月銀漢魚(Menidia menidia)所有響應性狀的負面影響, 而且緩解程度取決于波動的幅度, 表明脅迫因素的波動可能會為沿海生物提供周期性的生理庇護, 從而促進物種對氣候變化的適應性(Cross et al, 2019)。此外, 這些研究大多集中在鈣化生物上, 而非鈣化生物仍未得到充分研究(Davis et al, 2013)。需多因素實驗設計來研究同時發生的應激源(如海洋酸化和低氧)涉及的生物響應。

海蜇(Rhopilema esculentum)隸屬于刺胞動物門(Cnidaria)、缽水母綱(Scyphozoa)、根口水母目(Rhizostomeae)、根口水母科(Hizostomadae)、海蜇屬(Rhopilema), 在中國、日本、朝鮮半島沿海和俄羅斯遠東地區均有分布。海蜇為大型暖水性水母,主要棲息于近岸海域, 其食用價值及潛在的藥用價值使之成為我國重要的漁業資源之一(李云峰 等,2020)。自20 世紀80 年代以來, 為補充海蜇的種群資源, 遼寧、山東和浙江等多地進行了增殖放流、人工育苗和養殖, 但由于海蜇對環境適應能力較差,其資源日益匱乏的現狀并未得到顯著改善(王國善等, 2014)。海蜇的生活史具有水母體有性浮游世代和水螅體無性底棲世代交替出現的現象。成熟的海蜇水母體營浮游生活, 通過有性生殖產生受精卵,發育成為浮浪幼蟲, 繼而附著于附著基上變態為早期的螅狀幼體, 螅狀幼體可進行無性生殖, 因環境條件作用和生存狀況差異, 進行足囊生殖形成新的螅狀幼體或橫裂生殖產生碟狀幼體, 碟狀幼體再經變態發育為水母體, 水母體根據其發育狀況再細分為稚蜇和成蜇(丁耕蕪 等, 1981; 孫婷婷 等,2017)。其中橫裂生殖是海蜇實現螅狀幼體世代向水母體世代轉變的唯一途徑, 海蜇早期生活史幼體階段的種群數量直接決定海蜇成體的漁業資源產量, 海蜇浮浪幼蟲的生存附著、螅狀幼體的無性生殖、碟狀幼體的生長發育均是影響海蜇種群變化的關鍵階段(Lucas et al, 2012)。本文旨在對海洋酸化和海洋低氧這兩個海洋生態環境正面臨的重大變化可能對海蜇碟狀幼體的影響進行探討, 為闡明海蜇對海洋酸化和低氧的響應模式和調控機制奠定基礎, 以探究未來海洋中的酸化和低氧水平對海蜇種群發展的影響水平, 對于海蜇資源的預測和評估具有重要意義。

本研究設計兩個pH 水平(酸化pH 7.6; 正常pH 8.1)和兩個溶解氧(DO)水平(低氧 2mg·L–1; 常氧7mg·L–1), 考慮脅迫因素恒定或晝夜節律性變化,通過測定傘部直徑、收縮頻率、Ca2+-ATP 酶、Na+K+-ATP 酶、酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、過氧化氫酶(catalase, CAT)活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量等生理指標, 從生長和運動及酸堿平衡、免疫和抗氧化相關酶活力方面, 分析海蜇(R.esculentum)碟狀幼體在海洋酸化和低氧及其晝夜節律變化脅迫下的生理響應。本文初步探討了海洋酸化和低氧及其晝夜節律變化對海蜇碟狀幼體生理代謝和生長發育等過程的差異影響, 為進一步研究水母類群適應氣候變化及未來環境條件下生物多樣性和生態進程的變化趨勢提供理論依據, 為漁業發展和海洋環境監測提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

海蜇碟狀幼體采集自鹽城金洋水產原種場, 選擇由螅狀幼體釋放的1 日齡碟狀幼體, 當天運送至中國科學院煙臺海岸帶研究所牟平海岸帶環境綜合試驗站的水母養殖實驗室, 將海蜇碟狀幼體置于玻璃水缸(200L)中, 加入經砂濾處理的天然海水, 連通供氣裝置暫養3d, 暫養期間海水溫度18.0±0.5℃、鹽 度(32±0.5)‰ 、 pH 8.10±0.05 、 溶 氧 濃 度(7.0±0.3)mg·L–1。暫養期內每日投喂足量鹵蟲無節幼體(Artemia nauplius)兩次。選擇狀態良好、結構完整、大小一致(平均傘徑4mm)的碟狀幼體進行實驗。

1.2 實驗設計與海水化學

實驗采用正交設計, 兩個pH 水平(酸化pH 7.6;正常pH 8.1)和兩個溶解氧(DO)水平(低氧2mg·L–1;常氧7mg·L–1)恒定處理, 以及僅pH 波動酸化處理(pH: 8.0～7.2; DO: 7mg·L–1)、僅DO 波動低氧處理(pH:8.1; DO: 3～1mg·L–1)、pH 和DO 聯合波動的酸化和低氧復合處理(pH: 8.0～7.2; DO: 3～1mg·L–1), 共七種處理。暴露實驗為期7d, 暴露期間7:00—19:00 為波動處理的白天條件, 19:00—7:00 為波動處理的夜間條件。每種處理設置3 個重復, 每個重復包含100只海蜇碟狀幼體, 飼養于21 個20L U 型水母缸。使用氣體流量控制系統調節通入空氣-CO2-N2混合氣體的進氣量與曝氣周期, 以達到目標pH 和DO 水平實現酸化或/和低氧處理(劉輝 等, 2018)。

暴露實驗期間海水溫度18 ℃, 每日投餌鹵蟲無節幼體兩次, 每兩天更換約2/3 經相應預處理的新鮮海水并吸底去污, 所用新鮮海水已分別按照相應處理組的海水化學要求進行預處理。每天使用YSI水質監測儀測定溫度、鹽度和溶解氧, 使用NBS 標準溶液校準的pH 電極監測實驗水體pH。每兩天于白天時段和夜間時段, 在晝夜模式切換前1h 內, 從實驗水體中采集水樣, 采用滴定法測定水體總堿度(total alkalinity, TA)。根據TA 值和測量參數(溫度、鹽度和pH), 利用CO2 SYS 軟件計算得海水碳酸鹽化學的溶解無機碳(dissolved inorganic carbon,DIC)、方解石飽和度、文石飽和度。

1.3 傘部直徑

暴露實驗開始前和結束時, 從每種處理的水母缸內隨機取15 只實驗個體, 放置在含有相應處理海水的培養皿中, 使用體視顯微鏡連接電腦拍攝軟件OPT Pro,拍照測量碟狀幼體的傘部直徑(Heins et al, 2018)。

1.4 收縮頻率

暴露實驗結束后, 從每種處理的水母缸內隨機取15 只實驗個體, 每只碟狀幼體單獨放置在含有相應處理海水的500mL 燒杯內, 待穩定3min 后, 記錄1min 內碟狀幼體的收縮次數, 作為收縮頻率(pulsation rates)(Algueró-Mu?iz et al, 2016)。

1.5 酶活力

暴露實驗結束后, 用相應處理的無菌海水浸泡清洗碟狀幼體, 吸取其表面水分后收集在無菌離心管中, 液氮速凍并轉移至–80℃冰箱保存待用。將待檢測的組織樣品在冰上解凍, 稱取約0.10g 碟狀幼體組織, 按照質量(g):體積(mL)=1:9 的比例加入0.9%生理鹽水, 低溫勻漿后離心10min (2500r·min–1,4 ℃), 收集上清液分裝待測。組織樣的Ca2+-ATP 酶、Na+K+-ATP 酶、酸性磷酸酶(acid phosphatese, ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、過氧化氫酶(catalse, CAT)活力和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量以及組織總蛋白濃度均采用南京建成生物工程研究所試劑盒并按照說明書進行測定。

1.6 數據分析

使用SPSS 22.0 軟件分析實驗數據, 分別對數據進行了方差齊性檢驗以及正態分布檢驗。使用two-way ANOVA 來確定pH 和DO 之間是否存在相互作用影響。使用student-t 檢驗分析每個實驗組和對照組之間, 以及每個對應波動處理組和恒定處理組之間差異性是否顯著, 顯著性水平設定為P＜0.05。實驗數據以平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 海水化學

本實驗通過向實驗海水充入CO2氣體模擬海洋酸化環境, 充入N2氣體模擬海洋低氧環境。根據實驗測得的數據, 溫度、鹽度、pH、DO 均保持在實驗目的環境條件范圍內, 根據計算得出其他碳酸鹽化學參數 (表1)。

表1 本實驗中相關海水化學參數Tab. 1 Chemical parameters of seawater in this experiment (mean±SD)

2.2 傘部直徑

與對照組相比, 所有波動處理組的碟狀幼體傘部直徑均顯著降低(P＜0.05), 恒定和波動處理組中, 均沒有觀察到pH 和DO 之間的交互作用(P>0.05; 表2、3)。碟狀幼體的傘部直徑在酸化、低氧、酸化與低氧聯合的恒定和波動處理組之間均無顯著差異(P>0.05, 圖1)。

圖1 海蜇碟狀幼體暴露于恒定/波動的酸化和/或低氧處理后的傘部直徑*表示和對照組有顯著差異(P＜0.05)Fig. 1 Bell diameter of R. esculentum ephyrae after constant/fluctuating acidification and/or hypoxia exposure.The * error bar indicates significant difference (P＜0.05) as compared to control group

表2 雙因素方差分析結果: 恒定酸化和低氧脅迫對海蜇碟狀幼體的影響Tab. 2 Two-way ANOVA summary: Effects of constant acidification and hypoxia on the R. esculentum ephyrae

續表

表3 雙因素方差分析結果: 波動酸化和低氧脅迫對海蜇碟狀幼體的影響Tab. 3 Two-way ANOVA summary: Effects of fluctuating acidification and hypoxia on the R. esculentum ephyrae

2.3 收縮頻率

與對照組相比, 恒定和波動的酸化與低氧聯合處理組的海蜇碟狀幼體收縮頻率顯著降低(P＜0.05)。恒定和波動處理組中, 均沒有觀察到pH 和DO 之間的交互作用(P>0.05; 表2、3)。碟狀幼體的收縮頻率在酸化、低氧、酸化與低氧聯合的恒定和波動處理組之間均無顯著差異(P>0.05; 圖2)。

圖2 海蜇碟狀幼體暴露于恒定/波動的酸化和/或低氧處理后的收縮頻率*表示和對照組有顯著差異(P＜0.05)Fig. 2 Pulsation rates of R. esculentum ephyrae after constant/fluctuating acidification and/or hypoxia exposure.The * error bar indicates significant difference (P＜0.05) as compared to control group

2.4 酸堿平衡、免疫和抗氧化相關酶活力

2.4.1 Ca2+-ATP 酶和Na+K+-ATP 酶活力

與對照組相比, 恒定的酸化、低氧、酸化與低氧聯合處理的海蜇碟狀幼體Ca2+-ATP 酶活力均顯著升高(P＜0.05), 但波動的酸化、低氧處理的海蜇碟狀幼體Ca2+-ATP 酶活力則顯著降低(P＜0.05)。在恒定和波動處理組中, pH 和DO 之間都存在顯著的交互作用(P＜0.001; 表2、3)。碟狀幼體的Ca2+-ATP 酶活力在暴露于酸化、低氧、酸化與低氧聯合的恒定處理后, 均顯著高于對應的波動處理組(P＜0.05, 圖3a)。

圖3 海蜇碟狀幼體暴露于恒定/波動的酸化和/或低氧處理后的酶活力*表示和對照組有顯著差異(P＜0.05); 誤差棒上方不同英文小寫字母表示恒定和波動的實驗組之間存在顯著差異(P＜0.05)Fig. 3 Enzyme activities of R. esculentum ephyrae after constant/fluctuating acidification and/or hypoxia exposure. The *above error bar indicates the significant difference (P＜0.05) as compared to control group; the different lowercase letters indicate significant differences (P＜0.05) between constant and fluctuating treatment groups

與對照組相比, 所有處理組的海蜇碟狀幼體Na+K+-ATP 酶活力均顯著降低(P＜0.05)。在恒定和波動處理組中, pH 和DO 之間都存在顯著的交互作用(P＜0.001; 表2、3)。相較于恒定處理, 碟狀幼體在暴露于波動的低氧、酸化與低氧聯合處理后Na+K+-ATP 酶活力顯著降低(P＜0.05; 圖3b)。

2.4.2 酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)活力

與對照組相比, 恒定的酸化、低氧、酸化與低氧聯合處理的海蜇碟狀幼體ACP 活力均顯著升高(P＜0.05), 但波動的酸化、低氧、酸化與低氧聯合處理組的ACP 活力則顯著降低(P＜0.05)。在恒定和波動處理組中, 恒定處理組的pH 和DO 之間沒有交互作用(P>0.05; 表2、3), 但波動處理組的pH 和DO之間觀察到交互作用(P＜0.001; 表2、3)。碟狀幼體的ACP 活力在暴露于酸化、低氧、酸化與低氧聯合的恒定處理后, 均顯著高于對應的波動處理組(P＜0.05, 圖3c)。

與對照組相比, 恒定的酸化、低氧、酸化與低氧聯合處理的海蜇碟狀幼體AKP 活力均顯著升高(P＜0.05), 但波動的酸化、低氧處理組的AKP 活力則顯著降低(P＜0.05)。在恒定和波動處理組中, pH 和DO 之間都存在交互作用(P＜0.001; 表2、3)。碟狀幼體的AKP 活力在暴露于酸化、低氧、酸化與低氧聯合的恒定處理后, 均顯著高于對應的波動處理組(P＜0.05; 圖3d)。

2.4.3 過氧化氫酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量

恒定酸化組與對照組相比沒有顯著差異, 其余處理組的海蜇碟狀幼體CAT 活力相較于對照組均顯著降低(P＜0.05)。在恒定和波動處理組中, 恒定處理組的pH 和DO 之間沒有交互作用(P>0.05; 表2、3),但波動處理組的pH 和DO 之間觀察到交互作用(P＜0.05; 表2、3)。暴露于波動的酸化、低氧、酸化與低氧聯合處理的碟狀幼體, 相比于對應的恒定處理組, 其CAT 活力顯著降低(P＜0.05, 圖3e)。

所有處理組的海蜇碟狀幼體MDA 含量相較于對照組均顯著升高 (P＜0.05)。在恒定和波動處理組中, pH 和DO 之間都存在交互作用 (P＜0.05; 表2、3)。碟狀幼體的MDA 含量在酸化、低氧、酸化與低氧聯合的恒定和波動處理組之間均沒有顯著差異(P>0.05, 圖3f)。

3 討論

3.1 酸化和低氧晝夜波動抑制海蜇碟狀幼體生長

本研究表明, 不同晝夜變化的海水酸化和低氧對海蜇碟狀幼體生長的影響不同, 恒定處理暴露7d后, 未出現顯著差異, 而波動處理暴露7d 后, 海水酸化、低氧、酸化與低氧聯合處理對海蜇碟狀幼體的生長均顯示顯著抑制作用。有研究發現, 部分水母物種無論是底棲階段還是浮游階段, 都同時對環境有很大的適應性(Algueró-Mu?iz et al, 2016)。海月水母(Aurelia aurita)的酸化暴露實驗發現, pH 7.62～7.72 對其無致命影響(Treible et al, 2018)。大多數水母物種生活在溶解氧含量大于2mg·L–1的水體環境中, 但部分物種如大西洋金黃水母(Chrysaora quinquecirrha)和淡海櫛水母(Mnemiopsis leidyi)等對低氧環境表現出耐受性(Purcell et al, 2001)。與其他浮游分類群相比, 碟狀幼體階段通常是水母生活史中最脆弱的階段之一(Algueró-Mu?iz et al, 2016)。碟狀幼體在晝夜波動的酸化和低氧處理后表現出生長抑制, 可能是波動條件極值對碟狀幼體攝食等方面產生的負面效應, 例如酸化等暴露下, 水母毒素的生物活性受影響, 夜光游水母(Pelagia noctiluca)的刺細胞受損并影響捕食行為(Morabito et al, 2013)。研究發現,餌料豐度是影響海蜇幼體生長發育及生存的重要因子, 碟狀幼體的器官尚未發育成熟, 浮游及捕食能力較弱, 主要借助水流實現浮游和攝食, 營養對晚期碟狀幼體的生長有顯著的影響(劉頂海, 2011)。

3.2 酸化和低氧耦合降低海蜇碟狀幼體收縮頻率

海蜇碟狀幼體的運動主要依靠緣葉的舒張和收縮, 通過收縮運動捕獲獵物和躲避敵害等(Kikkawa et al, 2010)。本研究中, 對照組海蜇碟狀幼體的收縮頻率最高, 酸化或低氧的單獨暴露對收縮頻率沒造成顯著影響, 而酸化和低氧聯合暴露后收縮頻率顯著降低, 在恒定和波動對應處理中無顯著差異。有研究表明, 海蜇碟狀幼體在pH 為7.15～8.15 的海水中能夠正常生活, 而在pH 為7 或9 的水體中其收縮頻率僅略低于正常值(宋晶 等, 2009)。Kikkawa 等(2010)研究顯示, 海月水母(Aureliasp.)碟狀幼體在暴露于5000μatmpCO2的酸化條件時收縮頻率才出現降低趨勢。Algueró-Mu?iz 等(2016)研究表明, 海月水母(Aurelia aurita)碟狀幼體在溫度、pCO2和溶解氧的三因素脅迫下, 大多數處理組的收縮頻率無顯著差異, 而高溫時的pCO2效應隨DO 不同而不同,低DO 時呈顯著正效應而高DO 時呈負效應。Winans等(2010)報道海月水母(Aurelia labiata)碟狀幼體和螅狀幼體在pH 7.5 和7.3 下處理后, 其存活及無性繁殖均無顯著差異, 但發現低pH 處理導致平衡石減小, 每個平衡囊中的平衡石數量不變, 對平衡石的影響可能使碟狀幼體表現出運動行為變化(Winans et al, 2010)。

3.3 酸堿平衡、免疫和抗氧化相關酶活力

3.3.1 Ca2+-ATP 酶和Na+K+-ATP 酶活力

當pH、DO 等環境因子發生變化時, 海洋生物需調整ATP 敏感的離子通道, 改變離子代謝速率等,從而適應環境因子的變化(肖武漢, 2014; 莊淑芳等, 2014)。Ca2+-ATP 酶和Na+K+-ATP 酶是分布于細胞膜表面的離子轉運蛋白, 是環境脅迫時的敏感生物標志物(Marques et al, 2020)。Ca2+-ATP 酶對Ca2+的跨膜轉運和維持酸堿平衡至關重要(Al-Horani et al, 2003)。Na+K+-ATP 酶能消耗ATP 驅動細胞膜兩側Na+、K+離子交換運輸, 對于維持細胞內外滲透壓平衡和離子調節等方面有重要調節作用(韓春艷 等,2016)。本研究顯示, 恒定的酸化、低氧、酸化與低氧聯合處理導致海蜇碟狀幼體Ca2+-ATP 酶活力均顯著升高, 但是波動的酸化、低氧處理的海蜇碟狀幼體Ca2+-ATP 酶活力則都顯著降低, 恒定處理中碟狀幼體的Ca2+-ATP 酶活力均顯著高于對應的波動處理組。研究表明, 日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)無節幼體在酸化暴露后Ca2+-ATP 酶活力顯著增強, 可能是環境脅迫下生物體進行離子調節作用, 造成能耗增加及對生殖、發育的負面影響(李飛 等, 2018)。海月水母(Aurelia labiata)的酸化和重金屬離子暴露實驗顯示, 海洋酸化和 Cu2+均對Ca2+-ATP 酶活性具有較強的抑制效應, 且酸化條件會導致碟狀幼體的鈣質結構如平衡石受損(Winans et al, 2010)。不同程度酸化低氧脅迫大黃魚(Larimichthys crocea)幼魚的研究顯示, 慢性低氧脅迫下其鰓Ca2+-ATP 酶活力與對照組無顯著性差異,急性酸化脅迫下其鰓Ca2+-ATP 酶活力呈先增加后減少趨勢, 慢性酸化、急性低氧酸化協同脅迫下,Ca2+-ATP 酶活力隨時間延長趨向恢復至初始水平,發現低氧與酸化之間存在拮抗性(曾姣, 2021)。另外,酸化和低氧對華美盤管蟲(Hydroides elegans)變態期幼蟲蛋白質組的研究表明, 在一定程度上, 機體對低氧的生理響應可能削弱由酸化作用引起的不利影響, 酸化和低氧對生物體顯示出拮抗作用(Wu, 2002;Fabry et al, 2008)。本研究中, 酸化、低氧、酸化與低氧聯合處理的恒定模式和波動模式均導致海蜇碟狀幼體Na+K+-ATP 酶活力顯著降低, 相較于恒定處理, 碟狀幼體在暴露于波動的低氧、酸化與低氧聯合處理后 Na+K+-ATP 酶活力被顯著抑制。Na+K+-ATP 酶活力降低表明生物體在脅迫環境中可能呈現代謝率和代謝需求降低, 與本實驗結果類似,大黃魚(Larimichthys crocea)幼魚在急性低氧脅迫下其鰓中 Na+K+-ATP 酶活力顯著低于對照組(曾姣,2021)。研究表明海水pH 降低導致的組織損傷或引起Na+K+-ATP 酶活力變化, 海水酸化脅迫導致長牡蠣(Crassostrea gigas)鰓中的Na+K+-ATP 酶活力顯著下降(王曉芹, 2018)。

3.3.2 酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)活力

磷酸酶通過水解磷酸單酯去除底物分子上的磷酸基團, 是一類可催化相應底物去磷酸化的酶, 又稱磷酸單酯水解酶, 根據其催化作用的最適pH 分為酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)。磷酸酶廣泛存在于動物各組織中, 在去磷酸化反應、生理代謝、免疫防御和環境適應等方面起重要作用, 外源物質通過機體第一道免疫防線后, ACP、AKP 和溶菌酶(Lysozyme, LZM)等酶類物質可發揮降解作用,當免疫水平改變時磷酸酶會產生相應變化(霍達,2020)。ACP 主要位于溶酶體和內膜系統, 是溶酶體的標志酶(Pipe, 1990), 在酸性環境下催化磷酸單酯水解成酚和磷酸, 破壞表面含磷酸酯的異物, 起到預防感染的作用(徐彥, 2012); AKP 為含鋅(Zn2+)和鎂(Mg2+)的金屬酶, 存在于絕大多數動物細胞的質膜上, 能夠促進鈣的吸收, 參與碳酸鈣的分泌和積聚, 堿性環境下催化磷酸單脂水解成乙醇和磷酸鹽,并且參與磷酸基團的轉移, 在動物代謝過程中起重要的調控和解毒作用(徐彥, 2012)。本研究結果表明,恒定的酸化、低氧、酸化與低氧聯合處理導致海蜇碟狀幼體ACP 和AKP 活力均顯著升高, 但波動的酸化、低氧、酸化與低氧聯合處理導致ACP 活力顯著降低, 波動的酸化、低氧處理導致AKP 活力顯著降低。恒定的酸化、低氧、酸化與低氧聯合處理后碟狀幼體的ACP 和AKP 活力均顯著高于對應的波動處理組。有研究顯示, ACP 或AKP 活力升高表明環境脅迫在某種程度上誘導了機體內免疫相關防御機制,反之酶活力降低可能意味著免疫損傷, 刺參(Apostichopus japonicus)在暴露于低氧脅迫下也表現出ACP 活力顯著升高(霍達, 2020)。環境適宜時ACP和AKP 活力較低, 生物體內ACP 和AKP 活力的增強表明機體免疫功能被激活, 推測碟狀幼體通過采取主動調節進而維持體內免疫及酸堿平衡, 晝夜波動脅迫過度使生物免疫受損時難以調節維持穩態則表現出一種被動病理特征(朱曉聞, 2012)。同樣, 溫度、鹽度、pH 對馬氏珠母貝(Pinctada martensii)稚貝生理學特征的聯合效應研究顯示, pH 的一次效應和二次效應對馬氏珠母貝稚貝體內ACP 和AKP 活力均有極顯著影響, 當存在環境因子脅迫時, 免疫功能表現出一段增強期(文春根 等, 2009; 朱曉聞, 2012)。3.3.3 過氧化氫酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量

當環境因子發生不利于生物體的變化時, 生物體內活性氧自由基含量升高, 活性氧作為高活性分子, 會氧化細胞成分而造成細胞膜損傷等(Valko et al, 2007)。為了保護機體免受氧自由基造成的損傷,生物體采取一系列自適應策略, 通過抗氧化系統來降低活性氧水平?？寡趸甘堑挚够钚匝醯牡谝坏婪谰€, 例如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等(霍達, 2020)。CAT 是抗氧化系統中清除多余活性氧自由基的主要抗氧化酶之一(Magnadóttir,2006)。本研究結果顯示, 除恒定酸化組與對照組無顯著差異外, 其余處理組的海蜇碟狀幼體CAT 活力相較于對照組均顯著降低, 且暴露于波動的酸化、低氧、酸化與低氧聯合處理的碟狀幼體, 相比于對應的恒定處理組, 其CAT 活力顯著降低。同樣, 海月水母(Aurelia coerulea)碟狀幼體和?？?Exaiptasia pallida)暴露于酸化條件時, 其CAT 活力也受到顯著抑制(Siddiqui et al, 2015; 王雷, 2020)。另外, 在低氧、高溫、高溫低氧三種脅迫下, 刺參(Apostichopus japonicus)的CAT 活力均顯著降低(霍達, 2020)。研究發現, 當生物處于環境脅迫下, 海洋生物體內的抗氧化酶會發生一定的變化, 僅輕度環境脅迫時,抗氧化酶體系會顯著升高, 而當處于嚴重的環境脅迫下時, 生物體的有關酶活力會顯著下降(張培玉等, 2007; 姜娓娓 等, 2017)。丙二醛(MDA)是脂質過氧化作用的最終產物, 可以作為氧化應激損傷的主要生物標志物, 反映生物體內氧自由基引起的應激壓力(del Rio et al, 2005)。本研究中, 酸化、低氧、酸化與低氧聯合的恒定和波動處理組的海蜇碟狀幼體MDA 含量相較于對照組均顯著升高。實驗表明,環境壓力造成機體氧化應激而引起脂質過氧化, 進而對生物體的組織和細胞造成氧化損傷, 低氧脅迫和高溫低氧脅迫下刺參(Apostichopus japonicus)中MDA 含量極顯著升高與本實驗海蜇碟狀幼體結果相似(霍達, 2020)。Shi 等(2005)表明MDA 積累程度與氧化應激水平呈正相關。環境脅迫誘導產生了大量活性氧自由基且無法被有效清除, 生物體遭受氧化損傷, 與此同時抗氧化酶活力受抑制, 脂質過氧化程度加劇, 因而作為脂質過氧化作用代謝產物的MDA 含量就會增加(Martínez-álvarez et al, 2005)。

綜上所述, 海洋酸化和低氧在不同程度上影響海蜇碟狀幼體的生理代謝和生長發育, 且酸化和低氧之間表現出部分拮抗作用, 如對 Ca2+-ATP酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力的影響。整體上,晝夜波動的暴露模式對海蜇碟狀幼體的損傷程度大于恒定的暴露模式, 表明碟狀幼體為海蜇生活史中極為脆弱的階段, 關于海蜇其他生活史階段對酸化和低氧脅迫不同暴露模式的響應還有待研究, 進一步揭示缽水母類群適應氣候變化和抵抗逆境的關鍵機制。