長棘海星(Acanthaster planci)幼體特異性PCR 檢測技術與應用*

張穎, 楊櫟潼, 劉冰,3, 鄭凡昱, 羅鵬, 陳償,4

1. 中國科學院南海海洋研究所, 中國科學院熱帶海洋生物資源與重點實驗室, 廣東省應用海洋生物學重點實驗室, 廣東 廣州510301;

2. 廈門大學馬來西亞分校, 中國東盟海洋技術學院, 馬來西亞 雪蘭莪州 雪邦 43900;

3. 中國科學院大學, 北京 100049;

4. 中國科學院南海海洋研究所, 海南西沙海洋環境國家野外科學觀測研究站, 廣東 廣州 510301

近幾十年來, 世界各地的珊瑚礁正在迅速減少(Hughes et al, 2017)。雖然氣候引起的周期性白化是全球珊瑚死亡的主要原因(Hughes et al, 2018), 但以珊瑚為食的長棘海星(Acanthaster planci, 英文名為crown-of-thorns seastar, 簡稱CoTS)數量的激增加劇了印度—太平洋地區的珊瑚礁退化(Baird et al, 2013;Nakamura et al, 2014; Saponari et al, 2015)。例如,1985 年至 2012 年期間, 澳大利亞大堡礁(Great Barrier Reef, GBR)的珊瑚覆蓋面積減少了約50%,其中 42%歸因于長棘海星的破壞(De'ath et al,2012)。目前, 大堡礁正在經歷自20 世紀60 年代以來有記錄的第四次大規模長棘海星暴發(Pratchett et al, 2014, 2017)。與此同時, 印度—太平洋地區的許多其他珊瑚礁也受到長棘海星的嚴重影響, 包括法屬波利尼西亞(Kayal et al, 2012)、印度尼西亞(Baird et al, 2013)和日本沖繩(Nakamura et al, 2014)的珊瑚礁。我國的珊瑚礁也未逃脫這一命運。據報道, 自2004 年以來, 西沙群島海域珊瑚礁已經經歷了兩次長棘海星大規模暴發事件, 其中在第一次暴發期間,長棘海星的密度每公頃高達20000 只, 珊瑚的覆蓋率從最初的60%多退化到不足10%, 而且經歷長棘海星暴發的珊瑚礁至少需要10～15 年的時間才能逐漸恢復(吳鐘解 等, 2011; 李元超 等, 2019)。

盡管在過去30 年里進行了大量的研究工作, 但制定有效的管理戰略以控制長棘海星暴發仍然受到很多不確定性的限制(Pratchett et al, 2017)。其中一部分原因來自對野外原位長棘海星幼蟲的了解有限。海洋浮游動物的分類鑒定通常是通過光學顯微鏡完成的, 要成功進行這項工作, 往往需要豐富的技能和大量的培訓。即便如此, 僅根據形態來區分長棘海星幼蟲與其他海星及海參的幼蟲幾乎是不可能的(Uthicke et al, 2015); 而且由于食物可獲得性的不同, 導致長棘海星幼蟲發育和形態上的表型可塑性, 使視覺識別更復雜且難度更高(Wolfe et al,2015)。因此, 研發一種新的識別手段尤為重要, 而遺傳鑒定是一種高效且有用的工具。

線粒體細胞色素氧化酶亞基I(mtCOI, mitochondrial cytochrome oxidase subunit I)基因是一種線粒體基因, 因其具有高度保守以及高拷貝數的特性, 常被用作許多類群的DNA 條形碼(Hebert et al, 2003; 位正鵬 等, 2009), 包括棘皮動物(Ward et al, 2008)和浮游動物(Bucklin et al, 2016)。而且, 相比核DNA,線粒體基因具有結構簡單、進化速率高和母系遺傳等特點(Gérard et al, 2008)。此外,mtCOI序列信息在遺傳數據庫中的可獲得性, 使物種特定的遺傳序列得以確定。因此本研究以長棘海星ApmtCOI基因和線粒體基因為靶點, 設計篩選引物, 以建立一種針對我國南海海域長棘海星特異性的PCR 檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

成體海星的采集: 藍指海星(Linckia laevigata)、面 包 海 星(Culcita novaeguineae) 、 粒 皮 海 星(Choriaster granulatus)和呂宋棘海星(Echinaster luzonicus)均 采 自 西 沙 七 連 嶼 趙 述 島(16°58.117′N,112°14.848′E)(圖1)。

圖1 各種海星樣品D5: 面包海星, L5: 藍指海星, X5: 粒皮海星, H5: 呂宋棘海星Fig. 1 Various starfish samples. D5: Culcita novaeguineae;L5: Linckia laevigata; X5: Choriaster granulatus; H5:Echinaster luzonicus

長棘海星幼體的采集: 2021 年9 月初將長棘海星成體采集上岸, 培養在循環水的水族缸中, 使用1-甲基腺嘌呤進行體內注射催產(Tian et al, 2017),取20 只原腸胚期幼蟲裝入2mL 凍存管中, 速凍于液氮用于后續基因組DNA 提取。

浮游生物樣品的采集: 基于長棘海星偏食石珊瑚的特性, 我們在西沙群島七連嶼選取6 個具有不同活珊瑚覆蓋率的點作為樣品采集站位(表1)。2021年 10 月 21 日, 使用錐形淺水Ⅱ型浮游生物網(0.5mm 孔徑)從水下10m 至海面進行垂直拖網采樣,每個站位拖網水體積總共為5m3, 富集為500mL,收集于白色塑料瓶中。將水樣立即帶回海南西沙海洋環境國家野外科學觀測研究站實驗室, 0.45μm 濾膜真空抽濾后裝入2mL 凍存管, 速凍于液氮。

表1 樣品采集的站位Tab. 1 Sampling stations

1.2 基因組DNA 的提取

參照TIANamp Marine Animals DNA Kit 試劑盒(天根, 北京), 分別提取成體海星、長棘海星幼體和浮游生物樣品中的基因組DNA。所有樣品均使用NanoDrop-2000 分光光度計檢測 DNA 的濃度和純度。然后凍存于–20 ℃, 備用。

1.3 引物來源及海星成體目的基因PCR 擴增

基于完整的長棘海星線粒體 DNA(16234bp,GenBank 登錄號為AB231475.1), 通過NCBI 網站中的Primer-BLAST 根據引物設計原則(Ye et al, 2012)設計了特異性引物對AcanP-TF/AcanP-TR, 其他引物則來自參考文獻(表2)。各引物由生工生物工程股份有限公司合成。

表2 PCR 引物Tab. 2 PCR primers

目的基因PCR 擴增的反應總體積為25μL: 引物 0.6μL, 2×Phanta Max Master Mix(諾唯贊, 南京)12.5μL, DNA 模板(終濃度為1～10ng·μL–1)1μL,ddH2O 補足至25μL。擴增反應條件: 95 ℃ 3min;95 ℃ 15s, 60 ℃ /57 ℃ 15s, 72 ℃ 30s/1min, 34個循環;72 ℃ 10min 。各引物的退火溫度和延伸時間見表3,以ddH2O 作為陰性對照, 長棘海星幼體基因組DNA作為陽性對照。

1.4 長棘海星幼體特異性引物的最佳退火溫度

根據1.3 的實驗結果, 選取引物2aooniF/2aooniR進一步研究。根據該引物的Tm 值, 將退火溫度分別設置為56.5、57.5、58.5、59.5、60.5 和61.5 ℃, 對長棘海星幼蟲樣品進行梯度PCR 擴增。反應體系同1.3, 其他擴增條件見表3, 以ddH2O 作為陰性對照。

表3 PCR 反應條件Tab. 3 PCR reaction conditions

1.5 長棘海星幼體特異性引物的靈敏度檢測

將長棘海星幼體基因組 DNA 的濃度4.17ng·μL–1按10 倍的梯度稀釋至4.17×10–8ng·μL–1,并根據1.4 的實驗結果, 選取引物2aooniF/2aooniR在58.5℃進行該引物靈敏度的檢測, 反應體系和其余擴增條件同1.4。

1.6 野外浮游生物樣品中長棘海星幼體的檢測

使用引物2aooniF/2aooniR, 在退火溫度為58.5℃時對浮游生物樣品基因組DNA 進行長棘海星幼體目的片段的擴增。反應體系和其余擴增條件同1.4。

1.7 PCR 反應產物的檢測

使用1.2%的瓊脂糖凝膠對擴增產物進行電泳(135V, 28min), 260nm 凝膠成像儀下觀察拍照, 確認目的條帶。利用通用型DNA 純化回收試劑盒(天根,北京)對目的片段進行回收純化, 瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產物, 將純化產物送往公司進行測序(天一輝遠生物科技有限公司, 廣州)。利用 NCBI 中的BLAST 檢索, 將測序成功的序列與GenBank 中已記錄長棘海星線粒體基因序列進行相似性比對, 相似性高且E 值為0 的序列即為比對成功的序列, 比對成功的樣品即為陽性樣品。

2 結果

2.1 長棘海星特異性引物

利用4 對引物對長棘海星幼體和其他成體海星的基因組進行擴增。結果發現, 4 對引物均只能擴增出長棘海星幼體基因組目的片段, 無法擴出其他海星的基因組DNA, 且擴增的長棘海星目的條帶清晰,無雜帶或非特異性擴增產物(圖2)。表明這4 對引物都可以用于鑒定長棘海星幼體。

圖2 不同引物的特異性檢測M: 2000bp marker; 1—6 分別為COST-F-1321/COST-R-1446 引物擴增下的樣品D5、H5、X5、L5、陰性、陽性; 7—12分別為2aooniF/2aooniR 引物擴增下的樣品D5、H5、X5、L5、陰性、陽性; 13—18 分別為AcanP-TF/TR 引物擴增下的樣品D5、H5、X5、L5、陰性、陽性; 19—24 分別為COTS-F-69/COTS-R-987 引物擴增下的樣品D5、H5、X5、L5、陰性、陽性Fig. 2 Specificity screening of different primers. M: 2000bp marker; 1-6: D5, H5, X5, L5, negative, positive control samples were amplified by COST-F-1321/COST-R-1446 primer; 7-12: D5, H5, X5, L5, negative, positive control samples were amplified by 2aooniF/2aooniR primer; 13-18: D5, H5, X5, L5, negative, positive control samples were amplified by AcanP-TF/TR primer; 19-24: D5, H5, X5, L5, negative, positive control samples were amplified by COTS-F-69/COTS-R-987 primer

2.2 長棘海星幼體特異性檢測引物的最佳退火溫度

鑒于長棘海星引物特異性檢測結果, 我們挑選2aooniF/2aooniR 引物進行其最佳退火溫度的篩選。結果顯示, 改變2aooniF/2aooniR 引物的退火溫度,得到的目的條帶清晰且均無非特異性擴增(圖3)。表明退火溫度在56.5～61.5℃之間時, 2aooniF/2aooniR具有較佳的擴增效果。

圖3 2aooniF/2aooniR 引物在不同退火溫度下對長棘海星幼體的擴增M: 2000bp marker; 1—6 分別是退火溫度為56.5、57.5、58.5、59.5、60.5、61.5℃下對長棘海星幼體的擴增; 7 為陰性對照Fig. 3 Amplification of 2aooniF/2aooniR primer at different annealing temperatures on CoTS larvae. M:2000bp marker; 1-6: the different annealing temperatures which were 56.5, 57.5, 58.5, 59.5, 60.5 and 61.5 ℃,respectively; 7: negative control sample

2.3 長棘海星幼體特異性引物的靈敏度檢測

基于2.2 的結果, 選取退火溫度為58.5℃進行2aooniF/2aooniR 引物的靈敏度檢測。結果發現, 當DNA 濃度為4.17ng·μL–1時, 條帶最亮。隨著DNA濃度的降低, 其擴增的條帶亮度也逐漸減弱, 當濃度為4.17×10–4ng·μL–1時, 瓊脂糖凝膠電泳完全無法檢測到目的條帶, 而濃度為4.17×10–3ng·μL–1時可以檢測到目的片段(圖4)。表明2aooniF/2aooniR 引物對長棘海星幼體 DNA 檢測的濃度最低限為4.17pg·μL–1, 即皮克(pg)級別。

圖4 2aooniF/2aooniR 引物在退火溫度為58.5℃下, 對不同濃度長棘海星幼體的擴增M: 2000bp marker; 1—9 濃度分別為4.17、4.17×10–1、4.17×10–2、4.17×10–3 、 4.17×10–4 、 4.17×10–5 、 4.17×10–6 、 4.17×10–7 、4.17×10–8ng·μL–1; 10 為陰性對照Fig. 4 Amplification of 2aooniF/2aooniR primer at 58.5 ℃annealing temperatures on CoTS larvae. M: 2000bp marker;1-9: 4.17, 4.17×10–1, 4.17×10–2, 4.17×10–3, 4.17×10–4,4.17×10–5, 4.17×10–6, 4.17×10–7 and 4.17×10–8 ng·μL–1,respectively; 10: negative control sample

2.4 野外浮游生物樣品長棘海星幼體的檢測

利用2.2 篩選的特異性引物2aooniF/2aooniR 和退火溫度58.5℃對西沙群島七連嶼浮游生物樣品進行長棘海星幼體目的片段的擴增。結果發現, 在七連嶼的6 個站位中, 4 號、5 號和6 號三個站位樣品均能成功擴增出目的基因, 而其他站位的樣品未擴增出目的片段(圖5)。表明七連嶼中島、南島和北沙洲存在長棘海星幼體, 且所采集水體中長棘海星幼體的DNA 濃度高于皮克級別。

圖5 2aooniF/2aooniR 引物在58.5℃退火溫度下對浮游生物樣品的擴增M: 為2000bp marker; 1—8 分別為58.5℃下擴增的XSZ、ZS-1、ZS-2、ZD、ND、BSZ、陰性、陽性樣品Fig. 5 Amplification of 2aooniF/2aooniR primer at 58.5 ℃annealing temperatures on the plankton samples. M: 2000 bp marker; 1-8: XSZ, ZS-1, ZS-2, ZD, ND, BSZ, negative and positive control sample was amplified at 58.5 ℃annealing temperatures, respectively

3 討論

引物與目標DNA 的成功結合是PCR 擴增中的關鍵一步, 主要受到退火溫度的影響。本研究通過對引物特異性、靈敏性及其退火溫度的摸索, 建立了長棘海星幼體的檢測技術, 并應用到南海西沙七連嶼長棘海星幼體的檢測中。研究發現引物2aooniF/2aooniR 在退火溫度為58.5℃進行PCR 擴增時, 其擴增效果最佳, 其檢測靈敏度可達到皮克級別, 并且分別在中島、南島和北沙洲檢測到長棘海星幼體。Suzuki 等(2016)也得到相似的結果, 引物2aooniF/2aooniR 可以成功擴增出單個長棘海星幼蟲的目的片段。這表明2aooniF/2aooniR 引物的靈敏度高, 可應用于環境樣品中長棘海星幼蟲的監測。

有研究表明長棘海星浮游幼蟲孵化時間一般在9～43d 之間, 時長的波動取決于食物和溫度等各種因素(Pratchett et al, 2017)。野外研究表明, 大堡礁長棘海星產卵幼蟲的浮游階段一般少于30d (Uthicke et al, 2015)。鑒于本研究所有浮游生物樣品均采集2021 年10 月21 日, 推測本研究檢測到的幼蟲可能來自2021 年9 月中旬至10 月中上旬, 表明南海長棘海星在9 月份和10 月份仍能產卵受精, 這進一步拓展了前期關于南海長棘海星的產卵主要發生在8月份的推測(Tian et al, 2017)。

海洋建模預測表明長棘海星幼蟲一般的旅行距離是35～75km, 最大旅行距離為150km(Dight et al,1990)。雖然七連嶼諸島之間最遠距離不超20km, 而且各島之間的距離處于長棘海星幼蟲能到達的區域范圍內。但本研究僅在西沙七連嶼的北沙洲、南島和中島檢測到長棘海星幼蟲, 而趙述島和西沙洲均未檢測到, 這可能與其他因素有關, 如洋流的速度、方向、強度以及幼蟲的食物等(Pratchett et al, 2017)。有研究表明, 在較慢的洋流中, 長棘海星幼蟲可以在單個珊瑚礁尺度上大量滯留(Wooldridge et al,2015)。中尺度和亞中尺度環流也會減少幼蟲的遠距離擴散(Wolanski et al, 1988)。此外, 浮游植物(如藻類等)會影響幼蟲在水體中的分布。Sameoto 等(2008)的研究表明, 幼蟲遇到藻類時會停止前行, 并在該位置發生聚集。由于環境因素的復雜性以及本研究所檢測環境因子的局限性, 無法探明影響長棘海星幼蟲地理分布特征的原因。因此要揭示幼蟲種群地理分布的驅動機理, 需進一步探究環境因子與幼蟲種群豐度和分布之間的耦合關系。此外, 盡管本研究建立了野外長棘海星幼蟲的檢測技術, 但是要了解幼蟲種群的動態變化, 對環境樣品進行定量分析是必不可少的一步。因此在今后的研究中, 需著力開發一套針對長棘海星野外環境中幼蟲的定量檢測技術。