乳腺腫瘤細胞體外分離培養方法的研究進展

邱敏，陳柳，代解杰

(1.昆明醫科大學，昆明 650500； 2.中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所，昆明 650118)

近年來，惡性腫瘤的發病率呈逐年上升趨勢，乳腺癌即是常見惡性腫瘤之一[1]。乳腺癌是發生于乳腺上皮或導管上皮的惡性腫瘤，其發病機制復雜，目前尚未完全闡明。培養乳腺腫瘤細胞對于研究各種致病因素導致的乳腺病理改變以及乳腺腫瘤藥物研發等均具有重要意義[2-3]。目前研究者已從人、小鼠、大鼠、犬等不同物種中分離出乳腺癌原代細胞，且建立了乳腺癌細胞系，通常從人體中分離的腫瘤細胞較從動物中分離的腫瘤細胞對于個體化的腫瘤治療更有利，但在篩選白血病藥物時，小鼠白血病細胞系是最好的，因此動物腫瘤細胞培養也非常重要[4]。分離培養實體腫瘤細胞是一項挑戰，需要專門的技術。乳腺癌原代細胞培養在乳腺癌研究中占據重要地位，但不同物種、個體以及病理類型細胞培養的成功率存在較大差異，因此其廣泛應用受到限制；同時，乳腺腫瘤細胞也存在諸多優點，如可為乳腺癌藥物的研發和個體化治療提供理想的實驗模型，因此有必要提升其分離培養技術[5]?，F就乳腺腫瘤細胞分離培養方法的研究進展予以綜述。

1 乳腺腫瘤細胞的常規分離方法

1.1酶消化分離法 酶消化分離法的原理是用特定的酶溶液將組織松散，從而溶解和破壞細胞間蛋白連接，獲得細胞懸液。目前應用于酶消化分離法的酶主要包括膠原酶、胰蛋白酶、透明質酸酶以及中性蛋白酶等，通常是幾種酶按一定比例混合使用[6]。酶消化分離法的優點在于可得到較多的細胞、維持細胞膜完整性、細胞間不粘連，且可正常分裂并進行傳代培養，但所得的細胞懸液中混有雜細胞、易污染，且酶消化時間難以控制[7]。研究者可通過差速離心法、有限稀釋法以及單克隆挑選等純化細胞。

膠原酶對腫瘤細胞影響較小，適合消化纖維組織、上皮組織以及腫瘤組織。研究顯示，Ⅳ型膠原酶對乳腺癌的消化作用不強，不建議應用；Ⅱ型膠原酶適用于消化乳腺癌中纖維成分較多的硬癌，且易得到乳腺癌單個細胞[8]。鈣離子、鎂離子以及血清蛋白的存在均會降低胰蛋白酶的活性，因此聯合應用胰蛋白酶與乙二胺四乙酸消化分離組織時，在單用胰蛋白酶消化前應避免血清的干擾[9]。胰蛋白酶不適合消化纖維組織成分較多的硬癌，適合消化細胞占比較大的髓樣癌[10]。此外，胰蛋白酶還可應用于細胞傳代，以消除對腫瘤細胞干擾的成纖維細胞。王立斌等[11]用酶消化分離法分離乳腺癌細胞，在7～10 d時即出現懸浮生長的細胞克隆簇，且該細胞具有持續增殖的特性，最終成功分離出乳腺癌干細胞。史剛[12]用酶消化分離法成功獲得乳腺癌原代細胞，該原代細胞于第2天開始貼壁，第4天細胞完全貼壁，幾次傳代后細胞胞體較大，呈鋪路石樣外觀。

1.2機械分離法 機械分離法是指首先通過物理方法將乳腺腫瘤組織剪切成組織碎塊，再用腫瘤組織對應的培養基輕輕沖洗組織碎塊，然后通過尼龍或鋼網(50～100 μm的開口)過濾、渦旋，并使用移液器(或順序較小的針)反復抽吸，快速生成單細胞懸浮液，其優點在于可在短時間內得到組織細胞[13]。但利用機械分離法分離腫瘤組織并不是獲得腫瘤細胞的合適技術，其物理剪切時間較長，可導致較多細胞死亡，而死亡的細胞又會分泌細胞降解酶，不利于細胞生長，影響細胞存活率[14]。Ljung等[15]利用機械分離法與酶消化分離法分別獲得乳腺癌原代細胞，結果發現，與酶消化分離法相比，利用機械分離法分離會產生更多的死細胞和具有超二倍體的細胞。

1.3組織塊培養法 組織塊培養法是指將乳腺腫瘤組織碎片直接放入培養瓶中恒溫培養，其中部分細胞會慢慢從組織中游出并貼壁生長。組織塊培養法具有操作步驟簡單、培養成功率高、保留了細胞與細胞以及細胞與組織間的良好接觸等優點，但細胞長出所需時間較長，且并不是每一個組織碎片均能長出細胞[16]。Hass和Bertram[17]利用組織塊培養法培養人乳腺癌活檢原代細胞，結果發現，乳腺癌原代細胞群持續生長，其完整的細胞外基質和穩定的細胞表面蛋白表達可以為臨床制訂新的治療策略提供一個可重復的篩選平臺，以識別新的生物標志物。王敏等[18]利用改良的組織塊培養法將裝有組織塊的培養瓶在孵箱中正置4～6 h，然后再滴入少量培養液，觀察組織塊的貼壁情況，結果發現，當細胞爬出且鋪至瓶底約50%時，用胰蛋白酶消化法純化細胞獲得的細胞活性更好，最終成功在體外分離培養出人乳腺癌原代細胞。

2 乳腺腫瘤細胞的現代培養技術

在研究中使用原代細胞通常會遇到一個問題，即原代細胞只能培養很短的時間，隨著代次的增加細胞會停止增殖，且培養的細胞無法保證代次間的遺傳信息一致和正常的增殖。因此，在體外無限擴增哺乳動物來源的正常細胞和腫瘤細胞對于個體化醫療和再生醫學均非常重要。目前常用的乳腺腫瘤細胞培養技術主要包括3D細胞培養技術和條件性重編程細胞(conditionally reprogrammed cells，CRCs)技術，兩者在實用性、功能性方面各具特色。

2.13D細胞培養技術 3D細胞培養技術是指將細胞放置于模仿體腫瘤細胞微環境的3D培養系統內進行體外培養，細胞在3D系統的立體空間結構中生長，構成3D細胞-載體復合物[19]。3D細胞培養技術通過在體外構建類似于體內的細胞生長分化系統模擬腫瘤細胞生長的微環境，且其作為傳統2D細胞培養與體內天然環境的橋梁，具有2D細胞培養不可比擬的優勢[20]。

成功建立一個3D模型最重要的是選擇合適的生物材料，生物材料包括天然聚合物和合成聚合物。天然聚合物主要包括膠原蛋白、明膠、透明質酸、海藻酸、瓊脂糖和殼聚糖等，常見的合成聚合物主要包括聚乙二醇、聚乳酸、聚己內酯和聚氨酯等[21]。3D模型包括：①有支架的3D模型，細胞與基質相互作用，可更好地模擬體內腫瘤生長的微環境；②無支架的3D模型，細胞不能附著在培養皿表面，導致細胞聚集形成球狀體，其中，無支架的3D模型操作簡單、費用低[22]。聚合物支架可以支持腫瘤細胞并允許細胞間營養物質、氣體和信號交換，同時還可模擬細胞外基質條件[23-24]。傳統基于支架的3D細胞培養只應用單一的生物材料，而近年的研究多集中于支架材料的改造以及混合應用多種材料進行細胞培養[25]。許保海等[26]利用膠原作為3D支架材料建立了一個3D乳腺癌細胞培養體系，該培養體系可有效維持乳腺腫瘤干細胞干性。還有研究表明，可將腫瘤細胞包裹于基質支架形成的小囊中，從而形成大小均一的細胞球，這樣可顯著增加乳腺腫瘤細胞的活力[22]。彭雪梅等[27]利用人工基質膠構建體外3D細胞培養模型，首先將乳腺癌細胞MDA-MB-231包裹于人工基質膠中，然后再種于底部鋪有人工基質膠的培養皿中，結果發現MDA-MB-231細胞形成了一種近似體內的球形結構，且呈現出乳腺癌的去極化特征，成功模擬了乳腺癌在體內的真實形態。

3D生物打印是一項新興技術，在功能組織和器官的制造方面具有廣闊的應用前景。3D生物打印技術是一種通過連續沉積細胞的生物墨水層創建3D結構的生物制造方法[28]。生物打印已成為制造3D人類腫瘤模型的一種有前途的方法，這種模型可更好地再現體內組織結構的關鍵特征[29]。趙思雨等[30]通過3D生物打印技術構建乳腺癌細胞(MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞)3D水凝膠乳腺癌模型，結果顯示在水凝膠支架上培養的 MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞持續增殖并形成多層細胞結構。生物打印技術的優點在于可快速形成所需的腫瘤模型，其缺點在于成本較高和尺寸限制?，F有的3D生物打印機體積較大、成本較高，限制了其廣泛應用[31]。

微流控技術的目的是通過在一個3D體外系統的芯片上復制血管網絡通道和實質模擬體內腫瘤微環境，重建傳統細胞培養或動物研究中無法輕易建模的器官的功能單元[32]。微流體通道可定制流速灌注，且常充滿水凝膠前體細胞懸浮液，在光照下會凝膠化，可用于血管生成、機械轉導途徑、腫瘤細胞行為和藥物反應研究等[33-34]。Truong等[35]設計了一個3D微流控共培養系統，在芯片上模擬腫瘤微環境的空間組織，對腫瘤-基質相互作用進行力學研究，并分別在3D腫瘤與間質區域共培養乳腺癌細胞和成纖維細胞，結果發現，成纖維細胞可通過誘導乳腺癌細胞中新型基因的表達增強乳腺癌細胞的侵襲能力，從而提高遷移速度，可用于腫瘤分子機制研究。Nagaraju等[36]開發了一種新型3D微流控系統，該系統由同心三層細胞負載水凝膠組成，可同時研究腫瘤-血管串擾對乳腺癌細胞浸潤、內滲以及血管成熟的影響。雖然目前微流體研究仍處于起步階段，但已成為研究乳腺癌的一個重要工具。

總之，腫瘤細胞與其微環境之間的相互作用可調控細胞分化、增殖和基因表達等過程，體外3D細胞培養技術可更好地了解腫瘤細胞及其分子機制，而3D模型是研究細胞遷移、存活和生長的理想模型[37]。

2.2CRCs技術 CRCs技術是一種將銫源γ射線輻照過的小鼠胚胎成纖維細胞(Swiss -3T3-J2細胞)與人正常細胞或腫瘤上皮細胞共培養，并添加Rho相關蛋白激酶抑制劑Y-27632使正常細胞或腫瘤細胞獲得部分干細胞特性和在體外無限復制能力的細胞培養技術[38]。CRCs技術主要實驗步驟包括：①J2細胞的輻照，當J2細胞密度達80%時，即可經胰蛋白酶消化后制備細胞懸液，用銫源輻照器輻射J2細胞，劑量為3 000 rad，也可用絲裂霉素處理J2細胞，確保其不增殖，處理后的J2細胞應立即與分離的原代細胞共培養或收集上清儲存；②乳腺腫瘤分離原代細胞，用酶消化分離法分離原代細胞；③共培養，將處理后的J2細胞立即與從組織中分離出的原代細胞在37 ℃、5%的二氧化碳條件下混合培養；④細胞分離，傳代過程中，胰蛋白酶消化腫瘤細胞與J2細胞的時間不同，J2細胞優先脫落，從而將腫瘤細胞與J2細胞分離；⑤條件培養基培養腫瘤細胞，在3代共培養后，可采用條件培養基培養法直接培養腫瘤細胞[39]。CRCs技術無需基因修飾即可顯著提高細胞的體外增殖能力，并可在短時間內獲取大量的原代細胞，且細胞可以無限傳代，繞過衰老信號，可廣泛應用于新細胞系的建立[40]。但其具體機制目前尚未明確。有研究發現，飼養層細胞可分泌細胞因子，而分泌的細胞因子與抑制劑混合可維持原代組織及相關細胞亞群生長[41]。

通過CRCs技術可成功培養乳腺癌[42]、膀胱癌[43]、前列腺癌[44]、胰腺癌[45]以及肝細胞癌[46]等惡性腫瘤細胞，且這些重編程的永生化細胞無基因操縱和染色體異常。周昕等[47]利用CRCs技術分離培養人原代乳腺癌干細胞，結果顯示原代乳腺癌干細胞可穩定傳代擴增至第9代，并保持乳腺癌細胞的特征。趙鴻雁等[48]利用CRCs技術成功培養出乳腺癌原代細胞和肺癌原代細胞，通過短串聯重復序列分析發現，利用CRCs技術擴增的原代細胞保留了其來源組織的遺傳特性。Mahajan等[49]利用CRCs技術從6例乳腺癌患者腫瘤組織中分離培養出乳腺癌細胞，并在傳代培養后評估CRCs基因組的變化，結果顯示，乳腺癌CRCs保持了其來源的腫瘤組織的總拷貝數、基因突變和微RNA的表達模式。CRCs技術的優點在于可快速、有效地在體外培養原代細胞，且只需微量細胞即可建系，同時還可保持腫瘤細胞的異質性，克服了傳統細胞系的缺點，經CRCs培養體系建立的原代細胞可維持組織的染色體特征，并保持正常組織來源的生物學特性[50]。CRCs技術適用于新細胞系建立、腫瘤生物學評估以及抗腫瘤藥物的機制與療效研究、潛在腫瘤治療靶點的篩選等[51]。

3 乳腺腫瘤細胞培養的意義

腫瘤細胞培養可供體外藥敏研究。乳腺腫瘤原代細胞為個體化治療提供了理想的實驗模型，原發性腫瘤細胞可用于基因組測序、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學研究，而研究數據可用于重新設計新的抗癌策略，對乳腺腫瘤的藥物研發具有重要意義?；熓侨橄侔┲委煹闹匾侄沃?，在化療前通過體外藥敏試驗篩選出合適的藥物、避免藥物出現耐藥，可提高化療的療效[52]。

腫瘤細胞培養可通過建立動物移植模型將乳腺腫瘤細胞移植到同種動物體上，觀察腫瘤生長是否與該自發動物成瘤情況相同；也可將細胞移植到裸鼠體內，觀察腫瘤的生長情況，如腫瘤細胞成瘤時間和腫瘤大小等。乳腺癌動物模型的制作對乳腺癌的研究具有重要意義，而動物腫瘤細胞的培養也同樣重要[53-54]。腫瘤具有異質性和復雜性，因此有必要建立更多的乳腺腫瘤細胞系，以代表原發腫瘤。細胞系是基礎研究和臨床研究的關鍵，也是基因和蛋白表達分析、信號轉導以及藥理和毒理學實驗的決定性因素[55]。細胞系是實驗室分析的金標準，具有操作簡單、自我復制、可用性和同質性的優點[56]。目前關于乳腺癌的研究大多是基于細胞系的研究。

4 小 結

原發性腫瘤細胞系已成為目前乳腺癌個性化治療不可或缺的工具。腫瘤細胞系的建立需要選擇合適的腫瘤細胞分離技術，其中酶消化分離法可得到較多的細胞，且可正常分裂并進行傳代，但仍需優化特定組織不同酶的濃度、比例以及消化時間等。CRCs 技術是一種新興技術，與傳統細胞培養方法相比，其可更快速、有效地建立細胞系，且可保留來源腫瘤的遺傳特性，有助于從細胞分子角度了解腫瘤的發病機制。而3D細胞培養技術可提供腫瘤細胞生長的微環境，促進細胞間的相互作用，更適用于評估藥物反應?？傊?，利用傳統分離培養方法分離乳腺腫瘤細胞并聯合目前新技術進行細胞傳代可以提高乳腺腫瘤細胞分離培養的成功率。