皮膚黑色素瘤的腫瘤免疫微環境研究

齊云峰，王雨琦，李銘新，徐振東，董成成，蘇 建，張金玲，王 鵬

(1.吉林師范大學 生命科學學院，吉林 四平 136000；2.吉林師范大學 化學學院，吉林 四平 136000)

0 引言

皮膚黑色素瘤(SKCM)具有高度的侵襲性、耐藥性和異質性[1].目前，手術切除仍是治療原發性黑色素瘤的首選方法[2].此外新型的免疫治療策略也取得了成功并提高了患者的生存率，如使用細胞抗毒性T細胞抗原4(CTLA-4)[3]、抗程序性死亡受體1(PD-1)[4]、惡性黑色素瘤相關性抗原A3(MAGE-A3)[5]的免疫治療.接受免疫治療的大部分患者有良好預后，但由于腫瘤微環境(TME)與腫瘤細胞之間相互作用的復雜性，仍有一些病人會產生不良反應，如自身免疫反應[6].利用表達譜數據估計惡性腫瘤組織中基質和免疫細胞(Estimation of Stromal and Immune cells in Malignant Tumor tissues using Expression data，ESTIMATE)算法可以預測腫瘤純度以及腫瘤組織中浸潤的免疫細胞和基質細胞的占比[7].通過評估黑色素瘤中免疫打分和基質打分來描述免疫和基質細胞的比例.腫瘤細胞的微環境情況影響免疫細胞的含量，而微環境驗證過程中腫瘤和免疫過程密不可分[8].當腫瘤有較低的免疫細胞浸潤時，低CD8+CTLs會使腫瘤對治療產生耐藥性[9].相比之下，隨著免疫細胞浸潤的增加，腫瘤對免疫療法的敏感性增加[10].腫瘤微環境內的免疫細胞和腫瘤細胞都會爭奪其中的物質資源，以確保自身發展.由于高代謝，腫瘤細胞將產生高酸性、缺氧和富含免疫抑制代謝物的腫瘤微環境，挑戰免疫細胞的抗腫瘤作用[11].因此，有利于免疫細胞浸潤并延長抗腫瘤T細胞壽命的綜合免疫療法，可能會明顯提高治療療效[12].目前的研究表明，主要的抗腫瘤效應免疫細胞如細胞毒性T淋巴細胞、NK細胞等免疫細胞在腫瘤微環境內的免疫活動中起主要的作用[13].在皮膚黑色素瘤中，腫瘤微環境會利用腫瘤浸潤的免疫細胞維持免疫抑制作用，其中主要是淋巴細胞[14].分析免疫細胞及差異蛋白的互作關系可以為黑色素瘤的新治療靶點和治療方法提供創新見解[15].

本研究使用癌癥基因組圖譜數據庫(TCGA)和基因表達量關聯數據庫(GTEx)中皮膚黑色素瘤(SKCM)的表達譜數據和患者的臨床數據，并對樣本分別進行免疫、基質和綜合打分，探究腫瘤免疫微環境和皮膚黑色素瘤的相關性.

1 材料與方法

1.1 數據來源

RNA-Seq，臨床數據來源于癌癥基因組圖譜數據庫(The Cancer Genome Atlas，TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov)，正常皮膚數據來源于基因表達量關聯數據庫(The Genotype-Tissue Expression，GTEx，http：//genome.ucsc.edu/)，探針數據來源于基因表達綜合數據庫(Gene Expression Omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).共從TCGA下載472個樣品，從GTEx下載812個樣品，共計腫瘤樣品471個，正常樣品813個.樣品預處理均使用R語言(4.1.3版本)，并剔除臨床信息不全樣品.

1.2 腫瘤微環境打分

使用到ESTIMATE程序分析皮膚黑色素瘤中免疫細胞與基質細胞浸潤水平，分析的數據來源于TCGA數據庫.計算皮膚黑色素瘤中的基質細胞打分、免疫細胞打分和綜合打分.

1.3 網絡互作和富集分析

使用STRING網站(11.5版本，https：//cn.string-db.org/)計算交集基因的節點大小，最低要求互作分數大于0.700(High confidence).使用Cytoscape(3.9.1版本)繪出蛋白網絡互作圖.使用GSEA軟件(4.2.3版本)分別對高低兩組的前10個通路做富集合圖.

1.4 統計學處理

使用線性回歸模型(GLMM)比較正常樣品與腫瘤樣品之間基因表達差異，蛋白互作網絡得到了預后相關的核心基因，并用箱線圖來展示核心基因在正常和腫瘤樣品的差異表達情況.基因表達與患者生存率之間的關系使用單因素Cox分析、多因素Cox分析與Log-rank檢驗方法.腫瘤微環境相關性、免疫細胞基質細胞打分使用Spearman或Pearson相關性分析.文章中所有的分析使用R語言(4.1.3版本)完成，并且使用到了Ggplot2、Limma、Survival、Pheatmap、VennDiagram、Enrichplot等R包繪制文章圖片.

2 結果與討論

2.1 生存曲線

通過將腫瘤微環境的打分分數和對應樣品的生存時間、生存狀態進行合并，繪制三種不同打分的生存曲線圖.圖1(A)的生存曲線展示了隨著時間的推移病人的生存率逐漸下降.并且根據免疫細胞的打分將病人樣品分成高低打分兩組之后，通過計算生存率得出高低兩組的生存率具有顯著差異(P<0.001)的結論.這說明皮膚黑色素瘤中免疫細胞的含量和生存率相關.其次在圖1(B)的生存曲線展示了高低分兩組的生存率是有差異的(P<0.05).這說明皮膚黑色素瘤中基質細胞打分和生存率相關.圖1(C)的生存曲線說明免疫細胞和基質細胞的綜合打分和病人的生存率相關(P<0.05).

圖1 基于ESTIMATE算法的免疫細胞打分(A)、基質細胞打分(B)、免疫和基質細胞綜合打分(C)的生存曲線

為方便分析這些差異基因之間的蛋白互作關系，得到蛋白網絡互作圖.圖2(A)中每個節點代表基因或蛋白質.圖2(B)展示了這些基因連接的基因節點數，基因節點數越大，代表此基因連接的基因就越多，同時說明這個基因越重要.圖中顯示出來的基因則是網絡核心基因的備選基因.最后發現IL2RA與CD247、CD28、CD3G、CD69、CD8B、IFNG、IL7R、LCK和PTPN22之間互相關聯.

圖2 蛋白網絡互作圖(A)和網絡核心基因(B)

經過Cox回歸分析，得到預后相關的基因(P<0.05)，及其相對風險比(Hazard Ratio，HR)值.通過蛋白網絡互作得到的核心基因和Cox回歸分析得到的預后基因之間的交集，最終結果是IL2RA基因.接下來對IL2RA基因進行單基因分析，通過圖3(A)和(B)看出IL2RA基因在腫瘤樣品和正常樣品是具有顯著差異的(P<0.001)，同時也能看出IL2RA基因在腫瘤組顯著上調.說明IL2RA基因在腫瘤樣品中高表達.然后對IL2RA基因進行生存分析，根據目標基因的表達量，將病人樣品分成高表達組和低表達組，觀察IL2RA基因圖3(C)的生存曲線，說明IL2RA基因和預后相關(P<0.05).

IL2RA基因在腫瘤發生過程中的免疫相關信號(Immunologic signatures)根據表達情況分成高低表達兩組.分別取富集最顯著的前10個(|log2FC|>0.5、P<0.05)做多信號富集分析圖.圖4(A)中表示基因的表達越高，這些免疫信號越活躍，即兩者之間是正相關的.圖4(B)中表示基因的表達越高，這些免疫信號越不活躍，即兩者之間是負相關.

圖3 單基因差異分析(A)，配對差異基因(B)和生存分析(C)

續圖3

圖4 正相關免疫信號的多GSEA富集圖(A)和負相關免疫信號的多GSEA富集圖(B)

計算每個樣品中免疫細胞的相對含量之后，在免疫細胞柱狀體里體現出含量比.圖5(A)中橫坐標是樣品名字，縱坐標是免疫細胞的相對含量，可以直觀地觀察到每種免疫細胞含量在各個樣本中的比例.根據目標基因的表達量，將病人樣品分成高低表達兩組，比較免疫細胞在高低兩組的差異情況.圖5(B)的小提琴圖展示了各個免疫細胞在高低兩組的表達量以及在兩組之間的差異情況.其中，γδT細胞(T cells gamma delta)、靜止NK細胞(NK cells resting)、活躍NK細胞(NK cells activated)和靜止肥大細胞(Mast cells resting)在高低表達兩組有差異(P<0.05).漿細胞(Plasma cells)、CD8 T細胞(T cells CD8)、活躍CD4 T記憶細胞(T cells CD4 memory activated)、調節性T細胞(Tregs)、單核細胞(Monocytes)、M0期巨噬細胞(Macrophages M0)和M2期巨噬細胞(Macrophages M2)在高低表達兩組有顯著差異(P<0.001).

圖5 免疫細胞柱狀圖(A)和免疫細胞差異分析的小提琴圖(B)

將基因的表達量和免疫細胞的含量進行相關性檢驗，圖6展示了IL2RA基因的表達量和免疫細胞的相關性情況.同時可以看出所有的免疫細胞和IL2RA基因的表達量都呈顯著相關(P<0.05)，其中天然B細胞(B cells native)、靜息狀樹突狀細胞(Dendritic cells resting)、M1期巨噬細胞(Macrophages M1)、單核細胞(Monocytes)、活躍NK細胞(NK cells activated)、漿細胞(Plasma cells)、活躍CD4 T記憶細胞(T cells CD4 memory activated)、CD8 T細胞(T cells CD8)和調節性T細胞(Tregs)與IL2RA基因相關系數大于0，即二者之間呈正相關.其余免疫細胞的含量與IL2RA基因呈負相關，即IL2RA基因的表達量越高，免疫細胞的表達量越低.

圖6 免疫細胞相關性

3 結論

本文對皮膚黑色素瘤的腫瘤微環境情況和打分進行了系統、全面的表征分析，并對免疫浸潤細胞的占比等也進行了展示.免疫細胞在不同腫瘤微環境中的表達情況是不相同的.其中漿細胞，CD8 T細胞，活躍CD4 T記憶細胞，調節性T細胞，單核細胞，M0期巨噬細胞和M2期巨噬細胞在高低評分兩組之間差異顯著.通過尋找預后相關基因和免疫基質細胞評分獲得差異表達基因的交集，找到IL2RA基因，這說明IL2RA基因可能在皮膚黑色素瘤中起著重要的靶點作用.根據IL2RA基因的表達情況，分析病人的預后生存情況和其中免疫細胞、基質細胞的含量比.綜上所述，本研究表明IL2RA基因對皮膚黑色素瘤的預后有異質性，并且發現所有免疫細胞的含量和IL2RA基因顯著相關.此研究對皮膚黑色素瘤在腫瘤微環境和免疫細胞浸潤情況進行了闡釋，為日后臨床上的免疫治療提供了新的治療和研究靶點.