況 漫 朱貴娟 馬亞琳
湖北省十堰市人民醫院(442000)
宮頸上皮內病變是宮頸浸潤癌前病變,與其發生發展密切相關[1]。宮頸病變發展至宮頸癌前及時發現并給予有效干預具有重要意義[2-3]。人乳頭瘤病毒(HPV)可引發不同性質的腫瘤[4]。SLC5A8基因是2002年被發現,近些年研究認為其表達在腫瘤發生中意義重要[5]。RASSF2A基因是RAS相關結構域家族基因2的A轉錄本,是潛在腫瘤抑制基因,與多種腫瘤的發生有密切關系[6]。本研究對宮頸病患者臨床資料進行分析,探究高危型HPV感染及SLC5A8、RASSF2A基因啟動子甲基化在宮頸病變診斷中的臨床價值。
回顧性收集2018年5月-2021年5月本院收治的宮頸病變患者186例臨床資料,年齡(48.0±5.3)歲(26~61歲)。納入標準:①符合《宮頸病變的診斷與治療》[7]中宮頸病變診斷標準;②初次接受治療;③未合并其他惡性腫瘤。排除標準:①已接收放射或化療藥物治療;②妊娠期;③資料不完整。根據陰道鏡宮頸活檢病理診斷結果,分為宮頸上皮內瘤變I級組(73例)、II級組(57例)、III級組(56例),正常細胞為對照組(43例)。本研究經院倫理委員會審批。
1.2.1HBVDNA采用北京英碩力金柏科技有限公司的HBV DNA檢測試劑盒,PCR擴增法檢測。先將89μl擴增混合液與1μlTAQ酶配置PCR反應體系(100μl)。按照標記向每個PCR管內加入10μl對應的樣本DNA或陽性對照控品?;靹?,離心后收集。將已配備完成的PCR擴增體系加入適宜的PCR擴增儀內:50℃ 2min,64℃ 4min,94℃ 30s;48℃ 45s,72℃ 20s,重復28個周期;隨后94℃ 30s,65℃ 45s,72℃ 20s,重復25個周期。隨后4℃下完成反應。將擴增產物處理后在儀器檢測,探針信號值≥40m陽性,<40m陰性。
1.2.2SLC5A8基因啟動子采用上海英濰捷貿易有限公司的SLC5A8檢測試劑盒,甲基化特異性PCR法檢測。按照說明書提取樣本DNA并修飾,SLC5A8甲基化上游引物為5'-TCGAACGTATTTCGAGGC-3',下游引物為5'-ACAACGAATCGATTTTCCG-3';將對應的引物進行亞硫酸氫鹽修飾DNA樣本擴增:PCR在50℃ 2min,95℃ 2min;95℃ 15s;60℃ 30s,循環40次,對反應產物開始凝脂糖凝膠電泳。
1.2.3RASSF2A基因啟動子甲基化采用北京天根生化科技公司試劑盒,按照DNA提取試劑盒說明書提取檢測。收集1μgDNA溶于50μl水內,加入3mol/LNAOH溶液3.3μl,37℃下孵育15min;加入10mmolL氫醌 30μl以及520μl的亞硫酸氫鈉混勻,50℃水浴16h。經過堿基修飾后的DNA進行脫鹽、純化和回收。修飾后DNA開始聚合酶鏈反應,甲基特異性引物:5'-GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG-3'以及5'-AAAAACCAACGAC-CCCCGCG-3',擴增的片段為108bp,反應體積30μl,在95℃下預變性5min,在95℃下變性30s,58℃退火30℃,72℃延伸30s。連續35個周期,在72℃下再次延伸6min,PCR產物通過瓊脂糖電泳,在溴化乙錠染色后在凝膠成像系統下觀察。
檢測各組標本HPV DNA、SLC5A8以及RASSF2A基因啟動子甲基化陽性率。
HPV DNA陽性率,對照組(0,0/43)、宮頸上皮內瘤變Ⅰ級組(28.8%,21/73)、Ⅱ級組(63.2%,36/57)、Ⅲ級組(92.9%,52/56)依次升高(χ2=54.358,P<0.001)。
對照組、Ⅰ級組、Ⅱ級組、Ⅲ級組標本SLC5A8基因啟動子甲基化及RASSF2A基因啟動子甲基化陽性率均依次升高(均P<0.05)。見表1。
表1 各組基因啟動子甲基化陽性率對比[例(%)]
宮頸病變為多重原因造成的宮頸部位發生病理性變化,包括感染、病原體入侵等引起的宮頸炎、宮頸腫瘤等[7-8]。導致宮頸病變的因素多種,病情程度可分為輕、中、重度,治療不及時可能發展為宮頸癌,所以宮頸病變早期篩查與診斷極為重要[9-10]。
HPV是導致宮頸病變的危險因素,高危型HPV感染與宮頸癌的發生關系密切[11]。本研究結果顯示,與對照組相比,子宮上皮內瘤病變I級、II級、III級組標本HPV DNA陽性率逐漸升高。SLC5A8基因是一種腫瘤抑制基因,該基因編碼蛋白是一種細胞運載體,對乳酸、煙酸以及脂肪酸等進行轉運,同時能對碘化物進行轉運[12]。SLC5A8基因能夠把丁酸運轉到細胞內,且能發揮組蛋白脫乙?;敢种苿┑墓δ?,在上皮細胞癌前病變中發揮重要作用,可促進腫瘤細胞的凋亡[13]。本研究結果顯示,對照組、子宮上皮內瘤病變I級、II級、III級組標本SLC5A8基因啟動子甲基化陽性率逐漸升高,說明SLC5A8基因啟動子甲基化與宮頸病變發生發展有一定關系。RASSF2A基因在人體腦、胎盤以及血液中較高表達,含有多種轉錄本,同時啟動子區域含有多種CpG島,能夠促進轉錄的甲基化[14-15]。本研究結果顯示,對照組、子宮上皮內瘤病變I級、II級、III級組標本SLC5A8基因啟動子甲基化陽性率逐漸升高??赡芤驗椋篟ASSF2A基因可以激活caspase3引起細胞的凋亡,且能導致細胞周期阻滯在G1期,抑制上皮細胞瘤的增生[16]。
本次研究通過檢測不同病變程度患者標本中高危型HPV感染及SLC5A8、RASSF2A基因啟動子甲基化陽性表達率存在差異,提示上述檢測指標在宮頸病變中可能發揮重要作用,為臨床防治提供思路。