藥物性牙齦肥大動物模型的建立及相關機制

李佳博，臧文麗，潘亞萍

藥物性牙齦肥大(drug-induced gingiva enlargement，DIGE)是指長期服用某些藥物而引起牙齦組織的纖維性增生和體積增大，相關常見藥物包括：抗癲癇藥、鈣通道阻滯劑、免疫抑制劑等[1]。DIGE表現為發生于齦乳頭和附著齦的顯著纖維性增生，可覆蓋大部分或全部牙冠，妨礙口腔功能，影響衛生及美觀。病理表現為纖維增生、細胞外基質積累，其相關機制涉及成纖維細胞增殖及凋亡異常、基質金屬蛋白酶/基質金屬蛋白酶抑制酶失衡、上皮間充質轉化等[2]。除藥物直接作用外，牙齦組織對菌斑等刺激因素的反應性改變、個體易感性(年齡、性別、遺傳因素等)均影響DIGE的發生發展。

動物實驗是研究DIGE的重要環節，而DIGE動物模型的建立是體內研究的基礎。本文旨在對動物模型的基本建模方法、影響因素及其相關機制進行回顧總結。

1 造模動物

1.1 動物種屬

目前，大鼠、小鼠、犬、貓及靈長類動物被應用于DIGE的建立，其中大鼠以其價格低廉、易于飼養、藥物敏感性強等原因應用最為廣泛。大鼠磨牙及牙周組織形態與人類相似，每個象限有一顆切牙及三顆磨牙。大鼠DIGE模型中下頜牙齦肥大重于上頜[3]，切牙區重于磨牙區，頰側大于舌側[4]，這與人類DIGE好發于前牙及頰側表現一致。實驗顯示DIGE發生率及嚴重程度在Fisher大鼠及SD大鼠間無統計學差異[5]。有研究者使用猴子[6]、貓[7]及比格犬[8]建立動物模型，但這些動物飼養難度及成本更高，且其牙齦肥大表現與人類差異較大。

1.2 動物年齡

Ishida等[9]的實驗中給予20、40 d及90 d齡大鼠相同劑量硝苯地平灌胃，發現僅在20 d齡組成功誘導DIGE。Morisaki等[10]的研究顯示相同給藥時間情況下，30 d齡大鼠DIGE發生率為15 d齡大鼠的55%。藥理學及毒理學實驗中多采用4周齡大鼠，因該年齡藥物敏感性最強。大鼠約8周齡時性成熟，成年大鼠藥物敏感性顯著下降，這可能與高齡大鼠細胞外基質分泌能力及酶活性下降有關[11]。選用低齡大鼠(2～4周齡)可引起更明顯的牙齦肥大。

1.3 動物性別

雄性大鼠較雌性大鼠更易感，且誘導雄性大鼠發生DIGE的所需血藥濃度閾值低于雌性。雌性大鼠通過卵巢切除術減少血漿黃體酮濃度后牙齦肥大程度為對照組的1.4倍[12]，而雄性大鼠受激素影響較小，更易誘導出相關模型[9]。臨床DIGE男性患病率高于女性，Barak等[13]報道硝苯地平引起的DIGE男女比例約為5∶1。Chang等[14]發現硝苯地平和雄激素受體(androgen receptor，AR)基因啟動子5′-非編碼區的結合激活AR表達。由此可見，激素是DIGE的重要影響因素。

2 藥 物

2.1 藥物種類

鈣通道阻滯劑中硝苯地平最易引起大鼠DIGE。有學者通過測量大鼠牙周探診深度，認為單位摩爾藥物引起牙齦肥大的能力環孢素>硝苯地平>苯妥英鈉[12]。有研究顯示環孢素引起全口牙齦廣泛增生，而尼群地平引起下頜前牙頰側牙齦局部增生[8]。盡管上述三類藥物誘導的DIGE有相似臨床癥狀，但其藥物作用途徑及致病機制不盡相同，環孢素引起的DIGE中炎癥程度較高，硝苯地平次之，苯妥英納則以纖維化為主，幾乎沒有炎癥[15-16]。

2.2 給藥方式

常見給藥方式包括飲食、灌飼、腹腔注射、皮下注射、靜脈注射、局部應用等。以飲食方式給藥，動物損傷小，但難以控制藥物準確劑量。難溶于水的藥物多制備為0.5%羧甲基纖維素鈉懸濁液形式進行灌胃給藥，服藥時間固定且劑量準確[17]。環孢素及苯妥英鈉多以皮下注射[18-19]和灌飼方式給藥[4]，Assaggaf等[20]通過小鼠皮下泵類緩釋裝置控制藥物流速以維持血藥濃度。Zhao等[21]將苯妥英鈉制備為緩釋微球，手術縫合于牙齦組織中，使牙齦退縮大鼠牙齦厚度增加[21]。人齦溝液及唾液內藥物濃度遠高于血藥濃度[22]，動物模型中局部藥物傳遞系統的應用或能更準確模擬DIGE的發生。

2.3 藥物劑量

研究顯示牙齦肥大程度與藥物劑量呈正相關關系，高劑量組較低劑量組牙齦增生明顯[9]。這在臨床流行病學研究中也得到證實，大劑量藥物服用者DIGE發生率更高。盡管目前動物實驗中給藥劑量遠低于毒理學大鼠藥物致死劑量，但多項研究中給藥組大鼠體重增加顯著低于對照組，高劑量硝苯地平(250 mg/(kg·d))可抑制幼齡大鼠生長[9]。血藥濃度中，峰值及谷底濃度都值得關注。研究顯示引起鏡下可見牙齦肥大所需的最低血藥濃度分別是5 μg/mL(苯妥英鈉)、600 ng/mL(環孢素)以及800 ng/mL(硝苯地平)[12]。苯妥英納及環孢素給藥劑量約等于其治療劑量[23-24]，硝苯地平給藥劑量遠高于人體治療劑量[25]。

2.4 給藥時間

人DIGE常在服藥3個月后出現，9～12個月達高峰，這可能與牙齦組織細胞增殖凋亡周期有關。大鼠DIGE模型多需4～6周[26]，比格犬5個月建立完成(約為人類2年)[8]，牙齦增生程度隨時間增加而增加。研究顯示大劑量硝苯地平(250 mg/(kg·d))引起的DIGE于20 d達峰值，延長給藥時間不會出現更多增生肥大[12]。Fu等[26]的研究顯示給藥6周內牙齦肥大程度不斷增加，于6周達峰值，延長給藥至8周組牙齦肥大與6周組無統計學差異。與DIGE臨床表現類似，動物實驗中停藥后牙齦肥大可自行緩解或消失[12,27]。

3 建模方法

3.1 長期藥物過量法

通過6至8周的過量給藥可引起實驗動物普遍牙齦肥大表現，血藥濃度達閾值時DIGE發生率可達100%[4, 12]。大鼠牙齦組織切片觀察到類似人類DIGE的組織學及病理學表現，牙齦厚度及高度增加、上皮增生、上皮釘突伸長、膠原纖維堆積、炎癥細胞浸潤等，表明建立了可靠的DIGE模型[4]。與之不同的是，人類DIGE是相關全身藥物引起的牙齦組織特異性反應，其臨床發生率不等(苯妥英鈉7%～83%，環孢素8%～80%，硝苯地平30%～50%),流行病學研究顯示存在反應者及非反應者，二者服藥劑量及服藥時間無統計學差異[28]。由此可見，動物模型中藥物為主要刺激因素。

3.2 藥物結合牙周炎法

單純藥物過量法關注藥物的直接作用，難以模擬人類DIGE中多因素相互作用，因此有學者使用牙周炎模型配合過量藥物誘導DIGE。Wu使用結扎絲單側結扎大鼠第一磨牙并設置自身對照，每日灌胃硝苯地平50 mg/kg，發現結扎側DIGE較對照側明顯，早期結扎促進細胞因子基質金屬蛋白酶2、基質金屬蛋白酶9的表達，而建模后期藥物對該類因子起抑制作用[29]。Morisaki等[3]使用硝苯地平聯合大鼠口腔接種鏈球菌MT8148，處理53 d后發現加菌組探診深度大于無菌組。而Fernandes等[30]使用棉線結扎大鼠上頜第二磨牙并給予硝苯地平刺激，認為藥物本身無法引起牙齦增生，當炎癥存在時硝苯地平可加劇牙齦肥大和牙周組織炎癥。Okanobu等[27]的研究也認為炎癥是環孢素誘發DIGE的促進因素，研究同時顯示藥物不會增加附著喪失及牙槽骨吸收[3]。目前學者多使用單純結扎法刺激牙齦組織產生局部炎癥，局部炎癥存在情況下，相對低劑量的藥物即可引發DIGE。這與臨床研究結果相符，橫斷面研究發現反應者較非反應者牙周狀況更差，牙周炎患者牙齦肥大發生率更高，臨床通過牙周基礎治療可消除或緩解DIGE[28]。

3.3 多重藥物法

已知多種不同藥物可引起相似的牙齦肥大表現，臨床常見同時服用降壓藥及免疫抑制劑的腎臟移植患者發生嚴重DIGE。大鼠研究顯示環孢素聯合硝苯地平較單一藥物可引起更明顯的增生[17]。但也有學者聯合應用他克莫司和硝苯地平引起的牙齦增生與單一用藥組無統計學差異[31]，這與臨床表現相悖[32]，可能是藥物濃度及藥物作用時間不足的原因。

4 動物模型應用

4.1 藥物治療

臨床研究顯示約47.2%的DIGE患者在牙周支持治療階段再次出現牙齦肥大并需要再次治療[33]。由于大多數患者終生持續服藥，手術后仍有復發風險[22]。使用藥物干預DIGE可以起到預防、減輕以及輔助常規治療的作用。Ma等[34]在環孢素誘導的大鼠DIGE中發現丹參酮(Tan ⅡA)與環孢素聯用較單純環孢素組轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)β1表達下調，基質金屬蛋白酶染色濃度增強。Assaggaf等[20]通過以微滲泵方式給藥，發現洛伐他汀對環孢素引起的小鼠牙齦肥大有預防作用，洛伐他汀減少了上皮-間充質轉化相關標識物TGF-β1的表達，并部分減弱了苯妥英鈉下調E-cadherin的作用。

4.2 基因研究

臨床DIGE發生率遠小于實驗性DIGE揭示人類個體的藥物代謝能力具有明顯遺傳異質性，反應者及非反應者牙齦成纖維細胞的轉錄組學分析證明了這一點[35]。Staudinger等[36]使用環孢素處理野生型、敲除及過表達盤狀結構域受體(discoidin domain receptor，DDR)1小鼠的成纖維細胞，發現環孢素以DDR1依賴方式抑制細胞與膠原的結合、細胞在膠原上的遷移、膠原內化及收縮。Alshargabi等[37]藥物處理過表達SPOCK1的轉基因小鼠，觀察到顯著牙齦肥大及與上皮-間充質轉化相關的纖維化表型。已知多種基因及其代謝產物影響成纖維細胞異質性、膠原合成、膠原溶解活性、藥物受體結合及代謝，如細胞色素P3A5[38]、核受體4A1[39]。這些理論通過恰當的動物模型驗證，將更有說服性并提供新的研究思路。

4.3 動物模型的優勢與局限

實驗性DIGE與人類DIGE具有相似的組織學及病理學表現，造模周期短，影響因素可控。在臨床治療及取材面臨倫理限制的情況下，小鼠及大鼠模型使藥物研究及基因層面研究成為可能。

目前的造模方法多關注藥物、牙周狀況等影響因素，而忽略了全身因素，如癲癇、高血壓、器官移植引起的免疫反應，而這些因素已知與牙周病關系密切[40]，這可能需要研究者同時建立兩個或兩個以上動物疾病模型。

5 結 語

近年來我國心血管疾病、器官移植患者人數呈增長趨勢，相關藥物使用率增加且具有長期性及不可替代性，牙周基礎治療及手術治療不能完全解決DIGE問題，更多的機制及新型治療方法研究有賴于動物模型的建立。動物牙齦肥大模型涉及較多藥理學知識，如何根據研究目的建立更合理的動物模型，仍需深入實踐和探索。