B細胞在骨破壞性疾病中作用的研究進展

張濱婧，張璟嵐，張辰玥，陳藝菲，胡芝愛

骨骼在整個生命過程中不斷地更新和重建，通過成骨細胞(osteoblast，OB)介導的骨形成和破骨細胞(osteoclast，OC)介導的骨吸收共同調控，骨重建中骨量達到動態平衡，實現骨穩態[1]。

Arron等[2]在2000年首次提出“骨免疫學”這一概念，強調免疫細胞可在炎癥條件下調節OC生成。更多證據表明，免疫系統在生理和病理條件下均會影響骨穩態。此外，骨骼系統也會調節免疫細胞的發育。骨骼系統和免疫系統之間的相互調節作用受到廣泛關注。

以往研究中，T細胞在類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)[3]和牙周炎[4]等骨破壞性疾病中的作用已有廣泛報道。B細胞作為特異性免疫中的另一重要組成部分，也可通過表達核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)和骨保護素(osteoprotegerin，OPG)等細胞因子，分泌抗體等方式直接或間接地影響OC和OB功能調節骨穩態，在骨破壞性疾病的發生發展中起關鍵作用。

1 骨髓微環境對B細胞發育的調節

1.1 細胞因子

B細胞來源于骨髓中的多能造血干細胞，經過共同淋巴祖細胞、Pre-Pro-B細胞、Pro-B細胞、Pre-B細胞、未成熟B細胞和成熟B細胞階段后，最后分化為漿細胞。骨髓微環境為B細胞發育提供了一系列重要因子，如趨化因子C-X-C基元配體12(chemokine C-X-C motif ligand 12，CXCL12)、白細胞介素(interleukin，IL)-7、RANKL、OPG、干細胞因子(stem cell factor，SCF)、活化T細胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1)和FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3，FLT3)等[5]。

C-X-C趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4)是CXCL12主要受體，CXCL12-CXCR4軸是調控骨髓中B細胞祖細胞(B-lymphoid progenitor，BLP)功能的主要途徑[6]。Minami等[7]發現B淋巴前體細胞表達的CXCR4與基質細胞表達的CXCL12結合能誘導B淋巴前體細胞向Pro-B細胞分化。然而，當Pre-B細胞分化為未成熟和成熟B細胞時，B細胞對CXCL12的反應性降低，但CXCR4在細胞表面的表達并未改變。而當B細胞分化為漿細胞后，又重新恢復了對CXCL12的敏感度[8]。這種B細胞短暫地對CXCL12反應性喪失的機制目前尚未明確。有研究表明趨化因子受體7(C-C chemokine receptor type 7，CCR7)在Pre-B細胞向未成熟和成熟階段分化的過程中明顯上調[9]。McHeik等[10]證明CCR7通過抑制CXCR4介導的G蛋白抑制性α亞單位(inhibitory α subunits of G proteins ，Gαi)1蛋白和Gαi2蛋白活化從而抑制CXCR4的功能，CCR7缺乏的小鼠成熟B細胞表現出對CXCL12更高的反應性，CCR7在調節B細胞發育過程中的作用也不容忽視。

在早期B細胞發育過程中，IL-7和IL-7受體缺乏的小鼠表現出B細胞數量的明顯減少[11]。IL-7可以通過誘導髓樣細胞白血病蛋白-1(myeloidcellleukemia-1，MCL-1)的表達提高BLP的存活率[12]。在Pro-B細胞期，IL-7與IL-7受體結合，IL-7受體激活JAK1/3，繼而激活Stat5a/b，Stat5轉位到細胞核并激活多種基因轉錄從而促進B細胞的存活和增殖。IL-7受體還通過PLCγ/DAG/PKC信號通路激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)從而調控B細胞的生成[13]。而在Pre-B細胞期，一方面Pre-B細胞的發育依賴于IL-7受體信號和前B細胞抗原受體(pre B-cell receptor，PreBCR)信號，但依賴程度低于Pro-B細胞[14]；另一方面，IL-7受體信號又通過抑制Rag基因和Ig輕鏈基因的表達來阻止Pre-B細胞的發育[15]。目前尚不清楚IL-7受體信號的雙重作用是如何實現平衡的。Fistonich等[16]最近提出PreBCR信號可以通過增加CXCR4、降低黏著斑激酶的表達，減少Pre-B細胞與骨髓中的IL-7+細胞的接觸，進而減弱了IL-7受體信號轉導。

骨髓微環境中的其他細胞因子對B細胞發育也有重要影響。RANKL缺失小鼠的Pro-B細胞向Pre-B細胞轉變過程明顯阻滯，將正常表達RANKL的造血細胞前體細胞移植到RANKL缺乏的小鼠體內后發現B細胞可以正常發育[17]；OPG可能與B細胞的激活有關，在OPG敲除小鼠和OPG過表達小鼠中，B細胞發育似乎沒有影響，但B細胞對T細胞依賴性抗原的免疫反應減弱[18]；表達膜結合性SCF的細胞能促進Pre-B細胞向Pro-B細胞轉變[19]；NFATc1活性缺失會抑制早期B細胞因子1(early B-cell factor1，EBF1)(早期B細胞發展中表達的一種重要轉錄因子)的表達，損害Ig基因重排，影響Pre-BCR的形成，從而阻止Pro-B細胞向Pre-B細胞轉變，導致嚴重的B細胞減少[20]；FLT3配體缺乏的小鼠骨髓中BLP嚴重降低[21]。

1.2 相關細胞

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是由中胚層發育而來的骨髓非造血干細胞，可以進一步分化骨祖細胞、OB和成熟的骨細胞(osteocyte，OCY)。

BMSCs在B細胞的增殖和分化中起著重要作用。研究表明BMSCs中CXCL12的缺失會導致BLP的消失。Yee等[22]認為BMSCs中的骨硬化蛋白(sclerostin，SOST)的缺失會導致CXCL12降低，進而影響B細胞成熟后期IgM和IgG的上調。但還需進一步的研究來確定在SOST缺失的條件下，CXCL12及調節其表達的Wnt信號是否有變化。

OB也可以影響骨髓中B細胞的發育。OB已被證明能夠支持B細胞從造血干細胞發育成IgM+B細胞[23]。Martin等[24]和Wang等[25]都證明OB通過mTORC1信號調節B細胞從Pro-B細胞到Pre-B細胞的發育，且mTORC1信號來源的是前OB，而不是成熟的OB。

OC在B細胞的發育也發揮重要作用。Mansour等[26]發現當OC功能受損時，B細胞發育停滯在Pro-B細胞向Pre-B細胞發育的階段。體外研究也表明將人漿細胞和OC共培養后，人漿細胞的存活率提高[27]。

目前關于骨髓微環境對B細胞發育的研究大多基于小鼠體內，但人類和小鼠B細胞發育的所需條件可能不盡完全相同，仍有待進一步研究。

2 B細胞調節骨穩態的機制

B細胞主要通過RANKL/RANK/OPG軸調節骨穩態。正常生理情況中，在T細胞共刺激信號的調控下，B細胞是骨微環境中OPG的主要來源(OPG產量漿細胞>成熟B細胞>B細胞前體、未成熟B細胞)。OPG通過與RANK競爭RANKL的結合位點，從而抑制RANKL介導的OC分化和激活[28]。但Cawley等[29]研究結果相反，他們發現用CD19-Cre刪除B細胞的OPG并不會影響小鼠的股骨或脊柱的皮質厚度和松質骨體積。

在炎癥條件下，B細胞可以通過高表達RANKL與OC前體細胞結合，同時下調OPG，誘導OC分化[30]。盡管B細胞來源的OPG對骨丟失有一定的保護作用，但是B細胞表達的RANKL和T細胞來源的細胞因子對骨的破壞作用更占優勢。

除此以外，B細胞還可通過其他方式影響骨穩態。B細胞表達B細胞淋巴瘤因子6(B-cell lymphoma 6，Bcl-6)，Bcl-6通過結合NFATc1靶基因的啟動子區域，阻斷NFATc1的轉錄活性[31]。NFATc1是OC分化的主要調控因子。NFATc1與MITF、c-Fos和PU.1等轉錄因子聯合，通過誘導組織蛋白酶K、基質金屬蛋白酶9、酒石酸耐酸酸性磷酸酶和ATP酶H+轉運V0亞單位D2調控OC融合和骨吸收。

另外，在炎癥條件下B細胞可以分泌破骨細胞生成因子(secreted osteoclastogenic factor of activated T cells，SOFAT)。SOFAT是活化T細胞分泌的一種細胞因子，能以非RANKL依賴的方式誘導OC骨吸收[32]。

B細胞本身可能轉分化為OC。已有研究表明，骨髓B細胞能發生非典型的OC生成[33]，但是這種看法還存在爭議，因為無法完全排除分離的B細胞培養物中依然殘留有單核細胞的可能，同時也缺乏體內研究的證據。Deshet-Unger等[34]的最新研究利用譜系追蹤的方法證明了促紅細胞生成素在體內能夠刺激表達集落刺激因子-1受體(colony-stimulating factor-1receptor，CSF-1R)/CD115的Pro-B細胞轉分化為OC，但依舊不能完全排除散在單核細胞存在的可能性。因此，在排除單核細胞的存在下，Pro-B細胞能否分化為OC，在未來還有待進一步的研究。

3 B細胞與骨破壞性疾病

3.1 B細胞與RA

RA是一類自身免疫性疾病，以關節滑膜炎癥為特征，常導致關節局部骨侵蝕、關節周圍骨丟失乃至全身性骨質疏松癥。其發病機制復雜，之前的研究表明RA導致的骨損傷與滑膜細胞、Th17細胞和骨髓基質細胞激活OC有關[35]，近年來的研究也發現B細胞在RA的骨侵蝕中起著關鍵作用。

B細胞可能受到刺激后增殖分化成漿細胞產生自身抗體導致RA患者骨損傷。Engdahl等[36]在小鼠關節腔內注射突變瓜氨酸波形蛋白(mutated citrullinated vimentin，MCV)，發現關節滑膜組織和周圍骨髓腔中的漿細胞會分泌大量的抗MCV抗體?？筂CV抗體是RA的標志，能結合Fc受體激活下游的syk通路促進局部OC產生和活化，導致關節周圍的早期骨丟失。

進一步研究發現瓜氨酸蛋白/肽(citrullinated protein/peptide，CP)反應性B細胞除了表達IL-7受體和C5a受體之外，還表達共刺激分子CD40，并通過B細胞抗原受體特異性識別并內吞抗原，具有抗原提呈和活化T細胞的能力[37]。Mahendra等[38]從RA患者外周血提取了環瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)特異性B細胞，發現TNF-α、IL-6、CCL5和CXCR4表達均上調，通過分泌雙調蛋白(amphiregulin，AREG)誘導成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)的遷移和增殖，而FLS的激活是RA發病的標志之一。

此外，B細胞常存在于RA患者的關節滑膜組織中，以RANKL依賴的方式促進OC生成，同時通過高表達CCL3和TNF抑制OB成骨分化[39-41]。

綜上，B細胞在RA骨損傷的作用可能有以下4點：①產生自身抗體直接促進OC分化；②作為抗原提呈細胞激活T細胞間接影響骨穩態；③分泌細胞因子如IL-6、TNF和AREG等，直接激活OC或者通過調控其他細胞如成纖維樣滑膜細胞間接調節骨損傷[42]；④表達RANKL直接影響OC和OB功能。

3.2 B細胞與牙周炎

牙周炎以牙周支持組織炎性破壞為特征，臨床表現為牙齦出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收、附著喪失以及牙齒松動和移位。B細胞在牙周炎牙槽骨骨穩態維持中具有多重作用。

健康牙齦結合上皮根部附近的結締組織中存在CD19+CD27+記憶B細胞。牙周炎組織中的B細胞主要為CD19+CD27+CD38+CD138+HLA-DRlow漿細胞，聚集在牙周袋底部病變邊緣的牙周結締組織中[43]。Mahanonda等[43]發現在健康牙齦組織和牙周炎組織中漿細胞所占的比例都是最大的。這些漿細胞會分泌針對牙周病原體(如牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌等)的IgG和IgA，進一步形成免疫復合物激活補體經典途徑和中性粒細胞而導致牙周組織破壞。

B細胞也可以通過分泌促炎細胞因子間接影響牙槽骨吸收。Han等[44]發現將牙周炎大鼠牙齦中的致敏記憶B細胞注射到大鼠體內，會導致牙周組織中TNF-α、IL-1β和IL-17A表達增加，促進局部炎癥，引起牙槽骨吸收。

Jarry等[45]還證明了牙周炎患者牙齦組織中的成熟B細胞和漿細胞是SOFAT的主要來源。SOFAT的存在會加重炎癥反應，促進OC的形成和骨質破壞，在牙周疾病中發揮重要作用。

此外，B細胞還通過表達RANKL直接調控OC分化從而調節牙槽骨的動態平衡。Mahanonda等[43]在牙周炎組織中的漿細胞表面和細胞內均檢測到RANKL。Han等[44]證實了牙周炎期間牙齦內記憶B細胞通過產生RANKL直接促進了OC生成從而導致牙槽骨吸收。

除了傳統的B2細胞外，B1細胞在牙周炎期間也表現出誘導牙槽骨吸收的潛力?？谇桓腥緦е翴L-33表達增加，IL-33介導的B1細胞可以招募單核細胞和粒細胞并產生RANKL[46]，還能在RANKL和M-CSF存在的條件下分化為破骨細胞樣細胞。

有研究表明牙周炎中的B細胞受到自噬的調控。牙周炎組織中自噬基因EDEM1越高，B細胞的激活程度越高[47]。牙周病原體可以觸發自噬來消滅微生物，而自噬又可以通過影響B細胞功能來調節炎癥的程度。

作為調節性B細胞(regulatory B cells，Bregs)亞群之一的B10細胞，可產生抗炎細胞因子IL-10，其在健康的牙周組織中很少存在，但在牙周炎小鼠的牙周組織中能夠檢測到[48]。Wang等[49]發現牙齦卟啉單胞菌脂多糖可以使小鼠脾臟中富含B10細胞的 CD1dhiCD5+B細胞亞群增加，進一步過繼轉移CD1dhiCD5+B細胞能觀察到實驗性牙周炎小鼠牙齦組織中B10細胞的數量增加，進而促進IL-10的表達，抑制RANKL、TNF-α和IL-1α的表達，減緩牙周炎癥，減少牙槽骨丟失[50]。

但是在炎癥條件下機體產生的B10細胞不足以抑制疾病的進展，此時其他促炎細胞因子更占優勢。目前B10細胞主要通過過繼細胞轉移治療疾病，但是這也面臨著高成本和高耗時等問題以及全身使用可能會導致嚴重的不良事件(如細胞因子釋放綜合征)。

3.3 B細胞與骨質疏松癥

雌激素缺乏是女性絕經后骨質疏松癥的主要原因之一，其可導致B細胞表達的RANKL增加，造成骨丟失。RANKL由Tnfs11基因編碼，敲除B細胞Tnfsf11基因可以防止雌激素缺乏導致的OC增加和松質骨丟失。雌激素主要通過雌激素受體α(ERα)調節B細胞的功能[51]。ESR1是一種編碼ERα的基因，它和絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)共同參與雌激素受體信號轉導。在B細胞中，ESR1和MAPK3刺激MECP2的表達，MECP2可抑制RANKL表達。而當雌激素缺乏時，B細胞中的ESR1和MAPK3表達下調，MECP2表達降低[52]，進而導致RANKL表達增高。

雌激素缺乏還會引起B細胞數量增加：一方面，雌激素缺乏直接誘導OB產生IL-7和CXCL-12等細胞因子[53]進而促進B細胞增殖；另一方面，雌激素還能通過上調OCY表達的RANKL間接地增加B細胞數量[54]。B細胞數量增加會將更多的RANKL引入體內，從而導致異常的骨吸收。此外，雌激素缺乏還會導致B細胞分泌粒細胞集落刺激因子增加，促進OC前體細胞的增殖[55]。

3.4 B細胞與其他感染性疾病

一些細菌、病毒或者寄生蟲感染會引起異常的骨丟失，導致骨質疏松癥或病理性骨折等，與B細胞表達RANKL和OPG失衡導致OC骨吸收增強。

HIV被認為是骨質減少和骨質疏松的重要危險因素[56]。HIV感染導致的骨丟失?？蓺w因于感染引起的免疫功能障礙。在HIV感染者中，表達OPG的記憶B細胞比例降低，而表達RANKL的記憶B細胞比例增高，導致RANKL/OPG比值升高，有利于OC骨吸收[57-58]。

血吸蟲感染中，RANKL主要由CD4+T細胞和B細胞表達。RANKL表達升高和OPG表達降低與血吸蟲感染導致的骨丟失有關[59]。

4 結 語

綜上所述，骨骼系統在B細胞發育過程中起著不可或缺的作用，同時B細胞也影響著骨穩態。然而，目前關于骨髓微環境對B細胞發育的具體作用及B細胞與骨破壞性疾病的研究較為局限，更深入的機制還需進一步的探討。通過改變骨破壞性疾病中B細胞及其亞群的表達水平，調控B細胞作用于骨骼系統的相關基因和信號通路，從而調節骨穩態可能成為未來治療骨破壞性疾病的新方向。明確B細胞與骨穩態之間的相互作用，對了解骨破壞性疾病的發生發展有著重要意義，有助于為骨破壞性疾病的研究和治療提供新的思路。