巨噬細胞源性外泌體調控骨改建的研究進展

劉藝 劉奕

中國醫科大學附屬口腔醫院正畸科 沈陽 110013

巨噬細胞是人體固有免疫的主要效應細胞，參與傷口愈合和組織再生等多種生理病理過程[1-2]。外泌體是細胞在生理、病理條件下分泌的一種直徑50~150 nm的微小囊泡，因其從細胞中主動釋放的特定機制、參與細胞間相互作用及作為疾病標志物而成為熱點[3]。骨改建過程受到多種信號通路調節，現普遍認為炎癥細胞和骨細胞（成骨細胞、破骨細胞和骨細胞）之間的相互作用是骨改建的關鍵[4]。巨噬細胞與骨組織關系密切，外泌體也在骨骼疾病中起著至關重要的作用[5-6]。大量學者對不同狀態下巨噬細胞來源的外泌體功能進行了研究。闡明巨噬細胞外泌體與骨骼改建相互作用的機制有助于控制炎癥反應及干預疾病，開發新的治療策略。本文就巨噬細胞源性外泌體作用于骨改建的研究進展做一綜述。

1 巨噬細胞與骨改建

巨噬細胞起源于骨髓和卵黃囊[7-8]，是一類高度異質性的細胞。不同的刺激信號可使巨噬細胞展現出不同的表型，即巨噬細胞的極化。根據表面標記物、細胞因子和功能活性不同，極化巨噬細胞大致可分為2種亞型：經典激活或炎癥型巨噬細胞（M1） 和交替激活或抗炎癥型巨噬細胞（M2）[8]。與之相對應的未激活巨噬細胞通常標記為M0。M1型巨噬細胞通常由干擾素-γ、細菌脂多糖識別誘導[9]，產生促炎為主的細胞因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-1β，具有較強的抗微生物活性[10]。M2型巨噬細胞由IL-4、IL-10等誘導生成，產生IL-10、TGF-β等，主要吞噬碎片、抑制炎癥反應。M2巨噬細胞可進一步區分為4個亞群，即M2a、M2b、M2c、M2d[8,11]。M1、M2只是巨噬細胞極化的兩個“極端”，主導的表型改變時，其炎性細胞因子的分泌和基因表達也會發生變化?；罨木奘杉毎ㄟ^細胞間直接接觸和/或釋放分泌體（細胞因子、細胞外泌體）與各種類型的靶細胞進行通訊，以發揮其免疫調節作用。

骨改建包括了初期清除受損或老化的骨組織和后期骨形成的動態過程[12]。酶、激素、細胞因子、趨化因子等信號都可調節這一過程。巨噬細胞與骨組織細胞起源相近，共同與骨組織浸潤在骨髓微環境中，與骨組織關系非常密切。用藥物耗竭小鼠體內的巨噬細胞，截骨處骨痂及基質生成均降低[13]。作為炎癥的調節細胞，巨噬細胞參與骨愈合的全過程，并在不同階段表現出不同的極化類型，是啟動愈合級聯和正確引導骨痂形成的關鍵。許多學者[6,14-16]發現骨損傷后早期M1巨噬細胞及破骨細胞浸潤，晚期轉變為M2細胞為主。但長期的促炎反應（M1表型）對骨愈合有負面影響[17]。

2 巨噬細胞源性外泌體

細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是指細胞分泌的一種雙層脂質結構小泡，是外泌體、微囊泡和凋亡小體等結構的通稱[18]。大部分文獻采用“外泌體”（exosomes） 一詞指代囊泡結構[19]。外泌體攜帶其親本細胞的蛋白質、代謝物、核酸和脂質等內容物，具有與其親本細胞相似的作用[20-21]。它能夠通過表面標志直接與受體細胞結合，還可以通過旁分泌及膜融合（內化）的方式進入胞質[22]，將內含物從來源細胞轉移到受體細胞，進而調節受體細胞的功能。越來越多的學者提出巨噬細胞外泌體在調控炎癥或骨病進展中起著關鍵作用[5]。研究[23-25]證實，極化的巨噬細胞外泌體內容物及含量并不相同。闡明這些外泌體調控骨微環境的機制有利于針對骨炎癥性疾病的治療或干預骨改建的進程，達到動態平衡。

3 巨噬細胞源性外泌體調控骨改建

3.1 M1巨噬細胞外泌體對骨改建的作用

一般認為，M1極化的巨噬細胞促進趨化因子和炎癥介質的釋放，有助于初始破骨細胞激活、骨折部位碎片吸收[26-28]。MiRNAs是一種高度保守的非編碼小RNA分子，通過調節基因表達的轉錄后控制來實現其生物學功能，是外泌體的重要內容物之一[29]。M1及M2極化的巨噬細胞富集的mi-RNA有所不同。Kang等[24]發現，M1外泌體富含miR-155，它能夠負調控骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號級聯，特異性降低BMP2、BMP9和Runt相關轉錄因子（Runt-related transcription factor， Runx） 2 的 表 達 ， 而BMP2是成骨細胞分化必不可少的因子[12]，從而抑制骨再生。Ge等[25]則發現M1外泌體的miR-155能夠靶向抑制下游細胞因子信號轉導抑制因子6（SOCS6），提高p65 蛋白含量從而激活核因子（nuclear factor，NF）-κB信號通路，加重炎癥反應。miR-222同樣在M1型巨噬細胞中高表達[30]。研究[31]發現，M1外泌體富集的miR-222可以通過抑制Bcl-2蛋白誘導骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs） 凋亡。Yu等[32]報告M1外泌體miR-98靶向MC3T3-E1細胞中的DUSP1從而抑制成骨分化。研究[33]表明，M1-外泌體富含miR-1246，通過降低GSK3β和Axin2的表達激活Wnt途徑，導致軟骨炎癥和降解。這些miRNA大多結合生物信息學、測序等方式證實。由此可見，M1 巨噬細胞外泌體富集miR-155、miR-222、miR-98、miR-1246等，能夠作用于下游信號通路從而促進炎癥、抑制骨修復。miRNA的含量影響其對下游信號的作用，并靶向信號傳導網絡中關鍵節點，而外泌體可以作為特定的載體，這使得巨噬細胞外泌體miRNA成為一類有前景的可調控骨改建的生物標志物。然而，目前對巨噬細胞外泌體的內容物了解仍不夠透徹，關于極化對miRNA含量改變的影響以及miRNA與下游通路的作用機制仍需要進一步的探索。

NF-κB是5種轉錄因子的統稱，可在多種因素刺激下激活，是典型的促炎型號通路[34]。NF-κB通路激活后能促進IL-1β和TNF-α等細胞因子的表達，而它們既是促進巨噬細胞M1極化的分子，也是NF-κB通路的反饋激活因子[26,35]，進一步導致促炎環境。McDonald等[3]在小鼠炎癥疼痛模型中證明脂多糖刺激的巨噬細胞（即M1巨噬細胞）外泌體中檢測到豐富的細胞因子并導致NF-κB的轉錄激活，而未進行刺激的巨噬細胞（即M0巨噬細胞）不能激活NF-κB通路。Wang等[36]進一步證實脂多糖誘導的巨噬細胞外泌體激活NF-κB通路，促進細胞因子的釋放，建立局部炎癥環境。炎性細胞因子在調節骨骼破壞和成骨細胞生成方面起著重要作用。組織損傷后，損傷組織和凋亡細胞大量存在，必須清除感染后才能啟動改建過程。巨噬細胞轉化到促愈合表型，釋放細胞因子，趨化因子和其他促間充質干細胞、成骨細胞系細胞歸巢的因子促進組織修復和重新建立組織穩態。這些特征表明M1外泌體通過作用于NF-κB治療炎癥相關骨疾病和通過促進炎癥而調節骨轉換具有巨大潛力。此外，miRNA雖然不是直接的NF-κB靶點，但也可以調節NF-κB信號[29]。

許多學者對巨噬細胞外泌體如何影響BMMSCs的分化能力進行了研究。He等[37]提取M1巨噬細胞產生的條件培養基（conditioned medium，CM）進行研究，發現其促進BMMSCs增殖、成脂分化及細胞外基質的沉積。進一步提取CM中的外泌體，發現促進干細胞增殖、成骨、成脂分化的是M1外泌體而不是M2外泌體，Xia等[38]得出同樣結論。但Kang等[24]將M1極化的巨噬細胞與小鼠間充質干細胞（mesenchymal stem cells , MSCs）共培養后，MSCs的BMP2和BMP9的表達顯著降低，表明M1巨噬細胞外泌體損害了BMP-2的骨誘導作用以及MSCs的成骨誘導基因的表達。M1巨噬細胞主要通過外泌體促進早期和中期成骨，并對BMMSCs的增殖、成骨和成脂分化具有更強的作用。其對間充質細胞成骨的負性調節很可能與受體細胞來源不同有關。由于巨噬外泌體是從特殊的CM（無外泌體血清培養基與巨噬細胞共培養一段時間）中提取的，其他原因如巨噬細胞的成熟度、共培養條件、CM中其他細胞因子的影響、細胞譜系甚至技術差異都可能影響實驗結果[27,38]。BMMSCs的成骨和成脂平衡是維持骨量的關鍵。探索調節BMSSCs成骨和成脂平衡的機制可能有助于臨床疾病機制的探索及靶向藥物應用。M1外泌體對骨改建信號通路的調節如圖1所示。

圖1 M1巨噬細胞外泌體對骨改建信號通路的調節Fig 1 The regulation of M1 macrophages-derived exosomes on the signal pathway of bone remodeling

3.2 M2巨噬細胞外泌體對骨改建的作用

骨愈合的一個關鍵因素是從最初的促炎M1型巨噬細胞轉變為抗炎M2型[39]。M2型細胞在骨愈合后期建立抗炎環境，可促進BMMSCs成骨。Li等[5]認為，外泌體是M2巨噬細胞誘導成骨過程中的重要介質。

BMPs是內源性調控成骨的重要信號通路。BMP2和BMP4的丟失會導致嚴重的成骨障礙，BMP還可通過激活Smad蛋白并上調Runx2的基因表達，而Runx2是誘導間充質干細胞向成骨細胞分化的主要轉錄因子[40-41]。Kang等[24]通過體內骨缺損實驗證實M2外泌體能夠促進骨再生，進一步分析得知M2外泌體富含miR-378a，通過調節BMP信號通路促進骨誘導，導致小鼠顱骨骨再生增強。研究[42]發現，IL-4刺激的巨噬細胞（M2）外泌體富集的miR-99a-5p、miR-146b-5p或miR-378-3p都通過下調TNF-α和NF-κB信號通路來抑制炎癥。M2巨噬細胞外泌體通過miR-690、IRS-1和TAZ促進BMMSCs的成骨分化，但抑制成脂分化[5]。Yu等[43]則發現，M2外泌體富集的miR-690還可通過抑制NF-κB p65蛋白的翻譯，上調成骨分化。此外，有報道稱M2巨噬細胞來源的外泌體高表達miR-221-5p，通過與E2F2的30UTR結合負調控其表達，促進組織修復再生[44]。這些研究都表明，M2巨噬細胞外泌體浸潤在骨髓微環境中，并將miRNAs穩定地轉移到BMMSCs，有助于成骨分化和骨折愈合[45-46]。這些miRNA（miR-378a、miR-690、miR-99a-5p等）可能是成骨的靶點，并可調節BMP等通路促進成骨。然而，M2外泌體miRNA在骨形成和破骨細胞形成中的作用仍然不清楚[47]。

越來越多的證據表明，BMMSCs和M2巨噬細胞外信號的相互作用參與了骨的形成。但由于細胞來源不同、共培養條件不同以及巨噬細胞的狀態不同，這種相互作用的機制和細節仍然存在爭議。有學者[48]提出，M0或M2巨噬細胞產生的CM在成骨的后期階段有利于BMMSCs的礦化。但是也有學者得出了相反結論。Xia等[38]的研究得出，M2巨噬細胞外泌體損害了BMMSCs的增殖。M2外泌體對BMMSCs的成骨、成脂相關基因的表達沒有明顯影響，甚至對軟骨分化有抑制作用。M2外泌體對骨改建信號通路的調節如圖2所示。

圖2 M2外泌體對骨改建信號通路的調節Fig 2 The regulation of M2 macrophages-derived exosomes on the signal pathway of bone remodeling

4 結語

巨噬細胞是先天免疫系統的關鍵介質，巨噬細胞源性外泌體可發揮促炎、促進早期成骨或抗炎、促進骨修復的作用。M1和M2亞型巨噬細胞外泌體對骨改建的作用不同或相反，這大部分取決于其各自高表達的miRNA與下游信號通路的作用，但與它們的來源細胞功能一致。二者對NF-κB通路的調節尤其相反，M1巨噬細胞外泌體富集的miR-155能夠直接靶向下游SOSC6，減少其對細胞p65蛋白的降解和泛素化，從而提高p65含量，促進NF-κB通路和介導炎癥。而M2巨噬細胞外泌體通過其富集的miR-690直接抑制p65蛋白的翻譯過程，減少其含量而抑制NF-κB通路。

良好控制的炎癥反應可能有益于骨修復，但當炎癥反應過度，可能會對骨組織造成破壞[49-50]。巨噬細胞外泌體為納米級結構的流體（懸液），在無細胞治療的發展中有著廣闊的前景，由于它可將蛋白質、miRNA等轉運到受體細胞，針對極化巨噬細胞的外泌體治療可能成為炎癥性骨病或調節炎癥反應的治療方式。外泌體與微環境之間相互作用的機制、外泌體與生物材料的整合都是值得探討的問題。今后的工作中，有必要將巨噬細胞外泌體應用于動物，進一步驗證對骨改建的效果、機制和治療劑量。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。