CD19蛋白結構、功能及其工程化改造的研究進展

孫瑞雪,米 薇,葉子弘

(1.中國計量大學 生命科學學院,浙江 杭州 310018;2.中國計量科學研究院,北京 100029)

CD19蛋白是B細胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白,其相對分子質量為95 ku,屬于免疫球蛋白超家族成員(IgSF),具有單一的跨膜區、胞內C末端和胞外N末端,是淋巴瘤B細胞以及濾泡樹突狀細胞的生物標記物,在其他譜系或其他組織中不表達或低表達,因此它是包括急性淋巴細胞白血病和淋巴瘤在內的B細胞惡性腫瘤的最佳靶點[1,2]。CD19在B細胞反應調節因子中發揮正向調節作用,參與B細胞抗原受體(B-cell receptor,BCR)識別抗原的過程,同時還在維持體液及抗原誘導的免疫反應和耐受誘導之間的平衡方面起著關鍵作用[3-5]。CD19是成熟B細胞表面多分子復合物的重要成員,與補體受體CD21、CD81和CD225共同發揮作用[6]。該復合物通過調節內源性和受體誘導的信號可降低BCR介導的B細胞激活閾值。CD19與BCR相結合可促進細胞內鈣釋放和細胞增殖,觸發下游Akt-PI3K和MAPKs信號通路[7]。CD19的表達量在B細胞的發育過程中起著至關重要的作用[8],其表達異常往往會影響各種細胞以及疾病的發生[9]。

CD19是目前CAR-T細胞治療的主要靶點,然而CD19-ECD容易錯誤折疊和聚集[10,11],導致蛋白難以表達,該特性對體外和體內定量評估CAR-T細胞的功能造成了嚴重的阻礙,因此需要對CD19蛋白進行結構改造,以提高CD19蛋白的穩定性和表達水平。此外,對CD19蛋白結構和功能進行深入研究,有助于研發和優化改造CD19相關藥物。無論抗體還是CAR-T產品,都需要以CD19蛋白的結構為基礎展開,這有利于藥物的早期研發以及后續的優化改造。本文首先介紹了CD19蛋白的結構特征,而后闡述了臨床上基因自然突變與疾病的關系,最后總結了近年來國內外為提高工程化CD19-ECD的穩定性和表達水平的各種策略,從而為臨床上檢測或激活CAR-T細胞提供參考。

1 CD19蛋白的結構特征

1.1 CD19蛋白的一級結構

CD19蛋白由位于16號染色體16p11.2短臂上的CD19基因編碼,該基因共由15個外顯子組成,4個編碼細胞外結構域,9個編碼細胞質結構域。CD19分子包含556個氨基酸殘基,信號肽由前19位氨基酸組成,具有兩個C2組Ig樣的細胞外結構域由20—294位的氨基酸組成,其中第一個Ig樣環對于CD19的正確3D折疊及最終運輸到質膜是至關重要的?？缒び蛴?3個氨基酸組成,高度保守的細胞質結構域由240個氨基酸組成。CD19的細胞質結構域含有19%的酸性氨基酸殘基和10%的堿性氨基酸殘基,部分區域具有較強的凈負電荷。在C末端附近的9個酪氨酸殘基,對BCR的信號起到傳導作用[12,13]。部分酪氨酸殘基在與BCR連接后,會被迅速磷酸化,以產生功能活躍的Src同源結構域2識別基序,介導調節分子向細胞表面募集[14]。除了參與BCR信號調節外,CD19還參與人類皰疹病毒和甲型病毒性肝炎的感染[15]。細胞質結構域中的三個酪氨酸殘基Y391,Y482和Y513已被證明對CD19的生物學功能至關重要[16]。CD19獨特的胞外區與含有多個酪氨酸磷酸化位點的胞質尾部結合,構成了理想的信號調節劑。值得注意的是,苯丙氨酸取代Y482和Y513上兩個位置的酪氨酸,會抑制其他七種酪氨酸的磷酸化[3]。

1.2 CD19蛋白的二級結構

俞小娟等[15]使用ProtParam tool軟件分析了CD19蛋白的穩定性,結果顯示該蛋白在體外不穩定。再通過SOPM預測了全長CD19蛋白的高級結構,各組分所占比例從高到低依次為無規則卷曲,α-螺旋,β-轉角。近年來,Teplyakov等[17]使用X-射線晶體學方法解析了CD19胞外區與抗CD19單抗B43復合物的結構。結果顯示胞外域含有2種類型的二級結構,一種是β-折疊片,另一種是無規則卷曲,由6鏈β-折疊和10鏈β-折疊組成了一個夾心結構。環由二硫鍵Cys134-Cys173連接,另外兩個二硫鍵Cys38-Cys261和Cys97-Cys200分別從與β-夾心相對的β-折疊片連接鏈B-R和G-M[18]。CD19蛋白的晶體結構顯示了基于兩個Ig折疊互換排列的獨特分子拓撲結構,這與人們普遍接受的兩個串聯Ig樣結構域形成鮮明對比[19,20]。該晶體結構有助于研究CD19與其他信號復合體的相互作用。

Susa等[21]使用冷凍電鏡法解析了CD81與CD19共受體復合物與考妥昔單抗結合的結構,其中CD19由全長的胞外域和跨膜域組成。結果表明胞外域主要由無規卷曲組成,跨膜域為含有15個氨基酸殘基的α-螺旋結構。該研究揭示了CD19與CD81共受體復合物組合的結構基礎,這有助于合理設計B細胞功能障礙藥物,還揭示了目前抗體選擇策略主要集中在一個CD19胞外區表位上[22,23]。Jumper等[24,25]使用AlphaFold蛋白結構數據庫對CD19蛋白的高級結構進行了預測,預測結構如圖1,(https://www.alphafold.ebi.ac.uk/entry/P15391)。圖中不同的顏色表示預測結果的準確性,準確性從高到低依次是深藍色、淺藍色、黃色和紅色。預測的高級結構主要為無規則卷曲,α-螺旋,β-折疊。其中跨膜結構域與實驗所得結果一致,含1個α-螺旋結構。胞外域包括多組通過loop環相連的β-折疊片,其環狀區域是抗原結合表位,如包含兩個賴氨酸和兩個組氨酸的環216—224,所帶的正電荷會與帶負電荷的相關抗體產生靜電相互作用。由于環是表位的中心元件,若基因插入將破壞大多數抗原抗體的相互作用,提示研究者們在體外重組表達CD19蛋白時,應重點關注該蛋白的環狀區域。

圖1 CD19高級結構預測

1.3 CD19蛋白的糖基化修飾

UniProt數據庫中有5個已報道的N糖基化位點,分別為86、125、138、181和265。多項研究發現,PNGase-F糖苷酶會使CD19蛋白的相對分子質量減小,這表明CD19蛋白的N-端連接了一些聚糖分子。Lobner等[26]用PNGase-F糖苷酶處理CD19胞外區融合蛋白,該融合蛋白切糖前相對分子質量為60～65 ku,切糖后相對分子質量減少了15 ku,該結果表明CD19蛋白存在糖基化修飾。Heard等[27]用兩種糖苷酶處理CD19,其中Endo H糖苷酶只切割內質網中添加的核心(甘露糖)殘基,而PNGase-F糖苷酶切割添加在高爾基體中的支鏈聚糖。結果顯示PNGase-F處理導致CD19分子量顯著減少,Endo H未顯示分子量變化,這表明分子量的相對增加的原因是高爾基體上的糖基化。Laurent等[28]通過SDS-PAGE對CD19-ECD進行了分子量測定,預期總分子質量為44 ku,結果顯示條帶位于60 ku左右,5個潛在的N糖基化位點,每個貢獻2～3 ku。X-射線晶體學方法發現Asn86和Asn125上的兩個位點是糖基化的,Asn181和Asn265位于完全或部分無序的環中,因此它們的糖基化狀態未知,其中一個位點被N138Q突變敲除[17]。

2 CD19突變與疾病

臨床研究發現,CD19在免疫細胞中發揮著重要的功能,CD19基因突變會使B細胞受體信號缺陷,從而導致抗體缺乏綜合征。Reisli等[29]發現CD19基因突變的患者會患上共同變異性免疫缺陷病,該疾病的特征是反復和嚴重感染,這突顯了CD19在免疫細胞功能中的重要性。Menno等[30]對一名抗體缺陷綜合癥患者的CD19序列進行分析后,發現純合錯義突變導致色氨酸變為半胱氨酸(W52C),受影響的色氨酸位于CD19第一個胞外IgSF結構域的C鏈上,并被發現高度保守,該研究證明了高度保守的色氨酸在IgSF結構域的正確折疊或穩定性中的關鍵作用。由此可見,臨床上CD19基因突變會使蛋白異常折疊和表達異常,從而導致該蛋白穩定性降低,喪失蛋白原有的生物學功能,提示人們在體外重組表達該蛋白時應關注此保守氨基酸殘基,進行殘基取代時不能對其活性和功能性產生不利影響。

CD19蛋白的糖基化也會影響它在體內的功能,研究表明翻譯后修飾是CD19靶向CAR-T細胞有效性的重要調節因素。Heard等[27]研究發現CD19的N125位低糖基化會導致蛋白表達缺失,這嚴重損害了CAR-T細胞抗白血病的療效。此外,CD19的N125位高糖基化會阻止CAR-T的活性,從而使CAR-T治療產生耐藥性,阻止N125的高糖基化會增強與FMC63抗體的結合。因此,CD19蛋白的糖基化與CAR-T治療的效果密切相關,提示人們在體外開發CD19類蛋白探針時,需重點關注和嚴密監控它的糖基化,以獲得滿足臨床CAR-T檢測需求的探針。

3 針對CD19 CAR-T檢測與激活的CD19蛋白工程的策略

3.1 蛋白質工程提高CD19穩定性

CD19-ECD容易錯誤折疊和聚集,這是CD19相關藥物開發的主要障礙。由于蛋白質中單個或多個氨基酸突變,會導致蛋白質穩定性的改變。因此可通過氨基酸突變對CD19蛋白進行結構改造以提高其穩定性。研究表明,對CD19-ECD進行氨基酸突變,可以提高該蛋白的穩定性,并增強相關抗體的結合,改造后的蛋白在臨床治療中能發揮更大作用,并且推動了以CD19為靶向的細胞療法的發展。截至目前,研究者們對于CD19-ECD工程化改造的研究較少,2019年,Klesmith等[31]通過基因突變得到了一個名為CD19.1ECD的特定改進突變體,與野生型相比有26個突變,突變后的CD19蛋白在熱穩定性方面有了適度的改善,與FMC63和酵母表面的CD19抗體4G7的結合均有了很大的改善。Klesmith等[32]使用高通量篩選策略全面繪制了CD19 ECD變異體CD19.1與臨床抗體結合的序列-功能圖譜,為CD19靶向治療提供了有價值的結構見解,提高了人們對CD19序列-功能關系的理解,并強調了深度測序在輔助蛋白工程方面的應用。2020年,Robb等[33]針對CD19胞外區構建了一系列突變體,每個突變體至少含1個氨基酸突變,突變后的CD19蛋白熱穩定性水平均顯著提高,對蛋白酶裂解更具有抗性,與抗體的親和力增強。

CD19靶向免疫治療的發展和監測的主要限制是缺乏穩定的,特別是單體CD19-ECD蛋白。解決CAR-T細胞檢測問題的最好方案是產生一種穩定且易于使用的抗原,它能與CAR分子特異性地相互作用。近年有研究發現,對CD19-ECD進行基因突變,不僅能夠提高該蛋白的穩定性,且突變體能夠檢測CAR-T細胞,這種分子改造解決了CAR-T細胞檢測的難題。2021年,Laurent等[28]構建了一個名為SF05的CD19突變體,該突變體基本上保留了野生型序列,表現出了更好的折疊性能,且能以單體的形式進行純化,提高了酵母表達水平和熱穩定性。此外,它能夠監測和表征淋巴瘤患者血液中CD19靶向的CAR-T細胞表型,非常適合體內檢測和跟蹤CD19 CAR-T細胞,并與其他標記相結合,確定其分化和激活狀態。Delaney等[34]構建了一個名為gmCD19的糖突變試劑,改造的突變體為N138Q,突變后的CD19蛋白穩定性顯著提高,可與CAR結構中CD19靶向的單鏈抗體結合,能夠準確檢測低至0.25%的CAR-T細胞。2022年,趙云等[35]構建了一個可用于CAR-T細胞高效檢測的CD19突變體,突變后的CD19蛋白檢測CAR-T細胞的靈敏度顯著提高,能夠更準確地判定CAR-T細胞陽性率,與單鏈抗體的親和力和野生型CD19相比顯著增強。近年來,通過蛋白質工程策略提高CD19蛋白穩定性的研究結果如表1。

表1 基因突變提高CD19蛋白穩定性

3.2 構建CD19融合蛋白可改善CD19表達水平并激活和擴增CAR-T細胞

CD19-ECD是一種“難以表達”的蛋白質,該特性在靶向CD19免疫療法的發展和機制分析方面造成了嚴重的障礙。為了克服與蛋白質表達困難相關的瓶頸,研究者們通過不同的策略產生了可溶性和有活性的蛋白質,以促進靶向CD19免疫療法的發展。

研究發現,構建CD19融合蛋白不僅可產生穩定和產量高的蛋白質,還可用于激活和檢測CAR-T細胞。例如Lobner等[26]將CD19-ECD C端與人血清白蛋白(HSA)的結構域2(AD2)融合后,顯著提高了蛋白質的表達產量。表達和純化的可溶性CD19-AD2融合蛋白以單體形式存在,高度穩定,天然折疊,最后通過對CD19 CAR-T細胞的有效刺激和突觸形成證實了CD19-AD2的結構完整性和生物活性。De Oliveira等[36]最初將CD19胞外區基因的外顯子1-3(CD19sIg1-3)或外顯子1-4(CD19sIg1-4)與人IgG1Fc片段融合,發現融合到Fc結構域的CD19胞外區具有增強的溶解性和穩定性。且只有CD19sIg1-4融合蛋白能夠與FMC63抗體特異性相互作用,該融合蛋白能夠檢測到低至0.5%的CAR-T細胞,可作為檢測抗CD19 CAR-T的靈敏試劑。

眾所周知,獲得足夠的CAR-T細胞是免疫治療成功的關鍵,構建CD19融合蛋白不僅能改善CD19的表達,還可激活和擴增CAR-T細胞,因此這種結構改造能提供更好的治療。Lian等[37]構建了一種可溶性的sCD19-SA融合蛋白,它由CD19-ECD和SA(Streptavidin,SA)的核心區組成,該融合蛋白可用于CAR-T細胞表達的功能檢測和選擇性擴增,且具有很強的激活抗CD19 CAR-T的能力。Ambrose等[38]將CD19-ECD和抗HER2抗體組成一個融合蛋白,構建的CD19融合蛋白有利于正常B細胞上CD19的表達,從而使CD19成為一個容易獲得的抗原。此外,該融合蛋白可介導CD19 CAR-T細胞的激活,以允許擴增與免疫相關的CAR-T細胞,并增強持久性。CD19融合蛋白改善CD19表達水平及臨床應用的研究結果如表2。

表2 CD19融合蛋白改善CD19表達水平及臨床應用

4 總結與展望

CD19蛋白是體內重要的細胞因子,它與BCR相連接可協同增強細胞內鈣釋放、有絲分裂原激活蛋白激酶的活性和細胞增殖,CD19突變或異常表達會導致B細胞相關疾病的發生。CD19-ECD容易錯誤折疊和聚集,導致蛋白難以表達,這是CD19相關藥物開發的主要障礙。參考CD19結構和功能的關系對其進行工程化改造,如:通過CD19基因突變不僅可以改善折疊性能還能提高穩定性;另外,通過構建融合蛋白可改善CD19蛋白探針的功能。穩定的CD19-ECD蛋白探針是監測治療患者CAR-T細胞的完美工具;構建融合蛋白可改善蛋白的表達水平并激活和擴增CAR-T細胞。CD19結構和功能的深入研究有助于進一步了解相關疾病的機制,并為CD19蛋白工程化改造提供指導,幫助解決CD19 CAR-T應用中遇到的檢測、激活和擴增等瓶頸問題。