葶丹黃復方對異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚大鼠ERK1/2信號磷酸化的影響

尹 寶 譚向宇 呂志達 劉琛琛 安 炎 姜曉桐

(1 淄博市中醫醫院 山東 淄博 255300 2 齊魯醫藥學院 山東 淄博 255300)

心肌肥厚是心衰、冠心病、心律失常等諸多心血管疾病的獨立危險因素[1]。心肌肥厚在細胞水平上表現為心肌細胞肥大、蛋白質合成增加和胚胎基因激活[2]。ERK1/2是絲裂酶原激活蛋白激酶(MAPK)的主要成員之一，ERK1/2被激活后入核并使Elk-1、c-fos、p53、GATA4等轉錄因子磷酸化，進而調控相關基因的表達促進心肌細胞生長和繁殖[3]，可導致心室出現明顯的向心性肥厚[4]。本研究擬基于ERK1/2信號通路探討葶丹黃復方的抗心肌肥厚作用及其機制。

1 材料和方法

1.1實驗藥物

葶丹黃復方(葶藶子20 g、酒丹參15 g、生黃芪30 g、法半夏10 g、陳皮10 g、茯苓10 g、炙甘草3 g)由淄博市中醫醫院科研中心提供，經稱重、浸泡、煎煮3次，濃縮至1.029 g/ml(含生藥)?？ㄍ衅绽徸陨綎|魯抗醫藥集團賽特有限責任公司。

1.2動物

雄性SD大鼠，SPF級，體重200-250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK (湘) 2013-0004，飼養于齊魯醫藥學院重點實驗室實驗動物中心。

1.3試劑

異丙腎上腺素(貨號：I5627-5G)購自美國Sigma-Aldrich公司，HE染色試劑盒(貨號：G1120)購自北京索萊寶科技有限公司，BCA蛋白定量檢測試劑盒(貨號：PA115-02) 購自北京天根生化科技有限公司，Phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)抗體(貨號：4370S)、p44/42 MAPK (Erk1/2)抗體(貨號：9102S)、β-Tubulin (貨號：2128S) 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.4方法

36只雄性SD大鼠隨機分為6組：正常組、模型組、葶丹黃復方(5.15 g/kg、10.29 g/kg、20.58 g/kg)和卡托普利組(0.02 g/kg)，每組6只。各組(除正常組)大鼠背部皮下注射異丙腎上腺素1 mg/kg，每日1次，連續10 d；正常組大鼠背部皮下注射等劑量的生理鹽水。自由進食，飲水。于造模次日，各治療組開始給予相應藥物灌胃，連續14 d。給藥量按照《藥理實驗方法學》[5]所示體表面積劑量換算法計算，葶丹黃復方和卡托普利分別給予成年人0.5倍、1倍、2倍和1倍的等效劑量，正常組、模型組灌胃以相同體積的生理鹽水。

1.4.1心臟重量指數的測定

末次給藥后禁食、不禁水12 h，稱重，10%水合氯醛麻醉(0.35 ml/100 g, i.p.)，腹主動脈采血后取心臟，生理鹽水洗凈，冰上去除心房組織、分離左右心室，濾紙吸干后，稱量左心室重、全心重。計算左心室重量指數(LVMI) = 左心室重量(mg)/體重(g)，全心重量指數(HMI) = 全心重量(mg)/體重(g)。

1.4.2心肌細胞表面積的測定

4%多聚甲醛固定左室心肌組織，經脫水、浸蠟、包埋、切片(4 μm)后，按照HE染色試劑盒說明書行HE染色。400倍光鏡視野下觀察心肌細胞形態并拍照，每張切片隨機采取三個視野。用Image-Pro Plus 6.0軟件測量圖片中心肌細胞的表面積，每張切片隨機測量30個心肌細胞。

1.4.3 Western blot檢測Phospho-ERK1/2(p-ERK1/2)、ERK1/2蛋白表達

嚴格按照BCA蛋白定量試劑盒說明書定量分裝50 μg心肌組織蛋白樣本。上述樣本經10%分離膠電泳后轉膜、封閉。孵以p-ERK1/2、ERK1/2抗體后行化學發光。β-Tubulin抗體作為內參使用。

1.4.4實時熒光定量 RT-PCR檢測ANP、BNP mRNA表達

用TRIzol提取心肌組織中2 μg RNA樣本，按照試劑盒說明書操作，將RNA樣本反轉錄成cDNA，之后行RT-PCR檢測。相關引物如下：ANP(產物369 bp)：上游：5’- GATCTGATGGATTTCAAGAACCTG -3’，下游：5’- CAGATTTGGCTGTTATCTTCGGT -3’；BNP(產物252 bp)：上游：5’- AACAATCCACGATGCAGAAGC -3’，下游：5’- ACAACCTCAGCCCGTCACAG -3’；GAPDH(產物96 bp)：上游：5'- GTGAAGGTCGGAGTCAACG -3'，下游：5'- GGTGAAGACGCCAGTGGACTC -3'。

1.4.5統計學分析

2 結果

2.1 葶丹黃復方對大鼠心臟重量指數的影響

表1 葶丹黃復方對大鼠心臟重量指數的影響

2.2 葶丹黃復方對大鼠心肌細胞表面積的影響

圖1 葶丹黃復方對大鼠心肌細胞形態學的影響(×400)

圖2 葶丹黃復方對大鼠心肌細胞表面積的影響

2.3 葶丹黃復方對大鼠ERK1/2信號磷酸化水平的影響

圖3 葶丹黃復方對p- ERK1/2、ERK1/2、β-Tubulin

圖4 葶丹黃復方對ERK1/2信號磷酸化水平的影響

2.4 葶丹黃復方對大鼠胚胎基因ANP、BNP mRNA表達的影響

圖5 葶丹黃復方對大鼠胚胎基因ANP、BNP mRNA表達的影響

3 討論

心肌肥厚是諸多心血管疾病的獨立危險因素[1]，在細胞水平上表現為心肌細胞肥大、蛋白質合成增加和胚胎基因激活[2]。高血壓是導致心肌肥厚的主要疾病[6]，長期外周血壓升高會導致心肌代償性肥厚，最終導致心力衰竭的發生[7]。本研究結果顯示：與正常組比較，模型組的LVMI、HMI、心肌細胞表面積均明顯升高，差異均具有顯著性(P < 0.05)。提示異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚動物模型造模成功、模型組大鼠已形成心肌肥厚。與模型組比較，葶丹黃復方組(5.15 g/kg、10.29 g/kg、20.58 g/kg)和卡托普利組的上述各項指標均有不同程度的降低，葶丹黃復方組10.29 g/kg組的上述各項指標始終存在顯著性差異(P < 0.05)。該研究結果提示葶丹黃復方具有有效的抗心肌肥厚作用，且效果優于卡托普利。

有絲分裂蛋白激酶信號通路(MAPKs)是心肌肥厚的經典信號通路[8]，ERK1/2信號轉導通路與壓力超負荷性心肌肥厚的形成密切相關[3]。本研究結果顯示：與正常組比較，模型組的p-ERK1/2 / ERK1/2比率以及ANP、BNP mRNA水平均明顯升高，差異均具有顯著性(P < 0.01)。與模型組比較，葶丹黃復方組(5.15 g/kg、10.29 g/kg、20.58 g/kg)的上述各項指標均有不同程度的降低，葶丹黃復方組10.29 g/kg組的上述各項指標始終存在顯著性差異(P < 0.05)。該實驗結果提示：葶丹黃復方可以抑制ERK1/2的磷酸化，下調胚胎基因ANP、BNP mRNA的表達。

以此推斷，葶丹黃復方可能通過調控MAPK信號轉導通路、抑制ERK1/2的磷酸化，進而下調胚胎基因ANP、BNP mRNA的表達，最終實現其抗異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌肥厚作用。