細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白2A 與腎細胞癌患者臨床及預后指標相關性研究

郭海鋒，羅小冬，姜 力，吳佳成，郭 猛

1.南通大學附屬腫瘤醫院 南通市腫瘤醫院 泌尿科，江蘇 南通 226361 ；北部戰區總醫院2.兒外科；3.心內科，遼寧 沈陽 110016

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是常見的泌尿系統致死性疾病，是起源于腎實質泌尿小管上皮系統的腎惡性腫瘤［1］。全球腎癌發病人數呈現逐年上升的趨勢，預計至2030 年發病人數將達到52.0 萬人［2］。RCC 的組織類型包括透明細胞型、乳頭狀細胞癌及嫌色細胞癌［3］。約65%的RCC 患者表現為局限性腫瘤，其余患者表現為轉移性RCC，通過手術切除無法治愈，常需要配合全身治療［4］。RCC 早期或局部病變手術治愈率超過90%，局部晚期RCC 患者的5 年存活率為40%～60%［5］。因此，研究RCC 發生和進展相關的生物標志物對治療RCC 尤為重要。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）參與不同腫瘤的增殖、轉移［6］。而CDKN2A 在RCC中的作用相對研究較少。有研究表明，CDKN2A 是銅死亡相關基因之一［7］。銅死亡相關基因通過銅與三羧酸循環的脂?；煞种苯咏Y合，導致脂?；鞍椎漠惓＞奂丸F硫簇蛋白的丟失，從而導致蛋白毒性應激而導致細胞死亡［8-9］。而CDKN2A 作為具有雙重身份的特殊基因，其在腫瘤中發揮的具體作用還需要進一步的探索。本研究旨在探討CDKN2A的表達及其在預測RCC 患者存活率中的作用?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 通過TCGA 數據庫下載531 個RCC 患者的臨床參數，包括患者的年齡、性別、TNM分期、病理分級、總體生存期（overall survival，OS）、疾病特異性生存期（disease specific survival，DSS）和無進展間隔期（progression free interval，PFI）等參數，進行數據分析。

1.2 研究方法 下載RCC 患者的臨床參數CDKN2A和這些臨床參數以及預后之間的相關性。構建列線圖預測RCC 患者1、3 和 5 年存活率。筆者通過TIMER 數據庫構建棒棒圖展示在RCC 中CDKN2A表達和各免疫細胞之間的相關性。使用Metascape在線進行功能分析。將差異基因添加到Metascape中進行功能分析?？紤]到轉移復發的RCC 對于對放化療不敏感，后期治療首選靶向治療為基礎的綜合治療，將CDKN2A 與靶向藥物的靶點分子進行相關性研究。

1.3 統計學方法 采用軟件R（3.6.3 版本）進行統計分析。R 包：GEOquery 包（2.54.1 版本）進行數據下載，limma 包（3.42.2 版本）進行差異分析［10-11］。通過基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）探討CDKN2A 可能作用的細胞機制。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RCC 組織中CDKN2A 表達升高 在RCC 腫瘤組織中，CDKN2A 的表達升高。構建受試者工作特征曲線，曲線下面積為0.991，提示CDKN2A 具有很好的預測效果。見圖1。

圖1 RCC組織中CDKN2A表達降低（a.CDKN2A在RCC非配對組織中的表達情況；b.CDKN2A在RCC配對組織中的表達情況；c.受試者工作特征曲線）

2.2 CDKN2A 與RCC 臨床資料的關系 較高的TNM 分期、病理分期、組織學分級的RCC 患者中CDKN2A 的表達更高。見圖2。

圖2 CDKN2A分子與RCC患者的臨床資料的相關性

2.3 CDKN2A 與RCC 預后相關性 CDKN2A 低表達的RCC 患者OS、DSS、PFI 優于CDKN2A 高表達的患者，即CDKN2A 低表達的RCC 患者的預后明顯優于CDKN2A 高表達患者。見圖3。

圖3 TCGA數據庫中CDKN2A與RCC患者預后情況（a.CDKN2A低表達RCC患者OS；b.CDKN2A低表達RCC患者DSS；c.CDKN2A低表達RCC患者PFI；d.T1的RCC患者中，CDKN2A低表達患者預后情況；e.M0的RCC患者中，CDKN2A低表達患者預后情況；f.年齡≤60歲的RCC患者中，CDKN2A低表達患者預后情況）

2.4 列線圖個性化預測RCC 患者1、3 和 5 年的存活率 筆者基于多變量分析的結果構建列線圖，列線圖預測RCC 患者1、3 和 5 年的存活率的C-指數為0.749（0.721～0.776）。校準圖中的偏差校正線接近理想曲線，表明預測值和觀察值之間具有良好的一致性。見圖4。

圖4 列線圖預測RCC患者存活率及校準圖（a.列線圖預測RCC患者1、3、5年OS率；b.預測OS率列線圖的校準圖）

2.5 CDKN2A 與免疫細胞相關性 筆者通過TIMER 數據庫構建棒棒圖展示在RCC 中CDKN2A表達和各免疫細胞之間的相關性。CDKN2A 的表達與大部分浸潤性免疫細胞之間呈顯著相關性，進一步分析發現CDKN2A 表達與免疫檢查點相關分子細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA-4），表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274，CD274）、細胞程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PDCD1）都具有較好的相關性。見圖5。

圖5 CDKN2A與免疫細胞相關性（a.CDKN2A與TIMER數據庫中免疫細胞的浸潤程度的相關性；b.CDKN2A表達與RCC中的免疫細胞浸潤顯著相關；c.CDKN2A表達與CTLA-4相關性散點圖；d.CDKN2A表達與CD274相關性散點圖；e. CDKN2A表達與PDCD1相關性散點圖）

2.6 CDKN2A 的共表達基因分析 根據TCGA 數據庫的數據識別與CDKN2A 共表達的正相關或負相關的基因各50 個。見圖6。

圖6 CDKN2A的共表達基因分析（a.RCC中與CDKN2A正相關的前50個基因；b.RCC中與CDKN2A負相關的前50個基因）

2.7 CDKN2A 與分子靶向治療藥物靶點分子之間的相關性 分析CDKN2A 與分子靶向治療藥物靶點分子之間的相關性發現，CDKN2A 與KIT，MET，TEK和血管內皮生長因子B 都有較好的相關性。見圖7。

圖7 CDKN2A與分子靶向治療藥物靶點分子之間相關性（a.MET；b.TEK；c. 血管內皮生長因子B；d.KIT）

2.8 基于GSEA 信號通路預測 筆者使用Metascape在線進行KEGG 功能分析，發現CDKN2A 可能通過參與影響細胞周期，調節p53，銅離子穩態，腫瘤衰老和細胞毒性這些方面來影響RCC 的生物學事件，從而導致RCC 的不同預后。

3 討論

腎癌在我國屬低發瘤種，但人口基數大，發病數較多［12］。因此，闡明RCC 發生發展的機制，以發現重要的生物標志物并制定新的治療策略具有重要意義。

近年來，測序和組學技術的發展為進一步了解RCC 的機制和探索診斷和治療靶點提供更多機會［13］。在TCGA 數據庫中，筆者發現CDKN2A 在RCC 中表達升高，而且CDKN2A 低表達的RCC 患者的較CDKN2A高表達的患者有更好的預后。TIMER 數據庫的數據分析結果及與免疫檢查點相關分子CTLA-4，CD274、和PDCD1 都具有較好的相關性，表明CDKN2A 的表達可能與免疫浸潤顯著相關。本研究結果顯示，CDKN2A 與KIT，MET，TEK 和血管內皮生長因子B 都具有較好的相關性，對于靶向藥物的選擇可以提供更好參考性。Ⅲ期臨床JAVELIN Renal 101 臨床試驗證實，對于進展期RCC 患者，Avelumab 聯合Axitinib（聯合組A+Ax）比Sunitinib（靶向組S）具有更好的無疾病進展生存期和客觀緩解率［14-15］。本研究結果顯示，CDKN2A 與RCC 的免疫浸潤及靶點分子相關。

筆者基于GSEA 富集進行信號通路的預測，發現CDKN2A 可能通過參與影響細胞周期，調節p53，銅離子穩態，腫瘤衰老和細胞毒性這些方面來影響RCC 的生物學事件，從而導致RCC 的不同預后。筆者研究的分子CDKN2A 屬于銅死亡相關基因，在TCA 循環中蛋白質脂?；^程中發揮上游調節作用［16］。既往研究表明，CDKN2A 通過 LDHA 介導的AKT/mTOR 通路抑制宮頸癌的細胞增殖和侵襲［17］；前蛋白轉化酶的抑制削弱p53、CDKN2A 和N-Ras 基因改變對人原發性黑素瘤細胞的侵襲性［18］。筆者推測，CDKN2A 通過TP53 調節參與RCC 的周期阻滯，從而導致RCC 患者的不同預后。

綜上所述，CDKN2A 的表達降低可以顯著延長RCC 患者的OS，PFI 和DSS，可以用作RCC 的新型預測性生物標志物，同時,可能與RCC 的免疫浸潤相關，并在RCC 微環境中對于腫瘤細胞發生免疫逃逸可能起著重要的促進作用。干擾CDKN2A 可能通過參與TP53 調節RCC 的周期阻滯，從而改善RCC的預后。這些發現為RCC 抗癌策略的開發提出一個潛在的靶點。