離線和在線固相萃取-液相色譜-質譜法測定污水中5種芬太尼類物質及其代謝物

張婷婷， 黃 鈺， 丁 艷， 陳 捷， 花鎮東

(公安部禁毒情報技術中心,毒品監測管控與禁毒關鍵技術公安部重點實驗室，北京 100193)

近年來，合成阿片類物質在世界范圍內的濫用呈顯著上升趨勢[1,2]，與嗎啡、海洛因等天然和半合成阿片類物質相比，該類物質不依賴植物種植，制造更為容易，品種層出不窮，為此國際麻醉品管制局已專門設立OPIOIDS Project項目[3]，對其生產和分銷情況進行監測。芬太尼類物質是合成阿片類物質中的一個重要類別，作為強效麻醉鎮痛劑在醫療中發揮重要作用的同時，也出現了嚴重的濫用情況，特別是在阿片類物質成癮人群比例較高的北美地區[4,5]，已成為藥物濫用致死的主要因素。為預防該類物質可能產生的社會危害，我國已于2019年5月1日起將芬太尼類物質整類列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄》。

由于吸毒行為的隱蔽性，毒品濫用監測一直是禁毒工作的重點和難點問題。近期逐步發展起來的基于污水流行病學原理的毒情監測技術具有客觀、定量、實時、快速和簡便等優點，我國[6]及歐洲[7 - 9]、加拿大[10]、澳大利亞[11,12]等國家和地區已廣泛采用該方法監測可卡因、大麻、海洛因、冰毒、搖頭丸和氯胺酮等常見毒品的濫用情況。然而，芬太尼及其類似物作為新近流行的毒品，污水中相關原體及代謝物的檢測方法尚未建立，限制污水檢測技術在其濫用情況監測中的應用。為此，本研究以芬太尼類物質中最為常見的芬太尼(Fentanyl)和乙酰芬太尼(Acetyl fentanyl)為對象，建立了污水中2種物質原型及3種主要代謝物去苯乙基芬太尼(Norfentanyl)、去苯乙基乙酰芬太尼(Acetyl norfentanyl)和4-苯胺基-N-苯乙基哌啶(4-ANPP)的離線和在線固相萃取檢測方法(化學結構見圖1)，并將其用于全國大型城市生活污水樣品的檢測，為了解芬太尼類物質的實際濫用情況提供了新的思路和手段。

圖1 5種目標化合物化學結構圖Fig.1 Chemical structures of five target compounds

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀(ACQUITY UPLC，Waters，美國；Triple QuadTM6500，SCIEX，美國)；配備在線固相萃取AOE模塊的超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀(LCMS-8050，SHIMADZU，日本)；全自動固相萃取儀(SPE-432，北京普立泰科儀器有限公司)；真空離心濃縮儀(CV200，北京吉艾姆科技有限公司)；超純水裝置(Milli-Q advantage A10，Merck，德國)；固相萃取柱Oasis?PRiME HLB柱和Oasis?PRiME MCX柱(60 mg，3CC，Waters，美國)。

甲醇和乙腈(均為HPLC級)購自Fisher Scientific(美國)；氨水(HPLC級，含量大于25%)購自上海安譜實驗科技股份有限公司；芬太尼，去苯乙基芬太尼，乙酰芬太尼，去苯乙基乙酰芬太尼，4-苯胺基-N-苯乙基哌啶(4-ANPP)，芬太尼-D5，去苯乙基芬太尼-D5，乙酰芬太尼-13C6，去苯乙基乙酰芬太尼-13C6，4-苯胺基-N-苯乙基哌啶-D5(4-ANPP-D5)標準物質溶液(溶劑均為甲醇，濃度100 μg/mL)均購自Cerilliant(美國)。

1332份污水樣品來自國家禁毒辦污水監測項目，于2020年第2季度采集自全國125個城市的生活污水處理廠，混合空白污水基質使用10份來自不同城市的空白污水樣品混合制成。

1.2 離線固相萃取分析方法

1.2.1 樣品處理污水樣品用濃HCl調節pH至小于2，加入混合內標溶液使各同位素內標濃度為50 ng·L-1，玻璃纖維濾膜過濾后移取50 mL濾液，以1 mL·min-1流速加載至PRiME MCX固相萃取柱中，甲醇4 mL淋洗后真空抽固相萃取柱至干燥，再用含5%氨水/甲醇溶液(體積比5∶95)4 mL洗脫，洗脫液使用真空濃縮儀于45 ℃濃縮至干，加入0.1%甲酸水溶液250 μL復溶，0.2 μm濾膜過濾后供儀器檢測。使用PRiME HLB固相萃取柱的實驗條件與上述基本相同，不同之處在于污水樣品pH值調節至7，上樣后使用純水淋洗，洗脫液為甲醇。

1.2.2 超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀分析條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.4 mL·min-1；洗脫梯度程序：0.0～6.0 min(5%～25%B)，6.0～9.0 min(25%～50%B)，9.0～9.2 min(50%B～100%B),9.2～11.0 min(100%B)，11.0～11.2 min(100%～5%B),11.2～14.0 min(5%B)；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。質譜分析：電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；毛細管電壓：3 kV；離子源溫度：550 ℃；霧化氣壓強：50 psi；輔助加熱氣壓強：50 psi；氣簾氣壓強：35 psi；碰撞氣為氮氣；采集模式為多反應監測(MRM)。

1.3 在線固相萃取分析方法

1.3.1 樣品處理污水樣品加入混合內標溶液使各同位素內標濃度為50 ng·L-1，使用甲酸或氨水調節pH至7，混勻后用0.2 μm濾膜過濾后供儀器檢測。

1.3.2 在線固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀分析條件固相萃取柱：Oasis HLB Direct Connect HP(2.1 mm×30 mm,20 μm)；色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；進樣量：3 mL；在線固相萃取采取雙柱模式；固相萃取流速：3 mL·min-1；固相萃取程序：0.0～3.0 min超純水，3.0～5.0 min 50%甲醇水溶液，5.0～7.0 min甲醇/乙腈/異丙醇混合溶液(體積比1∶1∶1)，7.0～16.0 min超純水，其中2.8 min進行柱切換，將已加載樣品的固相萃取柱切換至液相色譜流路，同時將前序完成樣品洗脫的固相萃取柱切換至固相萃取流路進行清洗和平衡；液相色譜流動相：A為0.1% 甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.4 mL·min-1；洗脫梯度程序：0.0～2.8 min(5%B)，2.8～8.4 min(5%～30%B)，8.4～13.9 min(30%～100%B)，13.9～15.9 min(100%B)，15.9～16.0 min(100%～5%B)；柱溫：40 ℃。質譜分析：電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；毛細管電壓：0.5 kV；加熱模塊溫度：400 ℃；DL溫度：250 ℃；霧化氣流速：3 L·min-1；加熱氣流速：10 L·min-1；干燥氣流速：10 L·min-1；碰撞氣為氬氣；采集模式為多反應監測(MRM)。

1.4 回收率和基質效應評價

離線固相萃取法：使用0.1%甲酸水溶液配制濃度分別為0.2、2、20 ng·mL-1的目標物標準溶液直接進樣分析，每個濃度重復測定6次得到的峰面積平均值為A；混合空白基質進行固相萃取，洗脫液吹干后分別加入含0.2、2、20 ng·mL-1目標物的0.1%甲酸水溶液250 μL復溶后進樣分析，每個濃度重復測定6次得到的峰面積平均值為B；使用混合空白基質配制濃度分別為1、10、100 ng·L-1的基質添加樣品后進行固相萃取，每個濃度重復測定6次得到的峰面積平均值為C；提取回收率=C/B，基質效應=B/A，整體回收率=C/A。在線固相萃取法：使用純水配制濃度分別為1、10、100 ng·L-1的標準溶液，每個濃度重復測定6次得到的峰面積平均值為A；使用混合空白基質配制濃度分別為1、10、100 ng·L-1的基質添加樣品，每個濃度重復測定6次得到的峰面積平均值為C；整體回收率=C/A。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

目標物使用液相色譜-三重四極桿質譜儀(LC-TQ-MS)在多反應監測(MRM)模式下進行檢測。由于離線和在線固相萃取法使用不同的質譜儀，因此分別優化了5種目標物及相應同位素內標的母離子、子離子和碰撞能量，結果見表1。芬太尼、乙酰芬太尼及4-ANPP在兩臺儀器上響應最強的兩個子離子均為188.1和105.1，前者由氨基與哌啶環之間的C-N斷裂生成，后者由哌啶環氮原子與苯乙基之間的C-N斷裂生成(圖2A)。去苯乙基芬太尼在使用碰撞氣為氮氣的Triple Quad 6500時響應最強的兩個子離子為150.1和84.1，二者均由氨基與哌啶環之間的C-N斷裂生成；使用碰撞氣為氬氣的LCMS-8050時響應最強的兩個子離子為84.1和56.0，前者由氨基與哌啶環之間的C-N斷裂生成，后者由哌啶環碎裂生成(圖2B)。去苯乙基乙酰芬太尼的情況與去苯乙基芬太尼類似。

表1 5種目標化合物及其同位素內標MRM質譜采集參數

續表1

圖2 5種目標化合物子離子裂解途徑Fig.2 Proposed fragmentation pathways of product ions for five target compounds

2.2 色譜條件的優化

鑒于目標物使用電噴霧離子源在正離子模式下進行檢測，色譜梯度洗脫的水相選擇0.1%甲酸水溶液以提高離子化效率，有機相經測試乙腈較甲醇響應更強且柱壓更低，因而使用前者。色譜分離嘗試了ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)和ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)兩種色譜柱，使用離線固相萃取法時前者峰形更佳，使用在線固相萃取法時由于目標物在固相萃取柱上洗脫后直接進入色譜柱，后者對極性化合物保留更強，能在初始流動相下更好進行柱頭富集從而獲得更好的峰形。最終離線固相萃取法和在線固相萃取法優化條件下的色譜圖見圖3，5種目標物均得到有效分離。

圖3 5種目標化合物TIC色譜圖Fig.3 TIC chromatograms of five target compounds

2.3 前處理方法的比較

固相萃取是分析污水中痕量有機物質最常用的前處理方法。由于污水樣品基質差異較大，本研究使用來自不同城市且經測試不含5種目標物的10份污水樣品，等比例混合制成混合空白污水基質，并分別添加了1、10、100 ng·L-1的目標物，考察了離線和在線兩種不同固相萃取模式的提取和凈化效果。

離線固相萃取使用全自動固相萃取儀進行，50 mL污水樣品經上樣、淋洗和洗脫后，洗脫液濃縮至干再加入250 μL溶劑復溶，LC-TQ-MS進樣5 μL檢測，實際進樣量相當于1 mL污水樣品。鑒于5種目標物全部為堿性有機物，固相萃取柱選擇了PRiME MCX和PRiME HLB進行測試，該系列固相萃取柱不需活化和平衡步驟，能節省時間和溶劑消耗。PRiME MCX基于陽離子交換模式，上樣時將污水樣品pH調節至小于2以保證目標物充分質子化，洗脫時則使用5%氨水甲醇溶液將目標物去質子化；PRiME HLB基于反相保留模式，上樣時將污水樣品pH調節至中性，洗脫時使用純甲醇。根據表2結果，PRiME MCX對于5種目標物的提取回收率均大于80%，而PRiME HLB對于強極性的去苯乙基乙酰芬太尼的提取回收率僅有約40%，對去苯乙基芬太尼和4-ANPP的提取回收率也低于80%，且重復性較差。同時，由于污水中存在大量干擾物，所有目標物均存在較為嚴重的基質效應，但除去苯乙基乙酰芬太尼外的4種目標物使用PRiME MCX時基質干擾更弱。綜合提取回收率和基質效應可見，PRiME MCX對于所有目標物的整體回收率均優于PRiME HLB，這與以往相關研究結論一致[13]，即提取污水中堿性化合物時陽離子交換模式的選擇性更好，因此后續實驗中離線固相萃取均使用PRiME MCX柱。

在線固相萃取使用帶有固相萃取模塊的LC-TQ-MS進行，首先由固相萃取流路加載3 mL污水樣品至在線固相萃取柱并淋洗，再將在線固相萃取柱切換至分析流路，由流動相將其洗脫至色譜柱進行分離和檢測。該模式下洗脫液直接進入色譜柱，限制了需要強堿或強酸性洗脫條件的離子交換固相萃取柱的使用，因而只選擇了反相保留機理的HLB Direct Connect HP，上樣時將污水樣品調節至中性；同時由于提取和分析步驟同時在線進行，無法進行空白基質提取后的添加實驗，未能對提取回收率和基質效應進行單獨評價。根據表2結果，HLB Direct Connect HP的整體回收率高于PRiME HLB而低于PRiME MCX，說明其選擇性仍差于陽離子交換模式，但與填料成分相同的PRiME HLB相比，在線固相萃取可保證所有被保留的組分均被洗脫進入色譜柱，避免了離線固相萃取時洗脫、濃縮和復溶步驟可能帶來的損失，因而能獲得相對更高的回收率。鑒于在線固相萃取操作簡便且所需污水樣品體積小，適用于大批量實際樣品的檢測，雖然效果較PRiME MCX差，后續也對該方法進行了詳細評價。

表2 不同固相萃取條件下的基質效應、提取回收率和整體回收率比較

2.4 離線和在線固相萃取法方法的驗證

2.4.1 檢出限、定量限與線性范圍使用混合空白污水基質配制范圍為0.1～500 ng·L-1的不同濃度梯度的基質添加樣品進行測試，檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以3倍信噪比和10倍信噪比確定。以目標物峰面積與相應同位素內標峰面積的比值(Y)與目標物質量濃度(X，ng/L)進行線性回歸運算(權重系數：1/X)，得到標準曲線方程和相關系數，結果見表3。

兩種前處理方法對所有目標物的定量線性范圍均為0.5～200 ng·L-1，標準曲線相關系數均在0.995以上，可滿足實際污水樣品測定的要求。前處理方法研究中離線固相萃取整體回收率優于在線固相萃取，但前者進樣量僅相當于1 mL污水樣品，而后者進樣量為3 mL，實際檢測的污水體積更大，因此最終兩種方法的效果相當。

表3 方法檢出限、定量限、線性范圍、準確度和精密度

2.4.2 準確度與精密度使用混合空白污水基質分別配制濃度為1、10、100 ng·L-1的基質添加樣品，每種濃度每天進行6次測試，連續3天重復操作評價準確度、日內精密度和日間精密度，準確度以測試結果平均值與添加值的相對誤差(RE)表示，精密度以相對標準偏差(RSD)表示。結果見表3。所有目標物在3個添加濃度水平下的定量誤差均小于10%，日內和日間RSD均小于6%，表明兩種方法的準確度和精密度均符合要求。值得注意的是，無論是離線還是在線固相萃取中4-ANPP都受到了嚴重的基質干擾，整體回收率僅有20%左右，但通過同位素內標校準后仍可獲得較為滿意的定量結果。

2.4.3 目標物穩定性分別將混合空白污水基質配制的質控樣品調節至pH 2和pH 7，考察不同存儲條件下的穩定性，結果顯示兩種pH條件下，4 ℃冷藏1周以內以及-20 ℃冷凍2個月以內，5種目標物的濃度變化均小于15%，說明穩定性良好，污水采樣后無需進行特別的預處理。

2.5 方法的實際應用

使用本研究建立的離線固相萃取法和在線固相萃取法，對2020年第二季度采集的1332份污水樣品進行了分析，結果均未檢出5種目標物，且同位素內標均正常出峰，說明樣品前處理及儀器檢測過程可靠。與相應含量同位素內標溶液直接進樣結果相比，污水樣品中同位素內標峰面積受到明顯抑制，二者峰面積比值主要分布于20%至80%區間(表4)，說明實際污水的基質干擾復雜，不同樣品間存在較大差異，因此必須使用同位素內標進行校正才能獲得準確的定量結果。

表4 實際污水樣品中同位素內標峰面積抑制情況分布(%)

我國已于2019年5月1日起將芬太尼類物質整類列入管制，本研究針對的芬太尼和乙酰芬太尼是最為常見的芬太尼類物質，去苯乙基芬太尼和去苯乙基乙酰芬太尼是二者的主要代謝產物，4-ANPP是多種芬太尼類物質的制造原料和代謝產物，本次在來自125個主要城市的實際樣品中均未檢出這5種物質，說明我國對芬太尼類物質的管控效果較好，不存在規模性濫用。

3 結論

本研究建立了兩種同時測定污水中5種芬太尼類物質及其代謝物的分析方法，分別基于離線和在線固相萃取技術，其中離線固相萃取的整體回收率高于在線固相萃取，但使用后者時污水樣品僅需過濾即可上樣，操作更為簡便。驗證結果顯示，通過同位素內標校正后，兩種方法均能對污水中的5種目標物進行準確定量分析，線性范圍寬，準確度和精密度較好，可用于實際污水樣品的檢測，從而評估相關區域內芬太尼類物質的濫用情況，提升毒情監測預警能力。