基于核酸適配體熒光標記及熒光共振能量轉移檢測赭曲霉毒素A

劉諾亞， 趙新月， 張曉萌， 宋玉竹， 張金陽， 韓芹芹*

(昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明 650500)

赭曲霉毒素是曲霉素和青霉素產生的一種次級代謝產物，共有7種結構類似物，其中赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是分布最廣、毒性最強的一種[1]，它主要作用于動物的肝臟和腎臟，具有腎毒性、肝毒性、致癌性和致畸性，被國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer,IARC)認定為ⅡB類致癌物[2]。人體攝入OTA的途徑有兩種，一種是直接食用被OTA污染的谷物，如玉米粉，紅薯粉等；另一種是食用體內殘留OTA的動物食物[3]。為了保障人體的健康，我國規定了OTA在食品中的限量標準，根據國標(GB2761-2017)《食品中真菌毒素限量》[4]，谷物及其研磨加工品中OTA最高濃度為5 μg/kg。因此，食品中OTA的檢測具有重要意義。目前已有多種方法檢測OTA，如高效液相色譜法[5]、液相色譜-質譜聯用法[6]、酶聯免疫吸附分析[7]、薄層色譜法[8]等。這些方法雖然靈敏度高，但是存在復雜的樣品前處理、昂貴的儀器、成本高、制備困難以及檢測周期長等缺點[9]。因此，開發方便、快捷檢測OTA的方法引起了大家的廣泛關注。

近年來，由于核酸適配體具有成本低、強特異性、穩定性高等特點，成為了新的研究熱點[10]。核酸適配體是單鏈DNA或RNA通過折疊、卷曲為特定三級結構，具有特定功能的分子，它主要通過體外指數富集的配體系統進化技術(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)從隨機寡核苷酸文庫中篩選得到[11]。應用核酸適配體檢測OTA的方法有比色法[12]、電化學法[13]和光學檢測法[14]等。其中，根據物質間能發生熒光共振能量轉移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)、內濾效應(Inner Filter Effect,IFE)、光誘導電子轉移(Photo Induced Electron Transfer,PET)等原理，實現簡單、快速、直觀檢測的目標物，已在食品安全領域廣泛應用[15]。曲瑤等[16]以鳥嘌呤堿基為猝滅劑，單標記熒光素的寡聚核酸為探針，基于PET原理，建立了一種熒光檢測方法，但是這種方法需要篩選含有豐富鳥嘌呤堿基的適配體，無法廣泛的應用于其它靶標。GUO等[17]建立了一種將無標記適配體和熒光染料結合的檢測方法，由于適配體不需要標記，因此合成成本降低，但該方法需要合成納米材料作為猝滅劑，猝滅效率不高。

本研究將適配體以熒光素(FAM)標記并作為熒光探針，Dabycl為熒光猝滅劑，基于FAM基團和猝滅基團Dabycl之間的FRET原理，建立了一種基于OTA的熒光標記檢測方法。該方法具有靈敏度高、操作簡單和檢測快速等優點，在食品檢測中具有廣泛的應用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

G9800A熒光分光光度計，安捷倫科技有限公司；酶標儀，美國Thermo；臺式高速離心機，德國Beckman；pH計，美國Thermo；恒溫搖床，蘇州培英實驗設備有限公司；電子分析天平，德國Sartorius；低溫冰箱，青島海爾股份有限公司；渦旋振蕩器，上海精科實業有限公司；純水儀，美國Millipore。

OTA核酸適配體[18]序列(OTA-aptamer)：5′-FAM-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGG GAGCATCGGACA-3′，cDNA序列：5′-CGCCACCCACACCCGATC-Dabcyl-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。OTA購自上海熹垣生物科技有限公司；α-鵝膏毒肽標準品(α-Amanitin)購自美國Sigma公司；嘔吐毒素(Deoxynivalenol,DON)購自上海撫生實業有限公司；黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AF B1)購自上海吉至生化科技有限公司；黃曲霉毒素G2(Aflatoxin G2,AF G2)購自北京百奧萊博科技有限公司；KCl、KH2PO4、NaH2PO4、NaCl均購自天津市化學試劑三廠。

1.2 實驗原理

OTA熒光標記法檢測原理如圖1所示，OTA-aptamer和cDNA可以通過堿基互補配對形成dsDNA。當OTA不存在時，OTA-aptamer會與cDNA不斷靠近，猝滅基團Dabcyl通過FRET的原理使熒光素猝滅；當OTA存在時，OTA-aptamer與OTA結合，與OTA-aptamer形成穩定的反平行G-四鏈體結構[19]，抑制cDNA與OTA-aptame雜交，熒光恢復。所以，通過監測熒光強度的變化可實現對OTA的定量檢測。

圖1 熒光標記法檢測OTA原理示意圖Fig.1 Schematic of the OTA detection based on the fluorescence labeling method

2 結果與分析

2.1 OTA-aptamer與cDNA鏈體積比的優化

通過優化OTA-aptamer與cDNA的體積比，確定兩種基團的最適濃度。首先將OTA-aptamer和cDNA離心并用雙蒸水溶解至100 μmol/L，備用。隨后分別將體積比為1∶0、1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8和1∶1的OTA-aptamer和cDNA同時加入至15 mL離心管中，并用磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)補齊至3 mL，溫度37 ℃、100 r/min轉速條件下避光孵育30 min，然后激發波長為497 nm進行熒光檢測。所有實驗都設置2組平行對照。根據圖2可以看出，當OTA-aptamer體積不變時，隨著cDNA的體積不斷增加，猝滅基團Dabcyl的濃度也不斷增加，導致熒光猝滅，熒光強度逐漸下降。當體積比增大至1∶0.6時，熒光強度不再大幅度下降，為了避免猝滅基團過量給實驗帶來影響，選擇1∶0.6為OTA-aptamer與cDNA的最優比例。

2.2 孵育時間優化

將體積比為1∶0.6的OTA-aptamer、cDNA和終濃度為200 ng/mL的OTA三者同時加入至15 mL離心管中，用PBS補齊至3 mL，分別在37 ℃恒溫搖床避光孵育30 min、60 min和90 min，孵育完成后進行熒光檢測。如圖3所示，當孵育時間從0 min不斷增加至30 min時，與無OTA的對照相比，OTA的存在對其混合溶液熒光強度的影響不斷增強，當孵育時間在30～90 min時熒光增強程度反而減弱，說明孵育時間并不是越長越好，可能長時間的孵育，還會導致OTA和OTA-aptamer結合能力的降低。因此為了建立更靈敏的檢測方法，選擇30 min為OTA-aptamer與cDNA的最佳孵育時間。

圖2 OTA-aptamer與cDNA鏈最佳體積比的優化Fig.2 Optimization of the volume ratio between aptamer and cDNA

圖3 OTA-aptamer與cDNA孵育時間的優化Fig.3 Optimization of aptamer and cDNA incubation time

2.3 特異性分析

在上述優化的實驗條件下，以OTA的結構類似物，以及可能同時存在的毒素AF B1、AF G2、DON、α-鵝膏毒肽(α-Amanitin)4種生物毒素及其混合液(不含OTA)為陰性對照，以OTA和上述4個靶標混合液(含OTA)為陽性對照，以只含有OTA-aptamer和cDNA的PBS為空白對照，對該檢測方法的特異性進行分析。將終濃度為500 ng/mL的AF B1、AF G2等其他靶標及混合溶液與體積比為1∶0.6的OTA-aptamer、cDNA加入至15 mL離心管中，PBS進行稀釋，終體積為3 mL，37 ℃、100 r/min轉速條件下在恒溫搖床上避光孵育30 min，孵育完成后進行熒光檢測。由圖4可知，與空白對照相比，含有OTA的溶液及含有OTA的混合溶液具有較高的熒光強度，且P<0.05，具有顯著性差異，說明OTA-aptamer能特異的識別OTA，而不與其它靶標結合。

2.4 不同濃度 OTA 的檢測及標準曲線的建立

分別將終濃度為0、0.01、0.025、0.05、0.15、0.2、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL的OTA標準溶液，以及體積比為1∶0.6的OTA-aptamer、cDNA同時加入至離心管中，PBS(pH=7.4)補齊至3 mL。37 ℃、100 r/min條件下避光孵育30 min后，檢測熒光強度。并以OTA濃度(x)為橫坐標，熒光強度(y)為縱坐標，建立標準曲線。如圖5所示，當OTA濃度不斷增加時，越來越多的適配體與靶標OTA特異性結合并導致適配體發生構象改變，故無法與標記Dabcyl猝滅基團的cDNA鏈靠近，此時熒光恢復，熒光強度增強。

圖4 基于適配體熒光標記法的選擇性分析Fig.4 Selectivity analysis based on the fluorescence labeling methodMixture 1：AF B1、AF G2、DON、α -Amanitin；Mixture 2：AF B1、AF G2、DON、α -Amanitin and OTA.

圖5 不同濃度OTA的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of different concentration of OTAc(a-j):0,0.01,0.025,0.05,0.15,0.2,0.25,0.5,1.0,2.0 μg/mL.

當OTA濃度在0.01～0.25 μg/mL范圍內時，線性關系良好，校正曲線方程為:y=844.95x+24.14，相關系數R2為0.9991。該方法可以定量檢測OTA，檢測限為0.01 μg/mL，滿足國標要求。

Lv等[20]利用穩定分散的金納米顆粒(AuNPs)比聚集的AuNPs具有更好的熒光猝滅FAM基團的效果，建立了一種簡單、高效的OTA檢測方法，檢測限22.7 nmol/L。YAN等[21]利用分子印跡技術的高選擇性和上轉換納米材料的熒光特性合成了具有高選擇性的熒光分子印跡聚合物用于檢測OTA，此方法具有高度特異性，檢測限0.031 mg/L。與之相比，本方法Dabcyl的猝滅效果更好，在特異性強的同時，靈敏度更高。

2.5 實際樣品中OTA的檢測

根據ELISA試劑盒步驟進行樣品前處理：稱取玉米粉、紅薯粉各2 g于50 mL離心管中，分別向樣品中加入0、0.3、0.75、1.5、3.0、6.0、7.5 μg的OTA，隨后加入10 mL 70%的甲醇溶液并連續振蕩5 min，混合后在室溫、4 000 r/min條件下離心10 min。最后，取離心后的上清1 mL加入至1 mL 0.1 mol/L的NaHCO3溶液并混合，用于實際樣品檢測。取2 mL加標后的實際樣品處理液于15 mL離心管中，將終濃度為100 μmol/L、體積比為1∶0.6的OTA-aptamer和cDNA加入至樣品處理液中，PBS定容至3 mL。緩慢混勻后，樣品在37 ℃、100 r/min條件下避光孵育30 min，進行熒光檢測。同時用ELISA進行實際樣品檢測，與熒光標記法比較。如圖6所示，檢測玉米粉和紅薯粉建立的標準曲線與OTA標準品的標準曲線非常接近，其中一定的差異可能是由于基質的一定影響和樣品處理中的損失。由于基質影響較小，該方法可實現對實際樣品中OTA檢測的目的。

圖6 熒光標記法對玉米粉和紅薯粉中OTA的測定Fig.6 Detection of OTA in corn flour and sweet potato flour by fluorescence labeling method

2.6 加標回收率的計算

為了更加準確地評價熒光標記法檢測實際樣品時的基質影響，在本實驗中對玉米粉和紅薯粉的加標回收率進行計算，同時用ELISA法檢測實際樣品的加標回收率，與本方法對比。結果如表1所示，利用ELISA法檢測回收率在69.76%～88.64%之間，本文方法檢測回收率在86.40%～97.50%之間。表明所建立的熒光標記法具有靈敏度高、特異性強、耗時短的特點。

表1 兩種方法對實際樣品中OTA的加標回收率結果

3 結論

本文以Dabcyl為熒光猝滅劑，與金納米、石墨烯等其他納米材料相比，具有較高的猝滅效率和較低的非特異性反應，可以很大程度的提高檢測方法的靈敏度和特異性。該方法以適配體為識別元件，基于FRET原理使熒光基團FAM猝滅，當OTA在0.01～0.25 μg/mL濃度范圍內，OTA濃度與熒光強度呈良好的線性關系，檢測限達0.01 μg/mL。與ELISA法比較，此方法的基質效應更小，操作更簡單，只需30 min即可完成整個檢測過程。因此，該方法可應用于實際樣品中OTA的檢測，并且具有較好的應用前景。