基于磁性金屬有機框架模擬酶電化學檢測鄰苯二酚的研究

關樺楠， 邢 珂， 張 悅， 劉樹萍

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業大學旅游烹飪學院，黑龍江哈爾濱 150076)

鄰苯二酚(CC)，又稱兒茶酚，是化學生產、農藥、橡膠染料中常見有機污染物。鄰苯二酚被國際癌癥研究機構列為潛在致癌物，即使濃度為5～25 ppm，也被認為對生物具有毒性[1 - 3]，因此，開發簡單、快速、靈敏的鄰苯二酚檢測方法就顯得尤為重要。與常用的檢測方法如高效液相色譜法(HPLC)[4]、熒光探針法[5]和化學發光分析法[6]等相比，電化學生物傳感分析技術具有操作簡單、靈敏度高、選擇性好等優點[7,8]，并且有很好的應用和開發前景。

大多數電化學生物傳感分析技術的核心原件是以天然酶為基礎進行分析檢測的，而天然酶卻因其高昂的制備成本、不穩定性和難再生等不足，嚴重限制了其實際應用[9,10]。為解決電化學生物傳感分析技術中天然酶的不足，納米模擬酶逐漸成為研究熱點。與天然酶相比，基于納米材料的人工模擬酶因其成本低、穩定性高而受到越來越多的關注，其中金屬-有機框架材料(metal-organic frameworks，MOFs)以其可調的結構、高孔隙率、高催化活性和高穩定性等特點引起了廣泛的研究興趣[11,12]。然而，單MOFs的酶活性較差，因此通常在單MOFs的基礎上添加其他納米材料來制備復合MOFs，以提高酶的活性[13]。在眾多納米材料中，Fe3O4和金納米粒子(AuNPs)均具有過氧化物模擬酶活性，添加到MOFs中可以顯著提高復合納米粒子的過氧化物模擬酶活性和催化能力[14,15]。Fe3O4@Au/MOF模擬酶具有AuNPs良好的穩定性和重復性[16]，并且可以提高體系的靈敏度和選擇性[17]，也具有Fe3O4可以被磁鐵回收和再利用[18]的優點。

本文通過將Fe3O4磁性粒子和Cu2+分散在對苯二甲酸(PTA)形成的二維網絡結構中，合成了銅基金屬有機框架(Fe3O4@Cu-MOF)，同時將金納米粒子嵌入網絡結構后，制備出具有過氧化物酶活性的新型金屬有機框架模擬酶(Fe3O4@Au/MOF)。Fe3O4@Au/MOF可催化分解體系中的H2O2，釋放出具有氧化活性的羥基自由基，進一步加速電化學信號物質鄰苯二酚在玻璃碳電極表面的氧化反應，從而增加系統中電荷的運動產生微電流，進而提高電化學檢測體系的的靈敏度。利用Fe3O4@Au/MOF模擬酶構建增強的電化學檢測鄰苯二酚系統，成功用于檢測飲用水中的鄰苯二酚。鑒于此，基于模擬酶的電化學檢測技術將為環境分析、食品分析以及生物醫學檢測等領域提供一種新思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學工作站(上海晨華儀器有限公司)：采用三電極結構體系，包括玻璃碳電極(GCE)作為工作電極，鉑電極作為對電極，Ag/AgCl作為參比電極；YH-101水熱反應釜(河南裕華儀器科技有限公司)；F200X S透射電子顯微鏡(北京歐博通光學技術有限公司)；EDK 9500傅里葉變換紅外光譜儀，X射線光電子能譜儀(北京杜克科技有限公司)。

鄰苯二酚購自廣福精細化工研究所；FeCl3·6H2O，NaAc·3H2O，HAuCl4，CuSO4，NaBH4，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙二醇(PEG-4000)，乙二醇，對苯二甲酸，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，2,2′-氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)等試劑均購于科密歐化學試劑有限公司。

1.2 Fe3O4@Au/MOF的合成

采用水熱法制備Fe3O4納米顆粒。分別將3 g的FeCl3·6H2O、6.3 g的NaAc·3H2O和1.8 g的PEG-4000依次加入到裝有80 mL乙二醇的燒杯中。充分震蕩30 min后，將混合均勻的溶液轉移至水熱反應釜中，在200 ℃條件下恒溫反應8 h。反應結束后，冷卻至室溫，離心去上清液，分別采用乙醇和去離子水依次清洗黑色沉淀3個循環，隨后將沉淀真空干燥至恒重，此為所制備的Fe3O4納米顆粒，常溫保存備用。

采用改良的綠色還原法[19]，以新鮮的橘子皮為原料，制備金納米粒子。將20 g切碎的橘子皮在80 ℃的去離子水中浸泡1 h，然后將濾液以3 500 r/min離心5 min，得到上清液。用去離子水稀釋上清液，得到橙皮備用溶液，并在4 ℃下保存。將20 mL預冷4 ℃的HAuCl4加入至燒杯中，放置于磁力攪拌器上均勻攪拌，并迅速向燒杯中加入5 mL橘子皮備用液。隨著攪拌速度的不斷加快，體系的顏色從黃色變為酒紅色并在30 min內沒有變化時，即反應結束。金納米粒子定量為31.3 mg/mL，合成的含有金納米粒子的溶液需要保存在4 ℃的環境下。

將2 g合成的Fe3O4納米粒子和10 mL 99.7%的乙醇在搖床上充分混合30 min。然后再依次加入3 g PVP、20 mL的乙醇和45 mL的DMF，并超聲震蕩處理45 min。加入10 mL Cu2+標準溶液和2 g對苯二甲酸粉末，搖床震蕩反應30 min。將混合后的溶液置于200 ℃的水熱反應釜中反應6 h。用乙醇和蒸餾水對混合溶液進行3次洗滌。將清洗后的金屬有機框架(Fe3O4@Cu-MOF)置于真空干燥箱中，干燥至恒重，備用。

將Fe3O4@Cu-MOF進行超聲波震蕩處理，使之分散在5 mL蒸餾水中，加入5 mL所制備金納米粒子凝膠工作液，在搖床中緩慢晃動6 h，然后加入10 mL濃度為0.1 mol/L的NaBH4水溶液，超聲處理45 min。最后，用蒸餾水清洗，再干燥至恒重后得到Fe3O4@Au/MOF二維磁性金屬有機框架。

2 結果與討論

2.1 Fe3O4@Au/MOF的表征

采用透射電子顯微鏡對所制備的Fe3O4@Au/MOF粒子的表觀形貌進行表征。由圖1可知，Fe3O4@Au/MOF是由表面粗糙的分散球體組成的磁性團簇。Fe3O4磁性納米粒子具有磁性吸引力和范德華力，所以Fe3O4納米粒子易產生聚集，導致分散穩定性差。將AuNPs固定在其表面可以有效降低Fe3O4納米粒子之間的聚集效應，提高復合納米粒子的催化活性。根據TEM圖像顯示，磁性納米粒子和AuNPs均勻地分散在Fe3O4@Au/MOF團簇中，并成功地與銅基金屬有機框架結合。

圖1 Fe3O4@Au/MOF金屬有機框架在50 nm(a)和200 nm(b)下的透射電子顯微鏡(TEM)Fig.1 TEM images of Fe3O4@Au/MOF metal-organic framework at 50 nm (a) and 200 nm (b)

用X射線光電子能譜(XPS)來進一步分析Fe3O4@Au/MOF復合材料的組成。在XPS光譜中，三個突出的峰分別是Fe 2p,Au 4f和Cu 2p。如圖2a所示，Fe 2p的高分辨率XPS光譜包含兩個結合能，分別為710.55和724.32 eV。這兩個結合能代表了Fe 2p3/2和Fe 2p1/2的雙峰，即Fe3O4磁性粒子的特征峰。根據圖2b和2c可以看出，在93.55 eV和932.52 eV處可以觀察到Au 4f和Cu 2p的光譜，這意味著AuNPs和Cu2+已經成功嵌入Fe3O4@Au/MOF復合納米粒子中。

圖2 Fe3O4@Au/MOF金屬有機框架中Fe (2p) (a),Au (4f) (b)和Cu (2p) (c)的X射線光電子能譜Fig.2 X-ray photoelectron spectra of Fe (2p) (a),Au (4f) (b) and Cu (2p) (c) in Fe3O4@Au/MOF

圖3 Fe3O4@Au/MOF金屬有機框架的紅外光譜Fig.3 FT-IR spectrum of Fe3O4@Au/MOF metal-organic framework

對Fe3O4@Au/MOF進行了FT-IR檢測，如圖3所示。在560.19 cm-1處的峰值來自磁性顆粒中Fe-O鍵的振動；由于C-O拉伸，約在1 117.31 cm-1處產生了吸收峰；1 631.33 cm-1處產生的吸收峰是由于氨基的存在。在2 250～2 750 cm-1之間有兩個吸收峰分別來自長鏈烷基-CH2和-CH3的振動，此外，3 846.44 cm-1處為-OH鍵的特征峰。

2.2 Fe3O4@Au/MOF復合材料的模擬酶活性的驗證

設計5個不同的反應體系：(1)H2O2+Fe3O4@Au/MOF；(2)單獨鄰苯二酚；(3)鄰苯二酚+Fe3O4@Au/MOF；(4)H2O2+鄰苯二酚；(5)H2O2+Fe3O4@Au/MOF+鄰苯二酚。采用循環伏安法(CV)監測5個體系氧化峰電流的變化情況。以在H2O2存在下，鄰苯二酚的催化氧化反應程度來評估Fe3O4@Au/MOF的過氧化物酶活性。

圖4 Fe3O4@Au/MOF過氧化物模擬酶活性的電化學驗證Fig.4 Electrochemical validation of Fe3O4@Au/MOF peroxidase-like activity

如圖4所示，在Fe3O4@Au/MOF的存在下，低濃度的H2O2不能產生氧化電流峰，說明玻璃碳電極表面沒有可產生電流的移動電子，或者體系中的反應不滿足產生電流的反應條件。當HAc-NaAc緩沖體系中只有鄰苯二酚時，產生了微弱的電化學信號，這是因為鄰苯二酚具有獨特電化學活性[20]。鄰苯二酚+Fe3O4@Au/MOF緩沖溶液體系和H2O2+鄰苯二酚緩沖溶液體系都產生了較為突出的氧化峰電流，并且電流呈上升趨勢。因為Fe3O4@Au/MOF催化了溶液中的幾種氧化性物質并與鄰苯二酚發生反應，從而促進了電子轉移。與其他體系相比，H2O2+Fe3O4@Au/MOF+鄰苯二酚體系的氧化電流峰值明顯增大。這是因為Fe3O4@Au/MOF作為過氧化物模擬酶，催化H2O2重新引入大量的氧化活性物質(主要是具有氧化活性的·OH和HOO·自由基)，進一步促進了鄰苯二酚的氧化。結果表明，Fe3O4@Au/MOF表現出了過氧化物酶模擬酶的活性，有效催化H2O2并進一步氧化鄰苯二酚，因此它可以加入到鄰苯二酚的電化學檢測中，以提高檢測靈敏度。

2.3 單因素優化Fe3O4@Au/MOF模擬酶電化學檢測體系

將不同添加量的Fe3O4@Au/MOF(0.050、0.075、0.10、0.125和0.150 g)分別加入不同pH值(4、5、6、7和8)的10 mL HAc-NaAc緩沖溶液中混勻，并將其加熱至不同的恒定溫度(40、50、60、70和80 ℃)，加入600 μL 50 mmol/L H2O2標準溶液，充分反應10 min后，再加入200 μL 0.01 mmol/L的鄰苯二酚標準溶液，并采用不同掃描速率(0.02、0.04、0.06、0.08和0.1 V/s)的電化學工作站進行檢測。再進行正交試驗設計優化實驗，篩選出最佳檢測條件。

圖5 不同因素對電化學檢測體系的影響Fig.5 Effect of different factors on the electrochemical detection system(a)the reaction temperature;(b) Fe3O4@Au/MOF addition amount;(c) the scan rate;(d) pH of buffer solution

從圖5a可以看出，當溫度在40～70 ℃范圍內時，反應速率隨著溫度的上升而提高。由于溫度變化導致鄰苯二酚的溶解度增加，與Fe3O4@Au/MOF催化產生的自由基充分反應，所以|Ipa|持續上升。當溫度超過70 ℃時，|Ipa|下降，這是由于Fe3O4@Au/MOF模擬酶的活性在較高溫度下受到抑制。因此，在正交優化設計實驗時選擇溫度為60、70、80 ℃。如圖5b所示，當Fe3O4@Au/MOF的添加量在0.005至0.075 g時，|Ipa|上升速率最快。體系中的模擬酶活性增強會促進H2O2產生更多的氧化活性自由基，使電子加快轉移速度、增加轉移數量。然而，當繼續添加Fe3O4@Au/MOF時，體系的|Ipa|依然上升但上升速度逐漸變慢，是因為當體系中存在大量的Fe3O4@Au/MOF時，納米粒子會進一步聚集，導致復合酶的催化活性逐漸降低。因此選擇模擬酶添加量0.10、0.125和0.150 g參與正交試驗設計優化實驗。圖5c中鄰苯二酚的|Ipa|隨著掃描速率的增加而不斷增加，這進一步證明了鄰苯二酚在GCE上的電化學過程是擴散控制過程[21]。從0.08 V/s到0.1 V/s的上升速率已經明顯降低，故沒有必要研究超過0.1 V/s的掃描速率。因此選擇了0.06、0.08和0.1 V/s三個級別，參加正交設計的優化實驗。由圖5d可以看出，氧化電流峰值在pH=5時達到最高點，隨著pH值的不斷增加，當pH值在5～8范圍內變化時，|Ipa|明顯呈下降趨勢。這是因為質子參與了體系中的氧化還原反應[22]，隨著pH值的增加，體系中的質子持續減少，所以系統中的電子轉移量和電化學反應都減少了。根據結果可知，酸性和堿性環境都會抑制反應的進行。因此，選擇pH值4.0、5.0和6.0繼續進行正交設計的優化實驗。

2.4 正交試驗設計優化Fe3O4@Au/MOF模擬酶電化學檢測體系

在單因素試驗的基礎上，選擇溫度(A因素)、Fe3O4@Au/MOF添加量(B因素)、掃描速率(C因素)和pH值(D因素)4種因素進行正交優化試驗設計，研究對整個實驗的影響。測定指標為氧化峰電流絕對值μA，用L9(34)正交表優化實驗。如表1所示，正交試驗分析的結果表明，最佳組合為A1B3C3D2，即反應溫度為60 ℃，Fe3O4@Au/MOF添加量為0.15 g，掃描速率為0.1 V/s，pH值為5.0；根據結果可知，掃描速率是影響體系的主要因素，H2O2濃度、添加量和pH對鄰苯二酚含量的測定也有相應的影響。在最佳條件下進行了平行試驗，結果表明，該Fe3O4@Au/MOF模擬酶電化學檢測體系具有良好的精密度。

表1 正交實驗結果分析

圖6 不同濃度鄰苯二酚的CV曲線(a)及檢測鄰苯二酚的工作曲線(b)Fig.6 CV curves of the different concentrations of catechol (a) and the calibration curve for the detection of catechol(b)

2.5 電化學檢測鄰苯二酚工作曲線及回收率

在最佳檢測條件檢測了不同濃度鄰苯二酚在系統中的氧化還原反應行為。如圖6a所示，隨著鄰苯二酚的濃度從0.001到0.1 mmol/L的增加，|Ipa|也呈現增加趨勢。此外，從圖6b可以看出，鄰苯二酚在0.001 到0.1 mmol/L的濃度范圍內與|Ipa|有良好的線性關系，工作曲線的回歸方程為|Ipa|=2 048.5c+67.83，R2=0.9912。同時檢測限為1.12×10-7mol/L(S/N=3)，回收率在98.8%～105.1%之間。結果表明，Fe3O4@Au/MOF模擬酶催化的電化學檢測體系對檢測鄰苯二酚具有較高的靈敏度和精密度。

2.7 電化學檢測鄰苯二酚的抗干擾性研究

在最佳檢測條件下，研究模擬食品廢水中濃度為10 mmol/L的6種常見物質蔗糖、葡萄糖、CaCl2、NaCl、KCl和MgSO4，作為干擾物質來評估體系的抗干擾性能。干擾物質的濃度是鄰苯二酚的100倍。如圖7所示，與較高濃度的干擾物質相比，檢測體系對鄰苯二酚顯示出明顯的電流響應。這表明，基于Fe3O4@Au/MOF模擬酶的電化學檢測體系在檢測鄰苯二酚時表現出良好的選擇性和抗干擾性能。

圖7 鄰苯二酚檢測體系的抗干擾性Fig.7 Interference resistance of the catechol detection system

2.8 實際樣品檢測

將優化后的電化學檢測體系應用于實際樣品中鄰苯二酚的檢測，選擇在飲用水中加入不同濃度的鄰苯二酚標準溶液來進行檢測，并進行加標回收實驗。結果如表2所示，標準品的回收率為95.5%～106.3%，RSD小于2.05%，說明該電化學檢測體系對實際樣品具有良好的添加回收率和精確度，可以實現對實際樣品中鄰苯二酚的檢測。

表2 實際樣品的加標回收率

3 結論

本文成功構建了基于Fe3O4@Au/MOF的電化學生物傳感器，該傳感器將電化學檢測技術與金屬有機框架模擬酶相結合，實現了對鄰苯二酚的高效、定量分析檢測。在H2O2的存在下通過自組裝方法合成的Fe3O4@Au/MOF，可以催化鄰苯二酚的氧化還原反應。該電化學傳感器表現出優異的靈敏度和對共存分子更強的抗干擾能力，并且對鄰苯二酚具有良好的電化學響應線性關系及回收率，可應用于實際樣品飲用水的檢測。因此，Fe3O4@Au/MOF電化學生物傳感器具有優異的檢測環境污染物的潛力。