基于石墨烯偏振吸收光學傳感的心血管疾病標志物的定量檢測

李凌宇， 齊 昊， 高曉光*， 張校亮， 李曉春

(1.太原理工大學生物醫學工程學院，山西太原 030024；2.山西醫科大學第一醫院，山西太原 030001)

目前，我國現有心血管疾病患者約3.3億，遠高于腫瘤及其它種類疾病[1,2]。研究表明，炎癥是導致心血管疾病的主要因素之一，炎癥標志物的定量檢測對心血管疾病的早期診斷及治療具有重要意義[3,4]。超敏C反應蛋白(hypersensitive C Reaction Protein,hs-CRP)是存在于人血漿中的一項能反映機體炎癥狀態的指標。研究顯示，成人體內hs-CRP大于3 μg/mL即表示存在心血管疾病風險[5]。血清淀粉樣蛋白A(Serum Amyloid A,SAA)是一類由肝細胞合成，能反映機體感染情況的指標。研究表明，SAA濃度與心血管疾病及其并發癥的嚴重程度相關，并被用于預測冠心病患者的死亡率[6]。綜上，hs-CRP和SAA雙重指標對心血管疾病的早期診斷和風險評估具有重要意義。

目前，檢測CRP和SAA的方法主要有免疫層析法、酶聯免疫吸附測定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、化學發光法等。2012年，Timucin等人提出了一種基于抗體陣列的免疫傳感器，利用酶聯免疫吸附的原理，實現了對SAA的快速定量檢測[7]。2020年，Bravin等人提出了一種基于熒光共振能量轉移的免疫熒光傳感器，實現了對CRP的定量檢測[8]。2021年，Zhao等人提出了一種基于多孔有機框架材料Cd-MOF-74的免疫傳感器，通過將強導電性的金納米顆粒/氮化碳材料作為基底，采用差分脈沖伏安法檢測Cd-MOF-74中Cd2+的信號，實現了對CRP的高靈敏度定量檢測[9]。以上方法基本都能實現對CRP和SAA的快速定量檢測，但存在需要對生物分子進行標記、易受外界因素干擾和重現性差等缺點。因此，快速、免標記、高靈敏度和抗干擾能力強的檢測方法已經成為研究熱點。

石墨烯憑借其優異的光學、電學和力學特性在材料、能源、生物醫學和藥物傳遞等領域有著廣泛應用[10]。Ye等人發現在全反射條件下，不同厚度的石墨烯對s偏振光的吸收都遠大于p偏振光[11]。Xing等人搭建了基于石墨烯偏振吸收的折射率傳感裝置，用于對單個癌細胞的檢測[12]。Jiang等人通過在石墨烯表面修飾抗體，實現了對兔IgG的高靈敏度檢測[13]。此外，石墨烯還被用于氣體傳感領域[14,15]。在本研究中，我們發展了基于石墨烯偏振吸收性質的新型光學傳感技術，引入鎖相放大系統來消除環境光等外界因素的干擾，實現了對心血管疾病標志物hs-CRP和SAA的高靈敏度定量檢測，為心血管疾病的早期診斷提供了新的方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Edge Dimension原子力顯微鏡(Bruker Corporation,德國)，inViaTMQontor?共焦顯微拉曼光譜儀(Renishaw,英國)，JSM-7900F熱場發射掃描電子顯微鏡(JEOL,日本)，SR865A鎖相放大器(Stanford Research,美國)，ZEPTO-W6氧等離子刻蝕機(上海爾迪儀器科技有限公司)，KQ-400DE數控超聲波清洗機(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)，PSD Series紫外臭氧清洗機(Novascan Technologies,美國)，TKA-Genpure UV超純水系統(Thermo Fisher Scientific,美國)，KW-4A旋涂儀(Kemet Technology,美國)，MultiskanTMFC酶標儀(Thermo Fisher Scientific,美國)。

氧化石墨烯(GO,昂星新型碳材料常州有限公司)，聚二甲基硅氧烷(PDMS,Dow Corporate,美國)，磷酸鹽緩沖溶液(PBS,北京中杉金橋生物技術有限公司)，兔免疫球蛋白G(rabbit IgG)、山羊抗兔免疫球蛋白G(goat anti rabbit IgG)、牛免疫球蛋白M(bovine IgM)、重組人C反應蛋白(recombinant human CRP)、C反應蛋白抗體(anti-CRP)、重組人血清淀粉樣蛋白A1(recombinant human SAA1)和血清淀粉樣蛋白A1抗體(anti-SAA1)購自北京博奧森生物技術有限公司。人超敏C反應蛋白(hs-CRP)ELISA試劑盒和人血清淀粉樣蛋白A1(SAA1)ELISA試劑盒購自上海紀寧實業有限公司。牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC,0.4 mol/L)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS,0.1 mol/L)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。

圖1 光學傳感系統示意圖Fig.1 Schematic diagram of optical sensing systema:helium-neon laser,b:polarizer,c:1/2 wave plate,d:chopper,e:sensor chip,f:diaphragm,g:Wollaston prism,h:balanced detector,i:lock-in amplifier,j:computer.

1.2 實驗裝置

如圖1所示，波長為632.8 nm的激光先后經過偏振片和1/2波片成為偏振方向可調的線偏振光。之后，依次通過透鏡、斬波器和反射鏡以全反射角從棱鏡入射與石墨烯發生相互作用。傳感芯片上微流通道的兩端引出毛細塑料管，毛細塑料管連接注射器，由恒流注射泵驅動實現加樣。反射光經過反射鏡、光闌和渥拉斯頓棱鏡，產生s偏振光和p偏振光。兩束光的光強差由平衡探測器采集，產生電壓信號，信號經鎖相放大器降噪和放大，由計算機專用軟件采集并處理。

1.3 芯片的制備

芯片的制備主要由三部分組成。(1)還原氧化石墨烯(RGO)的制備：配制濃度為5 mg/mL的GO溶液，將GO溶液均勻地旋涂在經親水處理的石英片上，放入管式爐，在95%Ar/5%H2氣氛中以800 ℃高溫還原，制備得到RGO，RGO通過范德華力結合在石英片表面。(2)微流通道的制備：將PDMS的預聚物A和交聯劑B以質量比10∶1混合并攪勻，放入真空干燥箱中排出因攪拌產生的氣泡，隨后倒入預先制備好的模板上，在75 ℃下加熱2 h，使其完全固化。將固化的PDMS取下，在通道的兩端打孔完成制備。微流通道的尺寸為10 mm×2 mm×1.2 mm。(3)RGO與PDMS的鍵合：RGO和PDMS用紫外臭氧清洗機處理15 min，然后立即把RGO和PDMS貼合在一起，75 ℃下加熱3 h，完成傳感芯片的制備。實驗中，使用恒流注射泵將微流通道內注滿待測溶液進行檢測，檢測過程僅需要24 μL待測溶液。

1.4 RGO的表面活化與修飾

實驗中需要對RGO的表面進行活化，以實現后續抗體在RGO表面的固定。首先，向微流通道中依次注入PBS、EDC/NHS混合溶液，用來活化RGO表面的含氧官能團。30 min后，再注入PBS，沖洗3 min。然后注入抗體溶液(山羊抗兔IgG或anti-CRP或anti-SAA1,250 μg/mL)，抗體以共價結合的方式固定在RGO表面。再注入封閉液BSA(10 mg/mL)，阻斷RGO表面的非特異性結合。最后，注入PBS清洗微流通道，以PBS的信號作為基線。在整個過程中，恒流注射泵提供的流速為80 μL/min。

1.5 抗原的檢測

首先，用PBS配制不同濃度的兔IgG，將其注入RGO表面固定有山羊抗兔IgG的傳感芯片中?？乖贵w發生特異性結合，此時可以觀察到信號變化，待信號穩定后，注入PBS沖洗掉多余的抗原。再注入甘氨酸(0.01 mol/L,pH=2)，使抗原從抗體上解離。最后注入PBS沖洗，信號回到基線。同樣地，用PBS配制不同濃度的hs-CRP和SAA1，將它們分別注入RGO表面固定有對應抗體的傳感芯片中，用計算機上的數據采集軟件記錄整個過程中的信號變化，其中每個濃度重復檢測3次。

2 結果與討論

2.1 檢測原理

圖2為RGO表面抗原抗體特異性結合的示意圖。如圖2A所示，首先要對RGO表面進行活化，這有利于后續抗體的固定。圖2B為抗體通過氨基和羧基的共價結合固定在RGO表面。圖2C為當抗原注入微流通道時，抗原和RGO表面的抗體發生特異性結合的示意圖。這種特異性結合會引起RGO表面折射率的變化，導致平衡探測器檢測到的p偏振光和s偏振光的光強差發生變化，從而實現對抗原的定量檢測。

圖2 (A)石英片上RGO的示意圖；(B)RGO表面固定有抗體的示意圖；(C)RGO表面抗原抗體結合的示意圖Fig.2 (A)Schematic diagram of RGO on a quartz plate;(B)Schematic diagram of the antibody immobilized on the surface of RGO;(C)Schematic diagram of the binding of antigen and antibody on the RGO surface

圖3 (A)GO和RGO的拉曼光譜；(B～E)分別為RGO的EDS元素分析結果、EDS圖、AFM圖和SEM圖Fig.3 (A)Raman spectra of GO and RGO;(B)EDS elemental analysis results,(C)EDS image,(D)AFM image and (E)SEM image of RGO

2.2 RGO的表征分析

實驗中用到的RGO是通過高溫還原GO的方法制備的。圖3A為GO和RGO的拉曼光譜圖。圖中RGO樣品ID/IG(拉曼光譜圖中D峰強度與G峰強度的比值)比GO大，證明高溫還原過程中形成了品質較高的石墨烯[16,17]。圖3B和圖3C為RGO樣品的能譜儀(EDS)元素分析結果。其中Si元素和O元素來源于SiO2基底，C元素來源于RGO。從EDS的結果可以看出，RGO的制備過程沒有雜質引入。此外，圖3D為RGO的原子力顯微鏡(AFM)圖，可以看出實驗中用到的RGO厚度在8 nm左右，其厚度可以通過改變GO溶液的濃度和旋涂儀的轉速來調節。圖3E為RGO樣品的掃描電子顯微鏡(SEM)圖。從圖中可以看出，RGO表面除了些許碎片外，整個樣品十分平整，形成了均勻的薄膜。

2.3 傳感系統的靈敏度和折射率分辨率

運用多層介質膜傳輸理論可以定量計算RGO對光的反射、吸收和透射。圖4A為不同厚度的RGO對偏振光的反射率差值隨入射角度的變化關系。從圖4A可以看出，當RGO厚度為8 nm，入射角度為全反射角時，RGO對s偏振光和p偏振光的反射率差值ΔR最大，對折射率變化最為敏感。如圖4B所示，不同濃度的NaCl具有不同的折射率，會引起該傳感系統信號的變化。根據相關公式[12]，計算出該傳感系統的靈敏度和折射率分辨率分別為2.14×107mV/RIU和4.67×10-9。

圖4C和圖4D分別是該傳感系統的靈敏度和折射率分辨率隨RGO表面介質折射率變化的曲線，可以看出，介質的折射率在1.33～1.40范圍內，靈敏度和折射率分辨率都會隨介質折射率的降低而大幅增加，即表面介質的折射率越接近1.33(純水的折射率)，靈敏度和折射率分辨率越高，這為檢測超低濃度的生物分子以及疾病標志物提供了理論支持。

圖4 (A)理論模擬不同厚度RGO對偏振光反射率的差值隨入射角度的變化關系；(B)不同濃度NaCl注入時傳感系統的響應，插圖顯示了該傳感系統的噪聲幅值；(C)傳感系統的靈敏度和(D)折射率分辨率隨RGO表面介質折射率(n)的變化關系Fig.4 (A)Theoretical simulation of the relationship between the difference in the reflectivity of polarized light of RGO with different thicknesses and the angle of incidence;(B)Response of the sensing system with different concentrations of NaCl.The illustration shows the noise amplitude of the sensing system;(C)Relationship between the sensitivity and (D)refractive index resolution of the sensing system and the refractive index of the RGO surface medium

2.4 兔IgG的定量檢測

該傳感系統首先被用于兔IgG的檢測。圖5A為固定抗體的過程中傳感信號隨時間的變化關系，把PBS的信號作為基線，注入EDC/NHS后，由于微流通道內RGO表面的折射率發生變化，信號也隨之發生變化。30 min后注入PBS，信號回落但沒有回到初始基線，說明RGO表面活化完成。再注入250 μg/mL的山羊抗兔IgG溶液，待穩定后注入PBS沖洗，信號下降但并沒有回到基線，證明山羊抗兔IgG已經成功固定在RGO表面。之后，把PBS的信號作為新的基線，注入25 μg/mL的兔IgG溶液，微流通道內的兔IgG會被RGO上固定的山羊抗兔IgG特異性捕獲，導致信號增大，待信號穩定后再注入PBS沖洗掉未結合的兔IgG，整個過程如圖5B所示。該傳感系統對不同濃度兔IgG的檢測結果如圖5C所示，在0.025～25 μg/mL濃度范圍內檢測結果具有很好的線性，校準曲線為y=0.969x+0.369，檢測的最低濃度為0.025 μg/mL。通過測量20個空白樣品的信號，計算得到該傳感系統對兔IgG的檢測限為0.014 μg/mL。

圖5 (A)抗體的固定過程；(B)兔IgG的實時檢測結果圖；(C)不同濃度兔IgG的檢測結果Fig.5 (A)Antibody fixing process;(B)Real-time detection results of rabbit IgG;(C)Detection results of different concentrations of rabbit IgG

2.5 心血管疾病標志物的定量檢測及準確性考察

為了評估該傳感系統對于心血管疾病標志物的檢測性能，選用hs-CRP和SAA1作為檢測指標進行了實驗。圖6A、圖6C分別為該傳感系統對不同濃度hs-CRP及SAAI的檢測結果。從圖中可以看出該傳感系統信號與hs-CRP及SAAI的濃度線性范圍均為0.1～25 μg/mL范圍內均呈現出很好的線性，hs-CRP 校準曲線為y=0.888x+0.305，檢測限為0.020 μg/mL；SAAI校準曲線為y=0.809x+0.439，檢測限為0.023 μg/mL。兩者的檢測限均遠低于臨床檢測標準10 μg/mL。此外，該傳感系統對生物分子檢測的特異性也得到了驗證。用固定有hs-CRP和SAA1抗體的傳感芯片分別檢測濃度為20 μg/mL的hs-CRP，兔IgG，牛IgM和SAA1，實驗結果如圖6B和圖6D所示，hs-CRP和SAA1信號較強，其他生物分子的信號較弱，表明該傳感系統能夠實現對生物分子的特異性檢測。

為了驗證本研究中傳感系統的準確性和可靠性，我們用該傳感系統與商用酶標儀分別測定相同濃度的hs-CRP和SAA1，并將結果進行對比。配制不同濃度的hs-CRP標準樣品(16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL)和SAA1標準樣品(24 μg/mL、12 μg/mL、6 μg/mL、3 μg/mL、1.5 μg/mL、0.75 μg/mL)，將傳感系統測定的電壓值與商用酶標儀測得的吸光度值進行擬合，結果如圖6E和圖6F所示，兩種儀器的測定結果呈現良好的線性相關性，證明基于石墨烯偏振吸收性質的光學傳感系統可以準確檢測hs-CRP和SAA1的濃度。

圖6 (A)不同濃度hs-CRP的檢測結果；(B)傳感系統對hs-CRP的特異檢測；(C)不同濃度SAA1的檢測結果；(D)傳感系統對SAA1的特異檢測；(E)傳感系統和商用酶標儀對hs-CRP檢測結果的相關性；(F)傳感系統和商用酶標儀對SAA1檢測結果的相關性Fig.6 (A)Detection results of different concentrations of hs-CRP;(B)Specific detection of hs-CRP by the sensor system;(C)Detection results of different concentrations of SAA1;(D)Specific detection of SAA1 by the sensor system;(E)Correlation between the detection results of hs-CRP by the sensing system and the commercial microplate reader;(F)Correlation between the detection results of the SAA1 by the sensing system and the commercial microplate reader

3 結論

本文利用石墨烯在全反射條件下對不同偏振光吸收的不同，發展了一種基于石墨烯偏振吸收性質的新型光學傳感技術。引入鎖相放大系統，消除了環境光和震動等外界因素的干擾。通過在石墨烯表面修飾抗體，檢測抗原抗體特異性結合時引起的折射率變化，該傳感系統實現了對心血管疾病標志物hs-CRP和SAA的高靈敏度定量檢測?；谑┢裎招再|的光學傳感技術具有免標記、高靈敏度和微體積檢測的優點，對心血管疾病的早期診斷及風險評估具有重要意義。